CN111041012B - 凡纳滨对虾肌内质网Ca-ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

凡纳滨对虾肌内质网Ca-ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了凡纳滨对虾肌内质网Ca2+‑ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白与应用。本发明通过试验证明，转化有原核重组表达载体pET‑32a‑LvSERCA的大肠杆菌BL21对盐度具有的一定的耐受性，进一步证明了凡纳滨对虾肌内质网Ca2+‑ATP酶LvSERCA基因具有明显的盐度耐受功能，凡纳滨对虾肌内质网Ca2+‑ATP酶LvSERCA基因或其编码蛋白可作为筛选盐度抗性家系的分子标记，用于辅助育种选择。

Description

凡纳滨对虾肌内质网Ca-ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白与 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白与应用。
背景技术
肌内质网Ca2+-ATP酶(Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA)SERCA位于肌肉细胞的肌质膜网上。其功能主要是在肌肉的舒张时，消耗ATP水解的能量将胞浆中的钙离子运送到肌质膜的管腔中。SERCA在调控胞浆Ca2+浓度以及维持内质网官腔内的Ca2+浓度中起着关键的作用。在水生动物中，研究得较多的是SERCA，目前已经得到基因克隆的生物包括马氏珠母贝(Pinctada fucata)、紫色球海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)、青枪鱼(Makaira nigricans)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、乌鳢(Panulirus argus)以及凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)。
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是全球第一大养殖对虾，是我国对虾养殖的主导品种。因其繁殖期长；广盐性；广温性；可以密养产量高；抗病力较强；耐干性较强；肉质鲜美；个体较大等优点成为养殖最多的品种。近年来凡纳滨对虾已经成为全球第一大养殖对虾，并且也是我国对虾养殖的主导品种。2011年凡纳滨对虾养殖产量约124万吨，占对虾总产量的85％。2011年我国虾类产品的生产总量156万吨，虾类出口30万吨，出口值近21.9亿美元，成为水产品中出口值最高的产品。凡纳滨对虾是广盐性的水产养殖品种,这与该对虾体内存在复杂的离子调节机制有关。肌内质网Ca2+-ATP酶是一种细胞内膜结合酶，在凡纳滨对虾的盐度胁迫中表达，我们之前的研究集中在基因水平，分析了LvSERCA的时序表达，然而对于LvSERCA的基因表达和功能研究还未有报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白。
本发明的凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1的第115位-3123位碱基所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
本发明的第二个目的是提供一种含有凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因的重组表达载体。
优选，所述的重组表达载体的表达载体为pET-32a。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述重组表达载体的宿主细胞。
优选，所述的宿主细胞为大肠杆菌JM109。
本发明的第四个目的是提供上述的凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因编码蛋白或其编码基因作为筛选盐度抗性家系的分子标记在辅助育种中的应用。
所述的凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因编码蛋白或其编码基因在提高盐耐受性中的应用。
凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因编码蛋白或其编码基因在提高凡纳滨对虾或大肠杆菌的盐耐受性中的应用。
本发明通过试验证明，转化有原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌BL21对盐度具有的一定的耐受性，进一步证明了凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因具有明显的盐度耐受功能，凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因或其编码蛋白可作为筛选盐度抗性家系的分子标记，用于辅助育种选择。
附图说明
图1是提取的凡纳滨对虾总RNA，其中M为λ-HindⅢ，1为凡纳滨对虾总RNA。
图2是LvSERCA基因的扩增，其中M为λ-HindⅢ，1为LvSERCA基因。
图3是pET-32a酶切产物电泳，其中M为λ-HindⅢdigest，1为pET32a-BamHI/Sal I。
图4是重组载体pET-32a-LvSERCA转化大肠杆菌后的菌落PCR检测电泳图，其中M为DL2000的Marker，1、2为阳性菌落PCR扩增产物。
图5是原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA诱导表达的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白Marker，1为经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a全细胞，2为经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a上清，3为经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a全沉淀，4为经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA，5为经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA上清，6为经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA沉淀。
图6是盐度耐受检测图，图中的pET-32a-LvSERCA代表转化有原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌BL21，pET-32a代表转化有空原核表达载体pET-32a的大肠杆菌BL21。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所涉及的材料及来源如下：
大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌JM109感受态细胞、原核表达载体pET-32a、大肠杆菌BL21均购自天根生化科技有限公司。
实施例1：凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶基因LvSERCA的克隆及测序
1、引物的设计
以凡纳滨对虾腮组织的cDNA为模板，PCR扩增endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase LvSERCA基因CDS区3009bp(Gene Accession No.：JN986572)，(LvSERCA-F：5'-GGCTGATATCGGATCCATGGAGGACGGACACTGTTACGAGTTCG-3'，LvSERCA-R：5'-CCGCAAGCTTGTCGACTTACCATTTTTGCTCAATCTTGCCAGG-3')。测序引物(P1：5'-ATTTGCGGTCACGGGAGAAT-3'，P2：5'-TCGACACGGGAGAAGAGACG-3'，P3：5'-GCCAACATAGCCACCAATAG-3'，R1：5'-CAAGGGCAAGGCAAGTGGTGATGA-3'，T7：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')
2、RNA的提取
以凡纳滨对虾腮组织为材料，使用Trizol法提取总凡纳滨对虾的总RNA，具体操作如下：
在液氮冷冻下，将0.1g左右凡纳滨对虾腮组织研磨成粉末，加入1mL Trizol提取液(购自Invitrogen公司，货号为15596-026)，室温静置5min，使其充分裂解，再加入氯仿，充分混匀15分钟，于室温放置15min，4℃12000g离心15min，吸取上清，上清中加入0.5mL异丙醇混匀，室温放置5-10min，4℃12000g离心10min，再加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃8000g离心5min，再加入1mL75％乙醇清洗RNA沉淀一次，室温晾干，最后加入50μL DEPC处理水待溶解充分后测O.D值定量RNA浓度。RNA电泳结果如图1所示。
3、cDNA的合成
以提取的凡纳滨对虾腮组织的总RNA为模板，用
Figure BDA0002317954000000051
III反转录酶合成cDNA，具体步骤为：RNA 2μL(约5μg)、Oligo(dT)20 1μL、10mM dNTP 1μL，DEPC处理水补足总体积至13μL；65℃处理5min后，转至冰上10min；再加入5×第一链缓冲液4μL、0.1M DTT 1μL、RNA酶抑制剂1μL，1μL反转录酶(购自invitrogen公司，货号为18080-051)，25℃反应5min，然后50℃反应60min；70℃处理15min使反转录酶失活，得到cDNA序列。
4、LvSERCA基因的扩增
以凡纳滨对虾腮组织cDNA为模板，使用TaKaRa DNA Polymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增，PCR反应体系：cDNA 2μL，2×GC PCR Buffer(Mg2+,dNTP plus)25μL，TaKaRaPolymerase(1.25units/μL)1μL，LvSERCA-F(20μM)1μL，LvSERCA-R(20μM)1μL，ddH2O 20μL，合计50μL。反应条件：94℃1min，98℃10sec，60℃15sec，68℃2min，35cycles，PCR产物取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，见图2。
5、PCR产物纯化
使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)切胶回收纯化长度约3.0kbp的目的扩增产物条带。使用引物LvSERCA-F和LvSERCA-R对PCR产物进行测序验证，测序验证结果此PCR产物在NCBI中的生物信息学预测其为endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第115位-3123位碱基所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA构建
1、原核表达载体双酶切及回收
使用Bam HI限制性内切酶和Sal I限制性内切酶对原核表达载体pET-32a(购自天根生化科技有限公司，货号为v1078)进行双酶切，获得线型的pET-32a双酶切片段(见图3)，具体步骤为：pET-32a载体质粒1μg，10×QuickCut Buffer 5μL，BamHI(10U/μL)1μL，SalI(10U/μL)1μL，37℃酶切2小时。使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction KitVer.4.0(Code No.9762)切胶回收长度约5.9kbp的DNA片段。
2、In-Fusion、转化、阳性克隆筛选及质粒测序
使用In-
Figure BDA0002317954000000061
HD Cloning Kit(Clontech Code No.639648)，将LvSERCA基因PCR产物(实施例1得到)与Vector DNA(线型的pET-32a双酶切片段)进行In-Fusion反应，反应体系及条件如下：Vector DNA(约50ng/μL)2μL，LvSERCA基因PCR产物(100ng/μL)1μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，50℃反应15min，取上述In-Fusion产物反应液2.5μL热转化至大肠杆菌细胞JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒命名为LvSERCA-1(pET-32a-LvSERCA)，使用引物T7、P1～P3、R1对LvSERCA-1质粒(pET-32a-LvSERCA)进行测序，重组载体pET-32a-LvSERCA转化大肠杆菌JM109后的菌落PCR检测电泳图见图4。
实施例3：原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的诱导表达
1、菌种培养
挑取单菌落(含pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌JM109或含pET-32a的大肠杆菌JM109)分别至2mL LB/Amp(100μg/mL)+Cm(34μg/mL)培养基中，37℃、200rpm摇床培养12h。
2、主培养诱导
分别取500μL转化有原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌JM109菌液和转化有空原核表达载体pET-32a的大肠杆菌JM109菌液(阴性对照)置于30mL LB液体培养基中，37℃、180rpm摇床培养2h，培养结束后，分别取出1mL，测定菌液OD600值，OD600达到0.6，再分别取出2管(2mL/管)菌液，作为未经IPTG诱导的样品和未经IPTG诱导的阴性对照，再分别向剩余的两种菌液中加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，37℃、180rpm摇床培养4h，分别取出2管(2mL/管)菌液，作为经IPTG诱导的样品和经IPTG诱导的阴性对照。
3、蛋白质抽提
集菌后2.0OD相当的菌体加入320μL PBS悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12,000rpm、5min)。
4、SDS-PAGE/CBB染色
经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a全细胞，经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a上清，经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a全沉淀，经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA，经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA上清，经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA沉淀各取一管(2mL/管)，用于总蛋白分析。具体步骤为：4℃、12000rpm离心2min，弃上清，加入100μL细菌蛋白抽提缓冲液，再加入25μL5×蛋白上样缓冲液(Loading Buffer)，煮沸5min，-20℃保存备用。对上述样品进行SDS-PAGE电泳检测分析。具体步骤为：制备分离胶、浓缩胶，3种样品和3种阴性对照各上样10μL，电泳后，取出分离胶，置于固定液中，摇床固定30min，弃固定液，加入染色液染色30min，弃染色液，加入脱色液，脱色60min；弃脱色液，加入ddH2O，摇床45rpm过夜，取出胶体，置于胶板上扫描，结果如图5所示。
实施例4：盐度耐受性实验
将转化有原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌BL21菌液和转化有空原核表达载体pET-32a的大肠杆菌BL21菌液稀释10倍之后，涂布于含有5g/L，10g/L，20g/L，40g/L，80g/L氯化钠的LB固体培养基平板上，每一个浓度平板设置三个重复，37℃培养箱培养过夜，统计每个LB平板的菌体个数。实验结果表明：转化有原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌BL21在40g/L的氯化钠平板上菌个体数目开始明显多于对照，而在80g/L的氯化钠平板上对照几乎没有长出菌落，但是转化有原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌BL21在80g/L氯化钠的LB固体培养基平板上的还是长出了30多个菌斑(如图6所示)。
由此可见，转化有原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌BL21对盐度具有的一定的耐受性，进一步证明了凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶基因LvSERCA具有明显的盐度耐受功能，可作为筛选盐度抗性家系的分子标记，用于辅助育种选择。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 凡纳滨对虾肌内质网Ca-ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3831
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 1
acatgggcac tttggcccag ggttgtgtct ttaggaatcg aagtatcgtc gaagcgagag 60
caaacaaaag gtagctgatc gcccgcccac gccgcgcaga agccacccac caccatggag 120
gacggacact gttacgagtt cgaggaggtc ctctccaagt tcgccgtcaa gcaggacgtc 180
ggcctcagcg acgcccaggt caaggagaac caggagaagt acggccccaa cgaactgcca 240
gcagaagagg gcaagtctct cctgcagctg atcttggagc agttcgatga cctgcttgtg 300
aagattacat gggtggctgc catcatctcc ttcgtgttgg cttgcttcga ggagggcgaa 360
gagaccgtga cggccttcgt ggagcccttc gtcatccttc tcatcctgat cgctaacgcc 420
atcgtcggcg tgtggcagga gcgcaatgcc gagtccgcca tcgaggccct gaaggagtac 480
gagcctgaga tgggcaaggt cgtgcgcgcg aacaaggccg gcgtgcagaa gatccgcgcc 540
aagggcattg ttcccgggga catcgtcgaa atctcggttg gagacaagat ccccgccgac 600
ttgcgtctgt gcaagatctt ctcaacgacc ctgcgtattg accagtccat tctcactgga 660
gagtctgtgt ctgtcatcaa gcacactgac cccatccctg acccaaaggc cgtcaaccag 720
gacaagaaaa atattctctt ctctggcaca aatgttgccg ctggcaaggc ccgtggtgtt 780
gtcgttggca ctggacttaa cactgctatt ggtaagatcc gtacccagat ggcagagact 840
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gtcatcbcca ttatctgcgt tgctgtctgg gccatcaaca ttggacactt caatgaccct 960
gctcatggtg gttcttggat caagggtgct atctactact tcaagattgc cgttgccctg 1020
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ggttgtacct ctgttatctg ctcagacaag actggcacac tcaccaccaa ccagatgtct 1200
gtctctcgca tgttcattat ggataaggtt gagggtaatg actgctctct tctggaattc 1260
gagatcactg gctccactta cgagcccatt ggtgacattt accttggcgg tgctaaggtg 1320
aagggtgctg actttgaggg tctgcaggaa ctcgccactg tttccttcat gtgcaatgat 1380
tcttctattg atttcaatga gttcaagaat atgtttgaaa aggtcggtga agccactgag 1440
actgccctga ttgtgctggg tgagaagatc aacccataca gccagtctaa ggttggtttg 1500
gatcgtcgct ctgctgccat tgttgccaag caagacatgg agaccaagtg gaagaaagaa 1560
tttaccttgg aattctcccg tgaccgcaaa tccatgtcct cctactgcgt gcccctcaag 1620
cctactcgcc tgggaactgg acccaagatg ttctgcaagg gtgcacctga aggtgttctt 1680
gaacgttgca ctcacgtccg tgttggtacc cagaaggttc ccctcactgc tggagtgaga 1740
gacaagatct tggcagttac ccgtgactat ggctgtggtc gtgacactct ccgttgcttg 1800
ggtcttgcca ctattgacac cccaatgaag cctgaggata tggatctcgg tgactccacc 1860
aagttctaca cctatgaagt caacatgact ttcattggtg ttgttggtat gcttgaccca 1920
ccccgcaagg aagtgcgtga ttccattgag aagtgtcgtg aggctggtat ccgtgtcatt 1980
gtcatcactg gagacaacaa ggccactgct gaggctatct gccgccgtat tggtgtgttt 2040
ggtgaaaatg aggaaactgc tggcaagtca tactctggtc gtgaatttga tgagctcagc 2100
gttgcagaac agagacttgc ttgcatcaat tcacgtctct tctcccgtgt cgagcctttc 2160
cacaaatcca agattgttga atacctgcag ggagagggtg agatctctgc catgactggt 2220
gatggtgtga atgatgcccc tgctctgaag aaggctgaga tcggtattgc catgggttcg 2280
ggcactgctg tagccaagtc tgcttctgag atggtgcttg ctgatgataa cttctcgtcc 2340
attgtggctg ctgttgagga aggccgtgcc atctacaaca acatgaagca gttcatccgt 2400
tacctcattt cctccaacat tggtgaagtg gtgtccatct tcttgactgc tgctcttggt 2460
ctccctgaag ctctcattcc tgtccagctc ttgtgggtca acctggttac tgatggtctg 2520
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ttcgaaggtc tggattgcaa catcttcagc cacccagccc ccatgtccat ggctctttcc 2820
gtgcttgtca ccattgagat gctcaacgct cttaacagct tgtcagagaa ccagtcactc 2880
atcgtgatgc ccccctgggt caacatctgg ctgctggcgg ctatggccct ctccatgacc 2940
ctgcatttca tcatcttgta cattgatatc cttagtactg tgttccaggt gatgcccctc 3000
acaactgcac agtggatggc tgtattgaag atatccctcc ctgtggtgct gctggatgag 3060
accctcaagt tcgttgctcg caagtacact gatgtacctg gcaagattga gcaaaaatgg 3120
taaaatcaag aggtaccatc tactccagct tttccaatgt cctcacagcc agtagcctta 3180
gctgtattaa cctacaagcc gtcagtgcca tgcctgtgat gagcccagca ccaccccgcc 3240
atggccactg tatctagggg tgctagtcag cagcttagag gaactttcca tctccattgc 3300
tgatgtccag aattcctaag gaacagtagc catgggcatt ggaggggcag aagcggacgg 3360
tggtggtgtg cgaggtcctt cacctccaac agagatctca gcctccccct gctgtgcctt 3420
ggcactcttt gtccataaga atctgcacat cagtattact acaccatgca gggggggttc 3480
acccattggc ccaccacctt gccaacattc tccatccaat ggatgacata tagaggatga 3540
atatgtacat ttacttatgt tgtaatttga tttagaaaaa ctagaatatt ttgattccct 3600
tgttgaaata aactgttagc taactgctct tgggcaaaca ttgccaaaag tcacactaag 3660
tgtgttgtgt cctgtgtctg tgctcatgtc aaactgccca acagagagca atgtacgacc 3720
atacaaacat ccacttgttt ctgtgcaaag atgtggtaca gttttgtacc tcattttgta 3780
catgccactc atttattgtt gatgatagaa taaataataa aaaaagacct c 3831
<210> 2
<211> 1003
<212> PRT
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 2
Met Glu Asp Gly His Cys Tyr Glu Phe Glu Glu Val Leu Ser Lys Phe
1 5 10 15
Ala Val Lys Gln Asp Val Gly Leu Ser Asp Ala Gln Val Lys Glu Asn
20 25 30
Gln Glu Lys Tyr Gly Pro Asn Glu Leu Pro Ala Glu Glu Gly Lys Ser
35 40 45
Leu Leu Gln Leu Ile Leu Glu Gln Phe Asp Asp Leu Leu Val Lys Ile
50 55 60
Thr Trp Val Ala Ala Ile Ile Ser Phe Val Leu Ala Cys Phe Glu Glu
65 70 75 80
Gly Glu Glu Thr Val Thr Ala Phe Val Glu Pro Phe Val Ile Leu Leu
85 90 95
Ile Leu Ile Ala Asn Ala Ile Val Gly Val Trp Gln Glu Arg Asn Ala
100 105 110
Glu Ser Ala Ile Glu Ala Leu Lys Glu Tyr Glu Pro Glu Met Gly Lys
115 120 125
Val Val Arg Ala Asn Lys Ala Gly Val Gln Lys Ile Arg Ala Lys Gly
130 135 140
Ile Val Pro Gly Asp Ile Val Glu Ile Ser Val Gly Asp Lys Ile Pro
145 150 155 160
Ala Asp Leu Arg Leu Cys Lys Ile Phe Ser Thr Thr Leu Arg Ile Asp
165 170 175
Gln Ser Ile Leu Thr Gly Glu Ser Val Ser Val Ile Lys His Thr Asp
180 185 190
Pro Ile Pro Asp Pro Lys Ala Val Asn Gln Asp Lys Lys Asn Ile Leu
195 200 205
Phe Ser Gly Thr Asn Val Ala Ala Gly Lys Ala Arg Gly Val Val Val
210 215 220
Gly Thr Gly Leu Asn Thr Ala Ile Gly Lys Ile Arg Thr Gln Met Ala
225 230 235 240
Glu Thr Glu Glu Ile Lys Thr Pro Met Gly Gln Lys Leu Asp Glu Phe
245 250 255
Gly Glu Gln Leu Ser Lys Val Ile Ser Ile Ile Cys Val Ala Val Trp
260 265 270
Ala Ile Asn Ile Gly His Phe Asn Asp Pro Ala His Gly Gly Ser Trp
275 280 285
Ile Lys Gly Ala Ile Tyr Tyr Phe Lys Ile Ala Val Ala Leu Ala Val
290 295 300
Ala Ala Ile Pro Glu Gly Leu Pro Ala Val Ile Thr Thr Cys Leu Ala
305 310 315 320
Leu Gly Thr Arg Arg Met Ala Lys Lys Asn Ala Ile Val Arg Ser Leu
325 330 335
Pro Ser Val Glu Thr Leu Gly Cys Thr Ser Val Ile Cys Ser Asp Lys
340 345 350
Thr Gly Thr Leu Thr Thr Asn Gln Met Ser Val Ser Arg Met Phe Ile
355 360 365
Met Asp Lys Val Glu Gly Asn Asp Cys Ser Leu Leu Glu Phe Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Ser Thr Tyr Glu Pro Ile Gly Asp Ile Tyr Leu Gly Gly Ala
385 390 395 400
Lys Val Lys Gly Ala Asp Phe Glu Gly Leu Gln Glu Leu Ala Thr Val
405 410 415
Ser Phe Met Cys Asn Asp Ser Ser Ile Asp Phe Asn Glu Phe Lys Asn
420 425 430
Met Phe Glu Lys Val Gly Glu Ala Thr Glu Thr Ala Leu Ile Val Leu
435 440 445
Gly Glu Lys Ile Asn Pro Tyr Ser Gln Ser Lys Val Gly Leu Asp Arg
450 455 460
Arg Ser Ala Ala Ile Val Ala Lys Gln Asp Met Glu Thr Lys Trp Lys
465 470 475 480
Lys Glu Phe Thr Leu Glu Phe Ser Arg Asp Arg Lys Ser Met Ser Ser
485 490 495
Tyr Cys Val Pro Leu Lys Pro Thr Arg Leu Gly Thr Gly Pro Lys Met
500 505 510
Phe Cys Lys Gly Ala Pro Glu Gly Val Leu Glu Arg Cys Thr His Val
515 520 525
Arg Val Gly Thr Gln Lys Val Pro Leu Thr Ala Gly Val Arg Asp Lys
530 535 540
Ile Leu Ala Val Thr Arg Asp Tyr Gly Cys Gly Arg Asp Thr Leu Arg
545 550 555 560
Cys Leu Gly Leu Ala Thr Ile Asp Thr Pro Met Lys Pro Glu Asp Met
565 570 575
Asp Leu Gly Asp Ser Thr Lys Phe Tyr Thr Tyr Glu Val Asn Met Thr
580 585 590
Phe Ile Gly Val Val Gly Met Leu Asp Pro Pro Arg Lys Glu Val Arg
595 600 605
Asp Ser Ile Glu Lys Cys Arg Glu Ala Gly Ile Arg Val Ile Val Ile
610 615 620
Thr Gly Asp Asn Lys Ala Thr Ala Glu Ala Ile Cys Arg Arg Ile Gly
625 630 635 640
Val Phe Gly Glu Asn Glu Glu Thr Ala Gly Lys Ser Tyr Ser Gly Arg
645 650 655
Glu Phe Asp Glu Leu Ser Val Ala Glu Gln Arg Leu Ala Cys Ile Asn
660 665 670
Ser Arg Leu Phe Ser Arg Val Glu Pro Phe His Lys Ser Lys Ile Val
675 680 685
Glu Tyr Leu Gln Gly Glu Gly Glu Ile Ser Ala Met Thr Gly Asp Gly
690 695 700
Val Asn Asp Ala Pro Ala Leu Lys Lys Ala Glu Ile Gly Ile Ala Met
705 710 715 720
Gly Ser Gly Thr Ala Val Ala Lys Ser Ala Ser Glu Met Val Leu Ala
725 730 735
Asp Asp Asn Phe Ser Ser Ile Val Ala Ala Val Glu Glu Gly Arg Ala
740 745 750
Ile Tyr Asn Asn Met Lys Gln Phe Ile Arg Tyr Leu Ile Ser Ser Asn
755 760 765
Ile Gly Glu Val Val Ser Ile Phe Leu Thr Ala Ala Leu Gly Leu Pro
770 775 780
Glu Ala Leu Ile Pro Val Gln Leu Leu Trp Val Asn Leu Val Thr Asp
785 790 795 800
Gly Leu Pro Ala Thr Ala Leu Gly Phe Asn Pro Pro Asp Leu Asp Ile
805 810 815
Met Glu Lys Pro Pro Arg Lys Ala Asp Glu Ser Leu Ile Ser Gly Trp
820 825 830
Leu Phe Phe Arg Tyr Met Ala Ile Gly Gly Tyr Val Gly Cys Ala Thr
835 840 845
Val Phe Ala Ala Ser Trp Trp Phe Met Tyr Asp Pro Thr Gly Pro Gln
850 855 860
Leu Asn Tyr Tyr Gln Leu Ser His His Leu Ser Cys Leu Gly Asp Asp
865 870 875 880
Lys Asn Phe Glu Gly Leu Asp Cys Asn Ile Phe Ser His Pro Ala Pro
885 890 895
Met Ser Met Ala Leu Ser Val Leu Val Thr Ile Glu Met Leu Asn Ala
900 905 910
Leu Asn Ser Leu Ser Glu Asn Gln Ser Leu Ile Val Met Pro Pro Trp
915 920 925
Val Asn Ile Trp Leu Leu Ala Ala Met Ala Leu Ser Met Thr Leu His
930 935 940
Phe Ile Ile Leu Tyr Ile Asp Ile Leu Ser Thr Val Phe Gln Val Met
945 950 955 960
Pro Leu Thr Thr Ala Gln Trp Met Ala Val Leu Lys Ile Ser Leu Pro
965 970 975
Val Val Leu Leu Asp Glu Thr Leu Lys Phe Val Ala Arg Lys Tyr Thr
980 985 990
Asp Val Pro Gly Lys Ile Glu Gln Lys Trp Glu
995 1000

Claims (1)

1.凡纳滨对虾肌内质网 Ca2+-ATP酶 LvSERCA基因编码蛋白或其编码基因在提高大肠杆菌的盐耐受性中的应用，所述的凡纳滨对虾肌内质网 Ca2+-ATP酶 LvSERCA基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第115位-3123位碱基所示。
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Cloning of sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) gene from white shrimp, Litopenaeus vannamei and its expression level analysis under salinity stress;Wang等;《Mol Biol Rep》;20131130;6213–6221 *
GenBank.登录号：JN986572.1.《GenBank》.2013, *
登录号：JN986572.1;GenBank;《GenBank》;20131102;全文 *

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