CN105936896A - 细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备及其应用。本发明的细菌烯酰还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码细菌烯酰还原酶的核酸的碱基序列如SEQ ID No.1所示，以细菌烯酰还原酶为抗原，免疫动物制备抗血清，抗血清经过纯化后得到细菌烯酰还原酶的多克隆抗体，采用蛋白质印记的检测方法，利用细菌烯酰还原酶的多克隆抗体，证明了细菌Shewanella sp.Ac10内烯酰还原酶的表达，本发明制备的多克隆抗体的方法简单，免疫原性强。

Description

细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种细菌烯酰还原酶多克隆抗体的制备方法。

背景技术

细菌Shewanella sp.Ac10是由海水中筛选到的一株低温菌，该菌能够在低温下很好的生长，并在低温诱导条件下生产二十碳五烯酸。二十碳五烯酸作为细胞膜磷脂酰基侧链而存在于细胞中，具有抗氧化、抗衰老、预防心脑血管疾病的作用。同时，也可大大降低患肿瘤的风险。二十碳五烯酸的这些有益作用表明其具有极高的应用价值。二十碳五烯酸是人类保持健康所必须的不饱和脂肪酸，但仅存于植物和海洋生物中，人与动物不能合成。因此利用生物合成法是生产二十碳五烯酸的一个替代途径。

二十碳五烯酸的合成过程中必须要有烯酰还原酶的参与，在碳链延伸的过程中催化反式烯酰ACP生成酰基ACP。近年来植物中该酶参与合成二十碳五烯酸的路径已经阐释清楚，而细菌中合成二十碳五烯酸的机制仍然未知，因此研究细菌中烯酰还原酶在二十碳五烯酸合成中的作用显得非常重要，但是该酶在野生型Shewanella sp.Ac10菌株内表达量不高，无法通过直接提取烯酰还原酶来证明该酶的表达，而且目前还没有相关报道证明野生型Shewanella sp.Ac10内烯酰还原酶的表达。

发明内容

本发明的目的就是针对以上技术的不足，提供一种用于证明野生型Shewanella sp.Ac10烯酰还原酶表达的多克隆抗体的制备方法。

本发明的第一目的是提供一种细菌烯酰还原酶，所述细菌烯酰还原酶的氨基酸如SEQ ID No.2所示的多肽；

本发明的第二目的是以细菌烯酰还原酶作为抗原制备多克隆抗体；

本发明的第三目的是细菌烯酰还原酶的多克隆抗体应用于细菌Shewanella sp.Ac10内烯酰还原酶表达的检测。

为实现上述第一目的，本发明采用的技术方案是：

1)通过PCR技术扩增如SEQ ID No.1所示的核酸片段；

2)将核酸片段克隆入pET21a(+)载体质粒中，得到重组质粒pET21a-Enrd；

3)将重组质粒pET21a-Enrd转化入大肠杆菌得到重组大肠杆菌BL21(DE3)，进行培养与诱导，裂解，纯化，得到氨基酸序列如SEQID No.2所示的细菌烯酰还原酶。

所述培养与诱导过程为，将重组的大肠杆菌接种入含有50μg/ml氨苄的LB液体培养基，37℃培养3～4h，待培养菌液的OD₆₀₀达到0.5～0.7，将培养温度调为28℃，并且加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，待诱导菌液OD₆₀₀为1.8～2.2，离心，收集菌体。

所述裂解过程为，用Tris-HCl溶液(20mM，pH 7.8～8.2)悬浮菌体，利用超声破碎10～20min。

所述纯化过程为，将裂解后的菌液离心，收集上清液，将上清液注入Ni-NTA亲和层析色谱柱，然后用咪唑缓冲液进行阶段洗脱蛋白，最后将洗脱蛋白透析、浓缩处理得到细菌烯酰还原酶。

为实现上述第二目的，本发明采用的技术方案是：

1)以氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的细菌烯酰还原酶为抗原，免疫动物制备抗血清；

2)纯化抗血清得到细菌烯酰还原酶的多克隆抗体；

3)对该多克隆抗体进行浓度与效价的测定。

为实现上述第三目的，本发明采用的技术方案是：

利用蛋白质印迹法(Western Blotting)检测细菌Shewanellasp.Ac10内烯酰还原酶的表达，具体实验方法为：

1)将细菌Shewanella sp.Ac10接种至LB液体培养基中培养至OD为1.8～2.2，取1～2ml离心收集菌体，超声破碎，离心、分别收集上清与沉淀样品；将上清与沉淀样品加入到聚丙烯酰氨凝胶的上样孔中。

2)上样后，启动电泳仪，直到电泳结束，电泳结束后，将凝胶上的蛋白样品通过电转处理转移至PVDF膜，电转结束后将PVDF膜干燥处理，然后在封闭液(5％脱脂奶粉)中封闭处理1h，封闭处理后用PBST清洗PVDF膜干净；然后用得到的多克隆抗体孵育1h后用PBST清洗干净，最后用二抗(羊抗兔-HRP)孵育1h后用PBST清洗干净；

3)将清洗完毕后的PVDF膜ECL显影，暗室成像。

本发明中的大肠杆菌BL21(DE3)，载体质粒pET21a(+)，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，Ni-NTA亲和层析色谱柱均可通过公开市售的商业渠道取得。

本发明的有益效果：

1)制备细菌烯酰还原酶多克隆抗体可以对野生型Shewanella sp.Ac10内该酶的表达提供验证基础。

2)该多克隆抗体对烯酰还原酶的缺陷性的确认提供验证基础，还可以对外源启动子修饰的工程菌进行验证。

附图说明

图1为双酶切载体pET21a(+)的核酸电泳图；其中ladder为DNA分子量标准；pET21a(+)为pET21a(+)质粒经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切后的核酸分子；

图2为双酶切PCR产物的核酸电泳图；其中ladder为DNA分子量标准；PCR product为经PCR扩增的产物经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切后的核酸分子；

图3为重组质粒pET21a-Enrd示意图；

图4为蛋白纯化SDS-PAGE分析图；其中M为蛋白质分子量标准；1～14为细菌烯酰还原酶经过纯化处理后得到的洗脱蛋白的条带；

图5为目的蛋白SDS-PAGE电泳图谱；其中M为蛋白质分子量标准；1为将图4中12号洗脱液SDS-PAGE电泳后，将蓝色条带切下放入透析袋经过核酸电泳槽电泳，取透析袋中的溶液进行SDS-PAGE电泳确认纯度；

图6为细菌烯酰还原酶多克隆抗体的Western Blotting分析图；其中，Magic为用于蛋白质印记的蛋白质分子量标准；S为细菌Shewanella sp.Ac10超声破碎离心后的上清液；P为细菌Shewanellasp.Ac10超声破碎离心后的沉淀。

具体实施方式

实施例1

细菌烯酰还原酶的制备：

1)烯酰还原酶基因的碱基序列的确定

在GenBank中输入NCBI Reference Sequence:NC_008345.1，得到Shewanella frigidimarina NCIMB 400的全基因序列，其中找到enoyl reductase基因，经过密码子优化后得到如SEQ ID No.1所示的碱基序列。

2)重组质粒的构建

根据pET21a(+)的多克隆位点和细菌烯酰还原酶基因的碱基序列设计引物：

上游引物:5’-CTAGCTAGCATGACAACTCAAGTGCATAAC-3’(SEQID No.3)

下游引物:5’-GGAATTCGCTTTTACTTGGTCAATTGG-3’(SEQ IDNo.4)

扩增以Shewanella sp.Ac10基因组为模板，扩增反应体系如下：10×PCR反应缓冲液5μl，25mmol/L MgSO₄ 2μl,10mmol dNTP 5μl，10nmol/L引物各1μl，基因组DNA模板80ng，KoD-Plus DNA聚合酶1μl，双蒸去离子水定容至50μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸2min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，克隆测序，测序由ABI3100测序仪完成。

上述PCR产物回收后经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切，与经相同限制内切酶消化的商业化载体pET21a(+)进行琼脂糖凝胶电泳、切胶回收，如图1与图2所示：ladder为marker,pET21a(+)为载体pET21a(+)经NdeI和EcoRI双酶切的产物，PCR product为上述PCR产物经NdeI和EcoRI双酶切。双酶切后的pET21a(+)与PCR产物再经高效DNA连接酶High Ligation(TOYOBO)催化连接，构建出重组质粒pET21a-Enrd，如图3所示为重组质粒pET21a-Enrd示意图。

3)重组大肠杆菌的筛选，培养，诱导，裂解：

筛选：经测序无突变的重组质粒pET21a-Enrd转化大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主，利用含有50μg/ml氨苄的LB固体培养基筛选重组大肠杆菌。培养：将筛选的重组大肠杆菌置于1000ml含有终浓度为50μg/ml的Amp LB培养基中，37℃培养4小时，待OD₆₀₀达到0.6时，进行诱导培养。诱导培养：转入28℃的培养摇床并向菌液中添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养至OD₆₀₀为2.0，4℃离心收集菌体。裂解：用Tris-HCl溶液(20mM，pH 8.0)100ml悬浮菌体，利用超声破碎15min，4℃离心1小时，收集上清液。

4)纯化上清液得到纯化的烯酰还原酶蛋白

利用蛋白纯化系统-Biologic(BIORAD)，将上清夜泵入Ni-NTA亲和层析色谱柱，然后用10～400mM咪唑缓冲液进行阶段洗脱蛋白，收集各阶段的洗脱蛋白(如图4所示)。为了确定蛋白的单一性，将图4中的12号洗脱蛋白蓝色的条带切下，放入透析袋中利用核酸电泳槽电泳，电泳完毕后取出透析袋中的溶液再进行SDS-PAGE电泳，检查12号蛋白是否是单一蛋白。如图5所示，其中1为12号洗脱蛋白样品，M为蛋白质分子量标准，图中可以看出在44.3与66.4KDa之间有单一蛋白条带，说明12号洗脱蛋白的单一性好。将12号洗脱蛋白置于透析袋，用20mM Tris-HCl(pH8.0)于4℃条件过夜透析。透析后的蛋白利用离心浓缩管(Amicon)浓缩得到烯酰还原酶，并利用10％SDS-PAGE检测分析纯化浓缩后的烯酰还原酶。

实施例2

细菌烯酰还原酶多克隆抗体的制备：

以实施例1得到的烯酰还原酶为抗原，免疫家兔制备抗血清；

免疫家兔具体过程如下：免疫前采集500μl家兔血液，作为对照血清。将实施例1得到的纯化浓缩后的烯酰还原酶作为抗原，采用皮下注射免疫2kg的白兔(Slc:NZW)，每次注射500μg抗原，2周免疫一次，共免疫4次，采血检测，通过ELISA方法确定抗体针对抗原的效价，效价大于1:50000进行最终采血制备抗血清然后纯化抗血清制备多克隆抗体，并检测多克隆抗体的浓度。

1)多克隆抗体浓度的测定，采用BAS标准曲线法测定，具体方法为：

1.1，CBB染色液配制：根据样品数量，将5×CBB染色液稀释，充分混匀。

1.2，根据需要取适量BSA标准蛋白，配制终浓度分别为1mg/ml、0.75mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml和0.125mg/ml标准样，并混匀。标准样采用PBS为溶剂。

1.3，取一块酶标板，按表1加入试剂：

表1酶标板加入的试剂

孔号	A	B	C	D	E	F
							标准样浓度(mg/ml)	0	0.125	0.25	0.5	0.75	1
各浓度标准样(μl)	1	1	1	1	1	1
							去离子水	9	9	9	9	9	9
CBB染色液	200	200	200	200	200	200
							对应蛋白含量(μg)	0	0.125	0.25	0.5	0.75	1
最终体积(μl)	210	210	210	210	210	210

1.4，振荡混匀后，室温下静置30min。

1.5，用酶标仪测定562nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收为空白对照，以蛋白含量(μg)为横坐标，吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。

1.6，将纯化后的多克隆抗体用PBS缓冲液过夜透析，稀释抗体，加入CBB染色液，利用酶标仪测定562nm处的吸光值；

1.7，根据测得的吸收值，在BSA标准曲线上计算抗体的浓度，，得出多克隆抗体的浓度为：1.2mg/ml。

2)多克隆抗体效价的测定，采用ELISA方法测定，具体方法为：

2.1，将抗原用碳酸钠缓冲液(pH 9.6)稀释到10μg/ml，将抗原置于酶标96孔板，每孔100μl孵育1h。

2.2，用PBS-T将酶标96孔板清洗3次。

2.3，用5％skim milk封闭酶标板1小时，每孔100μl。

2.4，用PBS-T将酶标板清洗3次。

2.5，稀释的血清，用PBS-T稀释血清5000倍，孵育抗原1h。

2.6，用PBS-T将酶标板清洗3次。

2.7，每孔加入100μl HRP标记的羊抗兔抗体，用PBS-T稀释羊抗兔抗体5000倍，孵育1h。

2.8，利用PBS-T将酶标板清洗3次。

2.9，清洗完毕后每孔加入100μl显色液ABST，反应20min后每孔加入50μl过氧化氢；

3.0，最后分光光度计上测420nm上述步骤2.9中样品的OD值，得出效价为1：16，大于1:50000然后进行最终采血制备抗血清。

3)纯化血清的过程是：将抗原蛋白-烯酰还原酶与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将所得抗血清与PBS缓冲液按照1:1的体积比例混合后，缓慢经过抗体纯化层析柱，待抗体与抗原结合后用甘氨酸溶液洗脱缓冲液进行洗脱，获得纯化的烯酰还原酶多克隆抗体，纯化的烯酰还原酶多克隆抗体利用PBS缓冲液过夜透析，次日进行浓度和效价测定。

实施例3

细菌烯酰还原酶的多克隆抗体应用于细菌Shewanella sp.Ac10内烯酰还原酶表达的检测：

采用Western Blotting抗体特异性测定方法包括以下步骤：

(1)将细菌Shewanella sp.Ac10接种至LB液体培养基中培养至OD为1.8～2.2，取1～2ml离心收集菌体，300μl Tris-HCl(20mM，pH 8.0)重悬，超声破碎，15000rpm离心、分别收集上清与沉淀；上清液取20μl与5μl 5×SDS上样缓冲液混合，取10μl进行SDS-PAGE电泳；沉淀用30μl 1×SDS上样缓冲液悬浮，取3μl进行SDS-PAGE电泳；蛋白质分子量标准上样量为0.8μl；

(2)上样后，电泳仪恒定为18mA，直到电泳结束；电泳结束后，将凝胶上的蛋白样品通过电转处理转移至PVDF膜，设定电转电流为0.23A，电转时间为35min；

(3)电转结束后将PVDF膜干燥处理，然后在5％脱脂奶粉封闭液中封闭处理1h；

(4)封闭处理后用PBST清洗PVDF膜5次；

(5)用封闭液5000稀释纯化的抗体,用稀释后的抗体孵育1h后用PBST清洗5次；

(6)清洗完毕后用封闭液1:20000稀释二抗(羊抗兔-HRP)，用稀释后的二抗孵育1h后用PBST清洗5次；

(7)将清洗完毕后的PVDF膜ECL显影，暗室成像，成像结果如图6所示：Magic为用于蛋白质印记的蛋白质分子量标准；S为细菌Shewanella sp.Ac10超声破碎离心后的上清液；P为细菌Shewanella sp.Ac10超声破碎离心后的沉淀。其中细菌Shewanella sp.Ac10超声破碎离心后的沉淀作为阴性对照，其中上清液经过WesternBlotting后在50KDa与60KDa之间有条带显现，说明该抗体可以免疫反应烯酰还原酶。

Claims (10)

1.一种细菌烯酰还原酶，其特征在于，所述细菌烯酰还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的细菌烯酰还原酶的核酸，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种如权利要求1所述的细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的细菌烯酰还原酶为抗原，免疫动物制备抗血清；

2)纯化抗血清得到细菌烯酰还原酶的多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述烯酰还原酶的制备方法为：

1)利用PCR技术扩增SEQ ID No.1所示的核酸片段；

2)将核酸片段克隆入载体质粒中，得到重组质粒；

3)将重组质粒转化入大肠杆菌得到重组大肠杆菌，经过培养与诱导、裂解、纯化，得到氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的细菌烯酰还原酶。

5.根据权利要求4所述的细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述载体质粒为pET21a(+)。

6.根据权利要求4所述的细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述PCR技术扩增中所用的引物为：上游引物如SEQ ID No.3所示；下游引物如SEQ ID No.4所示。

7.根据权利要求4所述的细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述培养与诱导过程为，将重组的大肠杆菌接种入含有50μg/ml氨苄的LB液体培养基，37℃培养3～4h，待培养菌液的OD₆₀₀达到0.5～0.7，将培养温度调为28℃，并且加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，待诱导菌液OD₆₀₀为1.8～2.2，离心，收集菌体。

8.根据权利要求4所述的细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述纯化的过程为：将裂解后的菌液离心，收集上清液，将上清液注入Ni-NTA亲和层析色谱柱，然后用咪唑缓冲液进行阶段洗脱蛋白，最后将洗脱蛋白透析、浓缩处理得到细菌烯酰还原酶。

9.一种细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的应用，其特征在于，所述细菌烯酰还原酶的多克隆抗体在检测细菌Shewanella sp.Ac10内烯酰还原酶的表达的应用。

10.根据权利要求9所述的细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的应用，其特征在于，所述检测方法为蛋白质印迹法。