CN103060333B - 凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT及其编码蛋白和应用。所述的凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的金属硫蛋白LvMT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次从凡纳滨对虾中克隆出金属硫蛋白基因LvMT，并通过实验证明该基因具有抗重金属的功能。因此本发明对提高宿主细胞的耐受重金属能力、同时克服它们自身对重金属耐受力低的缺点提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

Description

凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT及其编码蛋白和应用。

背景技术

金属硫蛋白(metallothionein，MT)的化学名称为金属硫组氨酸三甲基内盐，是一类普遍存在于生物体内的低分子量(6-7kDa)、富含半胱氨酸、热稳定性、可诱导型非酶蛋白。1957年，Margoshes和Vallee首先在马肾细胞中发现MT；1977年，Casterline和Barnett在大豆根中发现了植物中的第一个MT，随后陆续又在糠穗草、番茄等植物中发现了植物金属硫蛋白，现已在多种真核和原核生物中发现了MT基因和蛋白。金属硫蛋白富含Cys，能够大量结合二价重金属离子，具有很强的金属结合能力和氧化还原能力，在生物体内主要参与微量元素储存、运输和代谢，重金属解毒，拮抗电离辐射，清除自由基，以及机体生长、发育、生殖、衰老、肿瘤发生、免疫、应激反应等生理生化反应。其研究和开发利用涉及农业、医药、生物工程、环境保护等各个领域，具有重要的应用价值，金属硫蛋白也因此成为生命科学研究的热点之一。与此同时，许多海洋生物体内都含有MTs或类金属硫蛋白(MTLPs)，至今已发现，1979年，首次报道了美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的MT，此后又陆续60多种无脊椎动物中存在着MTs。目前为止，在大多数主要无脊椎动物中都发现了MTs，不同物种间的MT存在显著的差异，表现多种生理生态功能。

凡纳滨对虾又称南北白对虾，由于其具有繁殖期长；广盐性；广温性；可以密养产量高；抗病力较强；耐干性较强；肉质鲜美；个体较大等优点目前已经成为全球第一大养殖对虾，并且也是我国对虾养殖的主导品种。使凡纳滨对虾一跃成为养殖最多的品种。近年来养殖产量有很大提高，从2001年以来，我国养殖凡纳滨对虾面积和产量一直居于对虾养殖的首位。2009年凡纳滨对虾养殖产量约110万吨，占对虾总产量的87%，其中我省养殖产量超过四十万吨，所占比例接近40%。凡纳滨对虾的生长受环境的影响非常明显，比如温度、含氧量以及重金属等因素。为了减少生态环境中重金属对于凡纳滨对虾的影响，金属硫蛋白作为重金属筛查的一种特殊生物标记也有较多研究。然而凡纳滨对虾的MT基因筛选报道较少，且MT基因的鉴定和功能分析至今未有报道。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT及其编码蛋白。

本发明的凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的凡纳滨对虾金属硫蛋白LvMT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。

本发明的第二个目的是提供一种含有凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT的重组表达载体。

所述的表达载体优选为原核表达载体pET-32a。

本发明的第三个目的是提供一种转化有含有凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT的重组表达载体的宿主细胞。

所述的宿主细胞优选为大肠杆菌BL21。

本发明的第四个目的是提供凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT在抗重金属方面的应用。

本发明根据抑制缩减杂交文库中的凡纳滨对虾MT基因的EST全长基因序列，设计了特异性引物，再提取凡纳滨对虾腮组织的RNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，采用上述特异性引物进行PCR扩增出LvMT基因片段，采用琼脂糖凝胶电泳回收片段，连接于pMD18-T载体上，获得重组载体pMD18-LvMT，测序分析，该序列包含一个开放阅读框，为177个碱基，其序列如SEQ ID NO.1所示，将此基因命名为LvMT，其编码蛋白具有58个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为LvMT，再将LvMT基因片段连接到原核表达载体pET-32a中，再用化学法将含有LvMT基因的原核表达载体pET-32a转入大肠杆菌中，筛选阳性菌株扩大培养后利用IPTG诱导表达金属硫蛋白，将诱导表达后的阳性菌株涂布含不同重金属浓度的LB固体培养基平板，37℃培养，平板上的菌落数目明显多于没有转入LvMT基因的大肠杆菌。

将LvMT基因编码的蛋白质在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中采用Blastx程序进行序列比对之后，发现该蛋白和Dromia personata的金属硫蛋白序列有72%的同源性（如图1所示），说明LvMT基因所编码的蛋白具有金属硫蛋白的结构特征。经Blastx比对，LvMT基因所编码的蛋白序列不与任何先前已公布的蛋白序列完全一致，说明其是一个新发现的蛋白序列。

本发明首次从凡纳滨对虾中克隆出凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT，并通过实验证明该基因具有抗重金属的功能。因此本发明对提高宿主细胞的耐受重金属能力、同时克服它们自身对重金属耐受力低的缺点提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

附图说明

图1是LvMT基因编码的蛋白的Blastx对比结果图；

图2是凡纳滨对虾腮组织RNA电泳图，其中M为DL2000的Marker，1-4为RNA；

图3是cDNA转录的电泳图，其中M为DL2000的Marker，1为cNDA；

图4是LvMT基因扩增电泳图，其中M为DL2000的Marker，1为LvMT基因；

图5是LvMT基因纯化后的电泳图，其中M为DL2000的Marker，1为LvMT基因；

图6是重组载体pMD18-LvMT转化大肠杆菌后的菌落PCR检测电泳图，其中M为DL2000的Marker，1、4、5、6为阳性菌落PCR扩增产物，2、3为阴性菌落PCR扩增产物（转入了空载体）；

图7是双酶切检测原核重组载体pET-32a-LvMT的电泳图，其中，M为λ-HindIII digestDNAMarker，1为被双酶切的原核重组表达载体pET-32a-LvMT；

图8是原核重组表达载体pET-32a-LvMT菌落PCR检测电泳图，其中M为DL2000的Marker，1-6为菌落PCR扩增产物；

图9是原核重组表达载体pET-32a-LvMT诱导表达的SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白Marker，2为未经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a，3为经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a，4为未经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvMT，5为经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvMT；

图10是重金属氯化镉耐受力检测图，图中的pET32a-LvMT代表转化有原核重组表达载体pET-32a-LvMT的大肠杆菌BL21，pET32a代表转化有空原核表达载体pET-32a的大肠杆菌BL21。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中所涉及的材料及来源如下：

大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21感受态细胞、pMD18-T载体、原核表达载体pET-32a、大肠杆菌BL21均购自天根生化科技有限公司。

实施例1：凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT的克隆及测序

1、引物的设计

在已构建的凡纳滨对虾淡水胁迫文库中筛选出凡纳滨对虾金属硫蛋白基因全长EST，根据EST设计上游引物（5’-ACGGGATCCGCCACCATGCCTGATCCATGCTGT-3’）（下划线表示酶切位点BamHI）和下游引物（5’-AGCAAGCTTCTGGGCAGCACTT-3’）（下划线表示酶切位点HindIII），引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

2、RNA的提取

以凡纳滨对虾腮组织为材料，使用Trizol法提取总RNA，具体操作如下：

用液氮将0.1g凡纳滨对虾腮组织研磨成粉末以后，加入1mL Trizol提取液（购自invitrogen公司，货号为15596-026），室温放置5min，使其充分裂解，再加入氯仿，振荡混匀15分钟，室温放置15min，4℃12000g离心15min，再加入0.5mL异丙醇混匀，室温放置5-10min，4℃12000g离心10min，再加入1mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃8000g离心5min，室温晾干，再加入50μl DEPC处理水待溶解充分后测O.D值定量RNA浓度。RNA电泳结果如图2所示。

3、cDNA的合成

以提取的凡纳滨对虾腮组织的RNA为模板，用

III反转录酶合成cDNA，具体步骤为：RNA2μl（约5μg）、Oligo(d T)₂₀1μl、10mM dNTP1μl，DEPC处理水补足总体积至13μl；65℃处理5min后，转至冰上10min；再加入5×第一链缓冲液4μl、0.1MDTT1μl、RNA酶抑制剂1μl，1μl反转录酶（购自invitrogen公司，货号为18080-051），25℃反应5min，然后50℃反应60min；70℃处理15min使反转录酶失活，得到cDNA序列。cDNA电泳结果如图3所示。

4、扩增基因LvMT的cDNA序列并克隆、测序

以cDNA为模板，使用上述上游引物和下游引物进行PCR扩增基因LvMT。PCR扩增反应体系共20μl：（10×）Ex-Taq缓冲液2.5μl、Ex-Taq0.2μl、cDNA模板1μl、10mM dNTP0.4μl、10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl，使用ddH₂O补足至20μl。反应条件为：94℃2min，30个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃有延伸30s，72℃反应10min。将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。

使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司，货号为DP209）对琼脂糖凝胶电泳中的目的条带进行回收，具体操作步骤参照产品说明书。取3μl用于琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示，由此得到基因LvMTcDNA。

采用pMD18-T vector kit（购自宝生物工程（大连）有限公司，货号为D101A）对基因LvMT进行TA克隆，具体步骤为：向1.5mL离心管中分别加入基因LvMTcDNA 2.5μl、pMD 18-T载体1μl（50ng/μl）、Ligation SolutionⅠ3.5μl，用封口膜封好，置于金属浴中16℃过夜连接获得连接产物。

使用热激法将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自天根生化科技有限公司，货号为CB101），具体步骤为：将7μl上述连接产物加入到100μl大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，混合，再将混合液冰浴20min，42℃热刺激45s，再冰浴2min，加入900μl SOC液体培养基，37℃、150rpm摇床培养60min；在超净台上吸取300μl菌液于含有Amp、IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀，37℃过夜培养。

在上述过夜培养的LB固体培养基平板上挑取白色菌落，接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，用上述上游引物和下游引物进行菌落PCR检测重组情况，PCR扩增体系和条件与之前扩增LvMT基因相同。使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果图6所示，由此得到含有重组载体pMD18-LvMT的阳性克隆，该阳性克隆是将pMD18-T载体与基因LvMT相连接。

对重组载体pMD18-LvMT进行测序，经分析表明，该序列包含一个开放阅读框，为177个碱基，其序列如SEQ ID NO.1所示，将此基因命名为LvMT，其编码蛋白具有58个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为LvMT。

将LvMT基因编码的蛋白质在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中采用Blastx程序进行序列比对之后，发现该蛋白和Dromiapersonata的金属硫蛋白序列有72%的同源性（如图1所示），说明LvMT基因所编码的蛋白具有金属硫蛋白的结构特征。经Blastx比对，LvMT基因所编码的蛋白序列不与任何先前已公布的蛋白序列完全一致，说明其是一个新发现的蛋白序列。

实施例2：构建原核重组表达载体pET-32a-LvMT

使用BamHI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶对重组载体pMD18-LvMT和原核表达载体pET-32a（购自天根生化科技有限公司，货号为v1078）分别进行双酶切获得LvMT基因片段和线型的pET-32a双酶切片段，具体步骤为：向0.5mL离心管中分别加入重组载体pMD18-LvMT2μl（100ng/μl）、BamHI限制性内切酶0.5μl、HindIII限制性内切酶0.5μl、10×K buffer2μl，使用ddH₂O补足至20μl，37℃反应8h。使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收LvMT基因和原核表达载体pET-32a，将回收的片段进行连接，具体步骤为：LvMT基因片段3μl（约300ng）、原核表达载体pET-32a1μl（100ng/μl）、Ligation Solution I4μl，金属浴中16℃过夜连接，将原核表达载体pET-32a和LvMT基因连接，得到原核重组表达载体pET-32a-LvMT。

使用热激法将原核重组表达载体pET-32a-LvMT转化大肠杆菌BL21感受态细胞（购自天根生化科技有限公司，货号为CB105），具体步骤为：向100μl大肠杆菌BL21感受态细胞中加入6μl上述原核重组表达载体pET-32a-LvMT的连接液，混合液冰浴20min，42℃热刺激45s，再冰浴2min，加入900μlSOC液体培养基，37℃、150rpm摇床培养60min，然后在超净台上吸取300μl菌液转入带有Amp、IPTG和X-Gal的LB固体培养基平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀；37℃过夜培养。

挑取白斑接种于带有Amp抗性LB液体培养基中37℃、200rpm摇床培养12h，提取质粒，进行电泳检测。通过双酶切检测获得原核重组表达载体pET-32a-LvMT，具体方法为：向0.5mL离心管中分别加入质粒DNA2μl（50ng/μl）、BamHI0.5μl、HindIII0.5μl、10×K buffer2μl，使用ddH2O补足至20μl，37℃反应8h，使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7所示；同时利用上述上游引物和下游引物对菌液进行PCR扩增检测，结果如图8所示。

由此得到转有含有LvMT基因的原核表达载体pET-32a的大肠杆菌BL21，即得到含有原核重组表达载体pET-32a-LvMT的大肠杆菌BL21。

实施例3：原核重组表达载体pET-32a-LvMT的诱导表达

分别取500μl转化有原核重组表达载体pET-32a-LvMT的大肠杆菌BL21菌液和转化有空原核表达载体pET-32a的大肠杆菌BL21菌液置于30mL LB液体培养基中，37℃、180rpm摇床培养2h，培养结束后，分别取出1ml，测定菌液OD600值，OD600达到0.6，再分别取出2管（2ml/管）菌液，作为未经IPTG诱导的样品和未经IPTG诱导的阴性对照，再分别向剩余的两种菌液中加入终浓度为0.8mM的IPTG进行诱导，30℃、180rpm摇床培养2.5h，分别取出2管（2ml/管）菌液，作为经IPTG诱导的样品和经IPTG诱导的阴性对照。

未经IPTG诱导的样品、未经IPTG诱导的阴性对照、经IPTG诱导的样品、经IPTG诱导的阴性对照各取一管（2ml/管），用于总蛋白分析。具体步骤为：4℃、12000rpm离心2min，弃上清，再加入100μl细菌蛋白抽提缓冲液，再加入25μl5×蛋白上样缓冲液（LoadingBuffer），然后煮沸5min，-20℃保存。

对上述2种样品和2种阴性对照进行SDS-PAGE电泳检测分析。具体步骤为：制备分离胶、浓缩胶，2种样品和2种阴性对照各上样10μl，电泳后，取出分离胶，置于固定液中，摇床固定30min，弃固定液，加入染色液染色30min，弃染色液，加入脱色液，脱色60min；弃脱色液，加入ddH2O，摇床45rpm过夜，取出胶体，置于胶板上扫描，结果如图9所示。

由此可见，未经IPTG诱导的样品和经IPTG诱导的样品均诱导出LvMT蛋白，而未经IPTG诱导的阴性对照和经IPTG诱导的阴性对照则没有诱导出LvMT蛋白。

实施例4：重金属耐受性实验

分别将转化有原核重组表达载体pET-32a-LvMT的大肠杆菌BL21菌液和转化有空原核表达载体pET-32a的大肠杆菌BL21菌液涂布于含有0，40，80，120，160，200mM的氯化镉的LB固体培养基平板上，每一个浓度设有三个重复，37℃培养箱培养过夜，统计每个LB平板的菌体个数。实验结果显示：转化有原核重组表达载体pET-32a-LvMT的大肠杆菌BL21在40mM的氯化镉平板上菌个体数目开始明显多于转化有空原核表达载体pET-32a的大肠杆菌BL21的个体数目，在200mM的氯化镉浓度平板上转化有空原核表达载体pET-32a的大肠杆菌BL21几乎没有长出菌落，而转化有原核重组表达载体pET-32a-LvMT的大肠杆菌BL21在200mM氯化镉的LB固体培养基平板上的菌斑有三十多个（如图10所示）。

由此可见，转化有原核重组表达载体pET-32a-LvMT的大肠杆菌BL21对重金属具有的一定的抗性，从而证明了凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT具有典型的金属硫蛋白基因重金属离子耐受性的功能。

Claims (2)

1.一种凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种由权利要求1所述的凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT编码的凡纳滨对虾金属硫蛋白LvMT，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

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