CN107955807A - 预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体 - Google Patents

预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体 Download PDF

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顾昌祺
陶冶
胡征
杨波
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y103/01012—Prephenate dehydrogenase (1.3.1.12)

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体。预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法，包括步骤：1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的预苯酸脱氢酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；2)纯化抗血清得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。本发明利用PCR技术在喜冷杆菌属Cryobacterium中扩增得到预苯酸脱氢酶基因，并通过基因工程技术得到Ecoli BL21‑pET21a‑PDG重组菌株，诱导表达重组菌株得到预苯酸脱氢酶蛋白，该蛋白具有较好的低温耐受，而且以预苯酸脱氢酶为抗原成功得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，该多克隆抗体能够准确检测预苯酸脱氢酶。

Description

预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体。
背景技术
预苯酸脱氢酶，别名：预沉淀脱氢酶，英文名：prephenate dehydrogenase。预苯酸脱氢酶存在于莽草酸途径中，对合成酪氨酸有重大作用。预苯酸脱氢酶催化预苯酸生成4-羟基苯基丙酮酸，4-羟基苯基丙酮酸通过转氨作用生成L-酪氨酸。L-酪氨酸能够改善记忆和精神警觉性，控制抑郁和焦虑，L-酪氨酸也是黑色素、左旋多巴等多种高价值化合物的原料，被应用于工业生产(参考文献Bonuccelli U，Del Dotto P.New pharmacologichorizons in the treatment of Parkinson disease[J].Neurology,2006.67(7Suppl2):30-38)。
目前国内外对预苯酸脱氢酶的研究主要集中在Aquifex aeolicus、Streptococcus mutant、Haemophilus influenza以及环境未培养微生物，鲜见对于一些极端微生物比如耐冷，耐热，耐酸，耐碱等微生物中预苯酸脱氢酶的研究。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一种预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体，得到了来源于耐冷微生物中的预苯酸脱氢酶，该预苯酸脱氢酶具有低温酶的特性，而且制备得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，能够准确检测预苯酸脱氢酶。
本发明的目的之一是提供一种预苯酸脱氢酶的氨基酸序列；所述预苯酸脱氢酶序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的目的之二是提供一种编码预苯酸脱氢酶的氨基酸基因的碱基序列；所述预苯酸脱氢酶的氨基酸基因的碱基序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明的目的之三是提供一种预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法。
预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的方法，包括以下步骤：
1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的预苯酸脱氢酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；
2)纯化抗血清得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。
进一步地，所述预苯酸脱氢酶的制备方法为：
1.1)利用PCR技术扩增SEQ ID NO.2所示的碱基序列；
1.2)将SEQ ID NO.2所示的碱基序列克隆入载体质粒中，构建预苯酸脱氢酶的表达载体；
1.3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，依次经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和纯化蛋白过程得到预苯酸脱氢酶蛋白。
进一步地，所述纯化抗血清的方法为：将预苯酸脱氢酶蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，再将待纯化的抗血清与PBS按照1:1比例混合后经过抗体纯化层析柱，待抗血清中的抗体与预苯酸脱氢酶蛋白结合完全后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。
更进一步地，所述步骤1.1)中，PCR技术扩增所用的引物为：正向引物如SEQ IDNO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。
更进一步地，所述步骤1.2)中载体质粒为pET21a(+)。
更进一步地，所述步骤1.3)中，大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。
更进一步地，所述步骤1.3)中，所述纯化蛋白过程中利用Ni-NTA亲和层析色谱柱进行蛋白纯化。
本发明的优点在于：
1，本发明通过PCR技术在喜冷杆菌属Cryobacterium中扩增得到预苯酸脱氢酶基因，并且通过NCBI Blast碱基序列比对证明该预苯酸脱氢酶基因碱基序列属于喜冷杆菌属的新的预苯酸脱氢酶基因序列。通过基因工程技术得到表达预苯酸脱氢酶蛋白的EcoliBL21-pET21a-PDG重组菌株，诱导表达重组菌株得到预苯酸脱氢酶蛋白，预苯酸脱氢酶为低温酶，即在低温条件下发挥活性，具有较好低温的耐受力。
2，本发明以预苯酸脱氢酶为抗原得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，该多克隆抗体可以准确地检测预苯酸脱氢酶蛋白。
附图说明
图1为PCR扩增预苯酸脱氢酶基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为DNAmarker，1号泳道为PCR扩增预苯酸脱氢酶基因的产物；
图2为表达载体pET21a-PDG的构建示意图；
图3为重组菌株Ecoli BL21-pET21a-PDG表达预苯酸脱氢酶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图；其中Marker泳道为protein marker；PDG泳道为预苯酸脱氢酶蛋白；
图4为预苯酸脱氢酶多克隆抗体的Western Blotting分析图，其中Magic泳道为蛋白质分子量标准，C.b 02泳道为细菌Cryobacterium baishanse 02超声破碎离心后的上清液样品。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对发明进行详细的说明。
实施例1
预苯酸脱氢酶基因的获取
1)获取含有目的基因的菌株
本发明利用喜冷杆菌属菌株，喜冷杆菌属菌株筛选自长白山土壤，具体的筛选过程如申请号为201710034491.5的中国发明专利，该菌株的命名为：Cryobacteriumbaishanse 02，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016604。保藏日期为2016年10月31日，保藏地址为，中国武汉，武汉大学。喜冷杆菌属菌株Cryobacteriumbaishanse 02为耐冷菌株，在4℃的环境中仍保持较高的代谢活性。
2)基因组的提取
利用DNA提取试剂盒(TAKARA Dalian)提取Cryobacterium baishanse 02菌株的基因组作为模板，提取的基因组样品于-20℃保存待用。
3)PCR扩增目的基因
设计引物：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示；PCR反应体系如下表1所示：
表1
成分 体积
10×PCR缓冲液 5μl
引物F 1μl
引物R 1μl
模板 80ng
MgSO4 2μl
dNTP 5μl
去离子水 35μl
总计 50μl
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。
将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，PCR扩增产物的大小与预计的885bp接近，将PCR扩增产物切胶回收，送生物公司测序以准确判断PCR扩增产物的碱基序列，测序委托铂尚生物技术有限公司完成。
测序结果如SEQ ID NO.2所示，将SEQ ID NO.2所示的碱基序列在NCBI Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行碱基序列比对，比对结果与Cryobacterium arcticum strain PAMC 27867的预苯酸脱氢酶相似性97％，即可判断SEQID NO.2所示的碱基序列属于Cryobacterium属的新的预苯酸脱氢酶序列。
实施例2
构建预苯酸脱氢酶的表达载体
将实施例1中得到的PCR扩增产物进行胶回收，用限制性内切酶EcoRI和NdeI对PCR扩增产物进行双酶切反应；同时用限制性内切酶EcoRI和NdeI对载体pET21a(+)进行双酶切反应，然后经高效DNA连接酶High Ligation(TOYOBO)催化连接经双酶切反应后的pET21a(+)和PCR扩增产物；构建得到预苯酸脱氢酶的表达载体pET21a-PDG，表达载体pET21a-PDG的构建如图2所示。
实施例3
表达和纯化预苯酸脱氢酶蛋白
将实施例2得到的表达载体pET21a-PDG转化入大肠杆菌BL21的感受态菌体中，大肠杆菌BL21的感受态的制备采用CaCl2法，CaCl2法制备大肠杆菌BL21的感受态为实验室常规实验手段，在此不再赘述。将得到的表达载体pET21a-PDG转化入大肠杆菌BL21后得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-PDG。将Ecoli BL21-pET21a-PDG扩大培养至OD600＝0.6后添加1mM IPTG，28℃诱导培养表达预苯酸脱氢酶蛋白，诱导培养结束后收集菌体，依次经菌体破碎和Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化后的预苯酸脱氢酶蛋白，如图3所示，得到预苯酸脱氢酶蛋白的蛋白分子量在29.0～44.3之间，与理论预计值40.7KD一致，表明纯化得到的蛋白即为预苯酸脱氢酶蛋白。
实施例4
预苯酸脱氢酶蛋白酶活力影响试验
预苯酸脱氢酶的酶活测定原理为：预苯酸脱氢酶以NAD(P)+为辅酶催化预苯酸脱羧生成对羟基苯丙酮酸和NADH，通过测定NADH的生成量计算预苯酸脱氢酶的酶活大小。
底物的配制：反应体系体积为1mL，其中含50mmol/LTris(pH8.0)，1mmol/LEDTA，1mmol/LDTT，2mmol/LNAD+，0.5mmol/L预苯酸。
酶活测定步骤：
向1mL底物中加入20ul纯化后的酶液，分别在4℃、18℃、28℃、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃开始反应，计时20min，加入500ul1mol/LNaOH溶液终止酶反应，离心去除蛋白沉淀，利用酶标仪测定OD340值。相对酶活结果见表2。
酶活力单位定义：在一定条件下，1min时间催化产生1umol/LNADH的酶量为一个酶活力单位U。
表2
温度℃ 相对酶活％
4 18％
18 45％
28 75％
37 80％
45 89％
50 64％
60 35％
70 8％
80 0％
由表2可以看出，本发明得到的预苯酸脱氢酶蛋白最适温度为45℃，而且预苯酸脱氢酶在4℃具有18％的相对酶活，与现有的预苯酸脱氢酶相比，本发明得到的预苯酸脱氢酶具有较好的低温耐受，这可能因为编码预苯酸脱氢酶的碱基序列来自于Cryobacteriumbaishanse 02，Cryobacterium baishanse 02为低温菌，使得到的预苯酸脱氢酶具有低温耐受特性，利用本发明的预苯酸脱氢酶能够在低温条件下催化预苯酸脱羧生成对羟基苯丙酮酸，能为工业生产节约能耗，具有较好的应用前景。
实施例5
预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备：
取实施例3纯化后的预苯酸脱氢酶蛋白作为抗原，采用皮下注射免疫约5周龄的小鼠，50μg每次，2周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过ELISA方法确定抗体针对抗原的效价，效价大于1:50000进行最终采血制备抗血清，然后纯化抗血清制备多克隆抗体。
一)ELISA方法确定抗体针对抗原的效价的方法为：
1)将抗原用碳酸钠缓冲液(pH 9.6)稀释到10μg/ml，将抗原置于酶标96孔板，每孔100μl孵育1h。
2)用PBS-T将酶标96孔板清洗3次。
3)用5％skim milk封闭酶标板1小时，每孔100μl。
4)用PBS-T将酶标板清洗3次。
5)用PBS-T稀释血清5000倍，孵育抗原1h。
6)用PBS-T将酶标板清洗3次。
7)每孔加入100μl HRP标记的羊抗鼠抗体，用PBS-T稀释羊抗鼠抗体5000倍，孵育1h。
8)利用PBS-T将酶标板清洗3次。
9)清洗完毕后每孔加入100μl显色液ABST，反应20min后每孔加入50μl过氧化氢；
10)最后分光光度计上测420nm上述步骤9)中样品的OD值，并得出效价为1：16，大于1:50000然后进行最终采血得到抗血清。
二)纯化抗血清：
纯化抗血清的方法是：将抗原蛋白(预苯酸脱氢酶蛋白)与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将上述采血所得的抗血清与PBS按照1:1比例混合后，缓慢经过抗体纯化层析柱，待抗血清中的抗体与抗原蛋白结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的多克隆抗体，纯化后的多克隆抗体利用PBS过夜透析，次日进行浓度测定。
上述纯化的多克隆抗体浓度的测定方法，包括以下步骤：
1)CBB染色液配制：根据样品数量，将5×CBB染色液稀释，充分混匀。
2)根据需要取适量BSA标准蛋白，配制终浓度分别为1mg/ml、0.75mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml和0.125mg/ml标准样，并混匀。标准样采用PBS为溶剂。
3)标准曲线绘制：取一块酶标板，按下表格加入试剂：
孔号 A B C D E F
标准样浓度(mg/ml) 0 0.125 0.25 0.5 0.75 1
各浓度标准样(μl) 1 1 1 1 1 1
去离子水 9 9 9 9 9 9
CBB染色液 200 200 200 200 200 200
对应蛋白含量(μg) 0 0.125 0.25 0.5 0.75 1
最终体积(μl) 210 210 210 210 210 210
4)振荡混匀后，室温下静置30min。
5)用酶标仪测定562nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收为空白对照。以蛋白含量(μg)为横坐标，吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。
6)样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释不同浓度梯度，各取1μl并稀释至10μl，再加入200μl 1×CBB，混匀后室温下静置30min，然后以不含蛋白的溶剂为空白对照，测定样品吸收值。
7)根据测得的吸收值，在标准曲线上计算样品的蛋白含量。
8)计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量，并根据稀释倍数计算样品的实际浓度。
三)利用Western Blotting检测预苯酸脱氢酶的方法为：
1)细菌Cryobacterium baishanse 02(保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016604)培养至OD至约为2.0，取1.5ml离心收集菌体，300μl Tris-HCl重悬，超声破碎取20μl破碎夜与5μl 5×SDS上样缓冲液混合，其中10μl进行SDS-PAGE电泳。蛋白质分子量标准上样量为0.8μl。
2)上样后，电泳仪恒定为18mA，直到电泳结束。
3)电泳后，将凝胶上蛋白样品转移至PVDF膜，恒定电流为0.23A进行转膜，时间为35分钟。
4)电泳结束后将PVDF膜干燥后于5％skim milk中封闭1小时。
5)PBST清洗PVDF膜5次。
6)用PBST稀释上述纯化的抗体(1:5000)，孵育PVDF膜1小时。
7)PBST清洗PVDF膜5次。
8)用PBST稀释二抗(1:20000，羊抗鼠-HRP)，孵育PVDF膜1小时。
9)PBST清洗5次，ECL显影，暗室成像。
结果如图4所示，结果表明制备得到的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体可以检测到预苯酸脱氢酶蛋白。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖北工业大学
<120> 预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 360
<212> PRT
<213> Cryobacterium
<400> 1
Met Val Glu Ser Arg Leu Ile Gly Pro Val Arg Val Val Gly Ala Gly
1 5 10 15
Leu Leu Gly Thr Ser Ile Gly Leu Gly Leu Thr Ala Arg Gly Leu Asp
20 25 30
Val Ile Leu Ala Asp Ala Ser Pro Thr Asn Leu Ser Leu Ala Ile Asp
35 40 45
Tyr Gly Ala Gly Arg Ala Ala Thr Pro Gly Asp Ala Pro Gln Leu Ile
50 55 60
Val Val Cys Val Pro Pro Asp Val Thr Ala Asp Val Val Ala Arg Glu
65 70 75 80
Leu Glu Ala Phe Pro Asp Ala Ile Val Thr Asp Val Ala Ser Val Lys
85 90 95
Leu Ala Pro Leu Thr Glu Leu Gln Glu Arg Gly Ala Asp Val Ser Arg
100 105 110
Tyr Ile Gly Ser His Pro Leu Ala Gly Arg Glu Arg Gly Gly Pro Leu
115 120 125
Ala Gly Arg Ala Asp Leu Phe Ile Gly Arg Pro Trp Val Val Ala Ala
130 135 140
His Asp Ala Ile Ser Tyr Gln Arg Ala Thr Ala Ile Asp Asp Leu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Leu Gly Ala Thr Leu Val Glu Met Ser Pro Glu Asp His Asp
165 170 175
Asn Ala Val Ala Leu Val Ser His Val Pro Gln Val Val Ser Thr Leu
180 185 190
Met Ala Arg Arg Leu Thr Asp Ala Pro Gly Ser Ala Leu Asn Leu Ala
195 200 205
Gly Gly Gly Val Arg Asp Val Thr Arg Val Ala Ala Ser Asp Pro Glu
210 215 220
Leu Trp Val Gln Ile Leu Gly Ala Asn Pro Ala Pro Val Arg Gln Ile
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu Arg Asp Asp Leu Asp Arg Phe Ile Asp Ala Leu Ala
245 250 255
Asp Pro Ser Ala Pro Gly Ala Arg Arg Gln Val Ala Glu Glu Ile Ala
260 265 270
Gly Gly Asn Thr Gly Val Ala Arg Leu Pro Gly Lys His Gly Gln Asp
275 280 285
Arg Arg Tyr Ser Val Ile Thr Val Met Val Asp Asp Thr Pro Gly Gln
290 295 300
Leu Ala Arg Leu Phe Asn Glu Ile Gly Glu Val Gly Val Asn Leu Glu
305 310 315 320
Asp Leu Arg Leu Glu His Ser Pro Gly Ala Gln Ile Gly Leu Ala Glu
325 330 335
Ile Ser Ile Leu Pro Glu Ala Val Ser Arg Leu Thr Thr Glu Leu Ala
340 345 350
Ala Arg Gly Trp Arg Ile Val Gly
355 360
<210> 2
<211> 1083
<212> DNA
<213> Cryobacterium
<400> 2
gtggtcgagt ctcgcctgat cgggccggtg cgagtcgtcg gcgccgggct cctgggaacc 60
agcatcggcc tgggcctcac cgcccgcggc ctcgacgtga tcctcgccga cgcgtcgccg 120
accaacctgt cgctggccat cgactacggc gccggccgcg ccgccgctgc cggcgacgcc 180
ccgcagctca tcgtcgtgtg cgtgccgccg gacgtgacgg ccgacatcgt cgcccgcgaa 240
ctcgaagcgt tccccgacgc gatcgtgacg gatgtggcca gcgtcaagct ggccccgctc 300
accgagctgc gcgaacgcgg cgccgacgtc tcccggtaca tcggctcgca cccgctggcc 360
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tag 1083
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggaattccat atggtggtcg agtctcgcct g 31
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggaattcacc gacaatccgc cagcc 25

Claims (10)

1.一种预苯酸脱氢酶，其特征在于：所述预苯酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的预苯酸脱氢酶的基因，其特征在于：所述预苯酸脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体的抗原为SEQ IDNO.1所示氨基酸序列组成的多肽。
4.一种制备权利要求3所述的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的预苯酸脱氢酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；
2)纯化抗血清得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述预苯酸脱氢酶的制备方法为：
1.1)利用PCR技术扩增SEQ ID NO.2所示的碱基序列；
1.2)将SEQ ID NO.2所示的碱基序列克隆入载体质粒中，构建预苯酸脱氢酶的表达载体；
1.3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，依次经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和纯化蛋白过程得到预苯酸脱氢酶蛋白。
6.根据权利要求4所述的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述纯化抗血清的方法为：将预苯酸脱氢酶蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，再将待纯化的抗血清与PBS按照1:1比例混合后经过抗体纯化层析柱，待抗血清中的抗体与预苯酸脱氢酶蛋白结合完全后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。
7.根据权利要求5所述的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1.1)中，PCR技术扩增所用的引物为：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ IDNO.4所示。
8.根据权利要求5所述的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1.2)中载体质粒为pET21a(+)。
9.根据权利要求5所述的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1.3)中，大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。
10.根据权利要求5所述的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1.3)中，所述纯化蛋白过程中利用Ni-NTA亲和层析色谱柱进行蛋白纯化。
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