KR102216258B1 - 노로바이러스 검출 센서, 및 이를 이용하는 전기화학적 센싱방법 - Google Patents

노로바이러스 검출 센서, 및 이를 이용하는 전기화학적 센싱방법 Download PDF

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Abstract

노로바이러스 검출 센서 및 이를 이용한 전기화학적 센싱방법이 제공된다. 상세하게는, 생물학적 시료 수용부 및 검출신호 측정부를 포함하는 노로바이러스 검출 센서에 있어서, 3차원 골드 나노표면 전극을 기판으로 하고, 상기 기판에 고정된 시료 포획제(capture agent)로서 상기 노로바이러스와 결합할 수 있는 콘카나발린 A(concanavalin A)를 이용하는 생물학적 시료 수용부를 포함하는 것일 수 있다. 이에, 본 발명은 표면적이 넓은 3차원 골드 나노표면 전극을 적용하여 센서의 민감도를 향상시킬 수 있다. 또한, 값이 저렴하고 용이하게 구할 수 있는 비항체물질인 콘카나발린 A를 사용함으로써 센서 제조비용을 절감시키는 효과를 가질 수 있다.

Description

노로바이러스 검출 센서, 및 이를 이용하는 전기화학적 센싱방법{SENSOR OF DETECTING NOROVIRUS AND SENSING METHOD USING THE SENSOR}
본 발명은 바이오 센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 노로바이러스 검출 센서 및 이를 이용하는 전기화학적 센싱방법에 관한 것이다.
바이오 센서는 동식물의 세포 또는 조직, 효소, 미생물 등 생물의 특성을 이용하여 측정을 원하는 타겟 물질의 상태 및 농도를 센싱(sensing)하는 생물학적 분석장치이다. 일반적으로, 바이오 센서는 타겟 물질을 감지하고 수용하는 수용부와 감지된 타겟 물질을 물리적으로 측정 가능한 신호로 변환하여 나타내는 신호 측정부로 구성될 수 있다. 이러한 바이오 센서는 의약 분야에서 혈액, 조직세포 등의 생체시료 분석을 위해 많이 사용되었으나, 최근에는 소비자들의 건강과 웰빙에 대한 관심과 함께 식품분석 및 환경 등으로 사용범위가 점차 확대되고 있다.
한편, 노로바이러스(Norovirus)는 식품 및 수질 매개 병원체로, 음식물이나 물 등을 통해 섭취하게 되는 경우, 사람에게 감염성 위장염을 일으키는 장관계 바이러스(Enteric virus)의 한 종류로 알려져 있다. 구체적으로, 노로바이러스는 Caliciviridae과에 속하는 RNA virus로, 다섯가지(GI-GV) 유전자군으로 분류되며, 이들 중 노로바이러스의 인체감염은 주로 유전자군 GI의 8개 유전자형, GII의 17개 유전자형에 의한 것으로 알려져있다. 노로바이러스는 입자 100개 정도만 섭취해도 사람에게 설사, 복통, 구토 등의 증상을 유발할 수 있고, 상기 증상들에 의해 배출되는 구토물이나 배설물 등에 약 1억 개의 노로바이러스 입자가 함유되어 있어, 강력한 감염력 및 빠른 전염속도를 가지고 있다. 이에, 식품이나 수질에 존재할 수 있는 노로바이러스의 검출 및 예방에 대한 기술이 더욱 요구되고 있다. 이러한 노로바이러스 검출을 위하여, 종래에는 핵산기반기술을 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 센서장치가 주로 사용되었다. 상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 중합효소를 사용하여 노로바이러스 RNA를 주형(template)으로 유전정보를 증폭시켜, 이를 이용하여 선택적이고 특이적으로 노로바이러스를 검출하는 방법이다.
하지만, 이러한 종래의 핵산을 이용하는 기술은 다양하고 복잡한 시료전처리기술이 요구되어, 검출까지 많은 시간과 비용이 소요되는 문제점이 있고, 고가의 특수장비 사용으로 센서 장치를 소형화하기 어렵다. 또한, 식품 내에 오염된 노로바이러스 검출시, 낮은 농도로 존재하는 노로바이러스를 검출하는 데에 한계가 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 검출 소요시간 및 센서 장치 비용을 감소시키면서도, 고감도 및 고선택성의 검출 특성을 가질 수 있는 센서 및 이를 이용하는 센싱방법을 제공하는 데에 있다.
상기 과제를 이루기 위하여 본 발명의 일 측면은, 생물학적 시료 수용부 및 검출신호 측정부를 포함하는 노로바이러스 검출 센서에 있어서, 3차원 골드 나노표면 전극을 기판으로 하고, 상기 기판에 고정된 시료 포획제(capture agent)로서 상기 노로바이러스와 결합할 수 있는 콘카나발린 A(concanavalin A)를 이용하는 생물학적 시료 수용부를 포함하며, 상기 3차원 골드 나노표면 전극은 전기화학 증착공정을 통해 형성되며, 상기 콘카나발린 A가 고정된 기판 상에 상기 콘카나발린 A가 형성되어 있지 않아 노출된 상기 3차원 골드 나노표면 전극에 메르캅토헥산올(mercaptohexanol)을 추가로 첨가한 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서를 제공할 수 있다.
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상기 검출신호 측정부는, 상기 생물학적 시료 수용부에서 생성되는 전기화학적 신호를 감지하여 생물학적 시료의 정성적·정량적 측정값을 산출하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 생물학적 시료 수용부 및 검출신호 측정부를 포함하는 노로바이러스 검출 센서를 이용하는 것으로, 상기 생물학적 시료 수용부의 3차원 골드 나노표면 전극 상에 고정된 노로바이러스와 결합할 수 있는 포획제인 콘카나발린 A(concanavalin A)와 노로바이러스 시료를 결합시키는 단계, 검출신호 표지용 항체를 이용하여 상기 결합으로 조성된 결합체를 표지하는 단계, 상기 검출신호 표지용 항체에 의해 전기화학적 신호가 생성되는 단계, 및 상기 검출신호 측정부를 이용하여 상기 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함하는 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 제공할 수 있다.
상기 검출신호 표지용 항체를 이용하여 상기 결합으로 조성된 결합체를 표지하는 단계는, 상기 결합체에 포함된 노로바이러스만을 선택적으로 결합하는 1차 항체 및 전기화학 효소가 연결된 2차 항체를 순차적으로 사용하여 표지하는 것일 수 있다.
상기 결합체에 표지시킨 상기 2차 항체와 연결된 전기화학 효소에 의해 전기화학적 신호가 생성되는 것일 수 있다.
상기 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 통해, 35 copies/mL 내지 60 copies/mL의 검출한계를 갖는 것일 수 있다.
상기 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 통해, 노로바이러스에 대하여 98% 이상의 검출 선택성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 생물학적 시료 수용부 및 검출신호 측정부를 포함하는 노로바이러스 검출 센서를 이용하는 것으로, 상기 생물학적 시료 수용부의 3차원 골드 나노표면 전극 상에 고정된 노로바이러스와 결합할 수 있는 포획제인 콘카나발린 A(concanavalin A)와 페리시안화 (ferricyanide)용액을 포함하는 노로바이러스 시료를 결합시키는 단계, 및 상기 검출신호 측정부를 이용하여 상기 페리시안화 용액의 산화환원반응으로 생성되는 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함하는 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 제공할 수 있다.
상기 노로바이러스 시료의 농도에 따라 상기 페리시안화 용액의 산화환원반응로 생성되는 신호의 세기가 변화되는 것일 수 있다.
본 발명은 표면적이 넓은 3차원 골드 나노표면 전극을 적용하여 센서의 민감도를 향상시킬 수 있다.
또한, 값이 저렴하고 용이하게 구할 수 있는 비항체물질인 콘카나발린 A를 사용함으로써, 제조비용을 절감시키는 효과를 가질 수 있다.
아울러, 상기 노로바이러스 검출 센서에 사용하는 콘카나발린 A에 의해 노로바이러스 검출의 선택성(selectivity)을 높일 수 있다.
또한, 페리시안화 용액을 사용하는 전기화학적 센싱방법은, 별다른 라벨링(labeling) 없이도 노로바이러스 농도에 따라 전기화학적 신호 변화를 생성할 수 있어, 검출 소요시간을 감소시킬 수 있고, 이에 간편한 Point-of-care-testing(POCT)으로 적극 활용될 수 있다.
다만, 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들을 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1는 본 발명의 일 실시예에 따른 노로바이러스 검출 센서를 나타낸 모식도이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 생물학적 시료 수용부를 나타낸 모식도이다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 진행과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 나타낸 모식도이다
도 5는 본 발명의 실시예1에서 제조된 3차원 골드 나노표면 전극을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하여 나타낸 이미지이다.
도 6(a) 내지 도 6(b)는 각각 본 발명의 실시예2에서 제조된 노로바이러스 농도별 순환전압전류법 측정결과 및 산화환원전위 0.1V에서의 전기화학신호를 이용한 검정곡선을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실험예2에서 측정한 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법의 선택성 실험 결과이다.
도 8은 본 발명의 실험예3에 따른 노로바이러스 농도별 산화환원전위 0.1V에서의 전기화학신호를 이용한 검정곡선을 나타낸 그래프이다
도 9는 본 발명의 실시예3에 따른 전압전류변화의 측정결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명에 의한 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명이 여러 가지 수정 및 변형을 허용하면서도, 그 특정 실시 예들이 도면들로 예시되어 나타내어지며, 이하에서 상세히 설명될 것이다. 그러나 본 발명을 개시된 특별한 형태로 한정하려는 의도는 아니며, 오히려 본 발명은 청구항들에 의해 정의된 본 발명의 사상과 합치되는 모든 수정, 균등 및 대용을 포함한다.
도면들에 있어서, 층 및 영역들의 두께는 명확성을 기하기 위하여 과장 또는 축소된 것일 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.
본 발명의 일 측면은, 노로바이러스 검출 센서를 제공할 수 있다. 구체적으로 이는, 생물학적 시료 수용부 및 검출신호 측정부를 포함하는 노로바이러스 검출 센서에 있어서, 3차원 골드 나노표면 전극을 기판으로 하고, 상기 기판에 고정된 시료 포획제(capture agent)로서 상기 노로바이러스와 결합할 수 있는 콘카나발린 A(concanavalin A)을 이용하는 생물학적 시료 수용부를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 노로바이러스 검출 센서에 포함되는 상기 생물학적 시료 수용부는, 측정 및 검출을 원하는 타겟 대상인 생물학적 시료를, 감지하거나, 고정화, 또는 포획할 수 있는 장치를 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 타겟대상인 생물학적 시료는, 타겟 검출 대상으로 노로바이러스(norovirus)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료 수용부는 기판으로 사용하는 3차원 골드 나노표면 전극에 상기 노로바이러스를 고정시키기 위하여, 상기 노로바이러스와 결합할 수 있는 포획제로서, 콘카나발린 A(concanavalin)를 사용하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 노로바이러스 검출 센서에 포함되는 검출신호 측정부는, 상기 생물학적 시료 수용부에서 생성되는 전기화학적 신호를 감지하여 생물학적 시료의 정성적·정량적 측정값을 산출하는 것일 수 있다. 상기 검출신호 측정부는, 예를 들어, 상기 생물학적 시료 수용부에 타겟대상인 생물학적 시료 공급시 전기화학적 신호를 생성할 수 있는 특이적인 항체를 이용하여 라벨링(labeling) 하거나, 또는 라벨 없이(label-free) 전기화학적 신호를 생성할 수 있는 물질을 추가로 접촉시키는 방법 등을 통해 생성되는 전기화학적 신호를 감지하여, 생물학적 시료의 성분, 존재 여부, 또는 함유 농도 등의 정성적· 정량적 측정값을 나타내는 것일 수 있다.
도 1는 본 발명의 일 실시예에 따른 노로바이러스 검출 센서를 나타낸 모식도이다.
도 1을 참조하면, 상기 노로바이러스 검출 센서는, 생물학적 시료를 포획할 수 있는 포획제가 형성된 기판이 배치된 생물학적 시료 수용부(100)에, 측정 및 검출을 원하는 타겟 대상인 생물학적 시료, 즉 본 발명에서는 노로바이러스를 포함한 시료를 접촉시킬 수 있는 형태로 구성될 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료 수용부(100)와 전기화학적으로 연결되어 상기 생물학적 시료 수용부(100)가 상기 생화학 노로바이러스(200)가 접촉됨에 따라 생성되는 전기화학적 신호를 감지하고, 측정할 수 있는 검출신호 측정부(300)가 구비되는 것일 수 있다.
본 발명의 생물학적 시료 수용부에 대해서는, 도 2a 내지 도 2c를 참조하여 구체적으로 설명될 수 있으나, 도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일 실시예이므로 이에 한정되지는 않는다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 생물학적 시료 수용부를 나타낸 모식도이다.
도 2a를 참조하면, 상기 기판(110)은 3차원 골드 나노표면 전극일 수 있다. 구체적으로, 상기 3차원 골드 나노표면 전극은 전기화학 증착공정을 통해 형성된 것일 수 있다. 더 상세하게는, 상기 기판(110) 상에 3차원 골드 나노표면을 가진 구조체 형성을 위한 씨드(seed) 역할을 수행하는 금(Au) 박막층이 형성되어 있고, 상기 금(Au)박막층에 전기화학 증착공정이 수행됨에 따라, 상기 금(Au) 박막층에 금 입자가 증착되면서 금 결정체를 형성할 수 있다. 이 때, 상기 금(Au) 박막층에 금 입자가 증착되어 성장된 금 결정체는, 금 입자가 전방향(all-direction)으로 증착성장됨에 따라, 3차원 나노표면 구조로 형성되는 것일 수 있다. 이러한 3차원 나노표면 구조는, 그 구조적 특징에 의해 표면적이 증가될 수 있다. 이에, 상기 3차원 골드 나노표면 전극을 센서의 기판(110)으로 사용시 민감도 및 선택성이 개선될 수 있다. 즉, 상기 3차원 골드 나노표면 전극을 적용한 본 발명의 노로바이러스 검출 센서는 고 민감도(high sensitivity), 및 고 선택성(high sensitivity)의 특성을 가질 수 있다.
도 2b와 같이, 상기 기판(110)으로 사용되는 3차원 골드 나노표면 전극 상에 포획제인 콘카나발린 A(120)를 고정화시킬 수 있다. 상기 콘카나발린 A(120)는 비항체 물질로서, 타겟 대상인 노로바이러스와 선택적으로 결합할 수 있다. 상기 콘카나발린 A(120)는 완두(Canavalia ensiformis)의 종자로부터 얻어진 결정성 단백질의 하나로 알려져 있으며, 높은 친화도를 가지고 있어, 특정당류와 결합하는 생물학적 특성을 가지고 있다. 본 발명은, 이러한 상기 콘카나발린 A(120)의 당 특이적 결합성을 이용하는 것으로, 상기 생물학적 시료 수용부에 노로바이러스 시료를 접촉시키게 되면, 상기 콘카나발린 A(120)가 상기 노로바이러스가 결합하게 되면서 상기 노로바이러스를 상기 생물학적 시료 수용부에 잡아두는(capturing) 역할을 수행할 수 있다.
상기 콘카나발린 A(120)가 고정된 상기 기판(110) 상에 메르캅토헥산올(mercaptohexanol)(130)을 추가로 첨가할 수 있다. 구체적으로 이는, 상기 3차원 골드 나노표면 전극인 상기 기판(110) 상에 상기 콘카나발린 A(120)를 고정시킨 이후에, 상기 기판(110) 상에 콘카나발린 A(120)가 형성되어 있지 않아 노출된 상기 3차원 골드 나노표면 전극의 일부영역에 메르캅토헥산올(mercaptohexanol)(130)을 추가로 첨가하여, 도 2c와 같이, 상기 기판(110)의 노출된 영역을 충진하는 것일 수 있다. 상기와 같이, 상기 메르캅토헥산올(130)은 상기 기판(110) 상에 콘카나발린 A(120)가 형성되지 않아 상기 기판(130)이 노출된 영역을 인위적으로 막아줌으로써(blocking) 이 후 상기 기판(110) 상에 다른 물질이 비특이적으로 결합하지 않도록 할 수 있다. 실시예에 따라, 상기 메르캅토헥산올 대신에 milk protein, 또는 Bovine Serum Albumin(BSA) 등을 사용할 수도 있다.
상기와 같이, 본 발명의 노로바이러스 검출 센서는, 기판으로 표면적이 넓은 3차원 골드 나노표면 전극을 적용하여 센서의 민감도를 개선할 수 있어, 고감도의 검출이 가능할 수 있다. 또한, 생물학적 시료 포획제로, 값이 저렴하고 용이하게 구할 수 있는 비항체물질인 콘카나발린 A를 사용함으로써 센서 제조비용을 절감시키는 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 제공할 수 있다. 상세하게는, 상기 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법은, 생물학적 시료 수용부 및 검출신호 측정부를 포함하는 노로바이러스 검출 센서를 이용하는 것으로, 1-1) 상기 생물학적 시료 수용부의 3차원 골드 나노표면 전극 상에 고정된 노로바이러스와 결합할 수 있는 포획제인 콘카나발린 A(concanavalin A)와 노로바이러스 시료를 결합시키는 단계, 1-2) 검출신호 표지용 항체를 이용하여 상기 결합으로 조성된 결합체를 표지하는 단계, 1-3) 상기 검출신호 표지용 항체에 의해 전기화학적 신호가 생성되는 단계, 및 1-4) 상기 검출신호 측정부를 이용하여 상기 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 1-1)은 상기 생물학적 시료 수용부의 3차원 골드 나노표면 전극 상에 고정된 노로바이러스와 결합할 수 있는 포획제인 콘카나발린 A(concanavalin A)와 노로바이러스 시료를 결합시키는 단계이다.
상기 노로바이러스 검출센서에 포함된 상기 생물학적 시료 수용부는, 앞서 본 발명의 일 측면에서 설명한 바와 같이, 기판으로 3차원 골드 나노표면 전극을 사용하고, 여기에 노로바이러스를 포획할 수 있는 포획제로, 노로바이러스와 결합할 수 있는 콘카나발린 A가 고정된 것일 수 있다. 추가적으로, 상기 기판 상에는 콘카나발린 A와 함께 메르캅토헥산올이 형성되어 있을 수 있다.
상기 생물학적 시료 수용부에 노로바이러스 시료를 접촉시키면, 상기 생물학적 시료 수용부에 고정된 포획제인 상기 콘카나발린 A가 상기 노로바이러스를 포획(capture)하게 되고, 이에, 상기 노로바이러스는 상기 생물학적 시료 수용부에 고정될 수 있다. 즉, 상기 생물학적 시료 수용부의 상기 콘카나발린 A와 상기 노로바이러스가 시료가 결합된 결합체가 생성될 수 있다.
상기 단계 1-2)는 검출신호 표지용 항체를 이용하여 상기 결합으로 조성된 결합체를 표지하는 단계이다.
상기 콘카나발린 A에 의해 상기 생물학적 시료 수용부에 포획된 노로바이러스를 검출하기 위하여, 상기 노로바이러스를 검출할 수 있는 검출신호 표지용 항체를 이용할 수 있다. 여기서 "검출" 이란, 상기 노로바이러스 시료에 담긴 노로바이러스의 농도를 나타내는 정량적 측정일 수 있으며, 또는 실시예에 따라, 상기 노로바이러스 시료에서 노로바이러스 이외에 다른 바이러스, 또는 다른 미생물로부터 노로바이러스를 특이적으로 분리하여 식별할 수 있는 정성적 측정을 의미할 수 있다.
상기 검출신호 표지용 항체(Detection Anti-body)는 상기 노로바이러스와 선택적으로 결합하게 되는 항체로, 공지된 노로바이러스 항체를 사용할 수 있어 특별히 한정하지는 않는다. 이는, 노로바이러스의 항체가 노로바이러스의 유전자형 종류에 따라 동물, 또는 인체의 면역학적 저항성이 다르게 나타날 수 있어, 그 종류가 매우 다양하기 때문일 수 있다.
실시예에 따라, 상기 검출신호 표지용 항체는 1차 항체, 및 2차 항체로 구분하여, 이를 순차적으로 사용하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 검출신호 표지용 항체를 이용하여 상기 반응으로 형성된 결합체를 표지하는 단계는, 상기 결합체의 노로바이러스만을 선택적으로 결합하는 1차 항체 및 전기화학효소가 연결된 2차 항체를 순차적으로 사용하여 표지하는 것일 수 있다.
상기 1차 항체는 상기 노로바이러스와 선택적으로 결합하여 상기 노로바이러스와 항원-항체 결합을 생성할 수 있는 항체로, 상기 1차 항체가 상기 결합체에 접촉되면, 상기 결합체에 포함된 상기 노로바이러스와 상기 1차 항체가 항원-항체 결합을 형성할 수 있다. 그런 다음, 상기 1차 항체를 항원으로 인식하는 2차 항체를 사용하여, 상기 노로바이러스와 결합한 상기 1차 항체를 표지할 수 있다. 이 때, 상기 2차 항체는 전기화학 효소가 연결된 것일 수 있다.
상기 2차 항체에 연결된 상기 전기화학 효소는, 산화환원 기능이 없는 상기 결합체 및 결합체의 전기화학적 표지를 위해, 상기 2차 항체에 연결된 것일 수 있다.
상기 단계 1-3)은 상기 검출신호 표지용 항체에 의해 전기화학적 신호가 생성되는 단계이다.
구체적으로 이는, 기질에 대한 특이성이 높은 상기 전기화학 효소를 상기 2차 항체에 연결하여 최종적으로 결합체에 포함된 노로바이러스를 표지시켜, 전기화학적 촉매 작용을 할 수 있는 상기 전기화학 효소에 의해 전기화학적 신호가 생성되는 정도를 측정하여 노로바이러스를 정성적·정량적 검출 및 측정을 할 수 있게 된다. 상세하게는, 상기 전기화학 효소에 의해 전기화학 반응을 일으킬 수 있는 전기화학 측정용 물질을 주입할 수 있다. 이에, 상기 전기화학 효소는 상기 검출신호 측정부를 이용한 신호 측정시 주입되는 상기 전기화학 측정용 물질의 산화환원반응에 관여하면서, 상기 전기화학 측정용 물질을 산화시켜 전자를 발생시킬 수 있다. 이에, 상기 검출신호 측정부는, 상기 전기화학 효소에 의해 발생되는 전자의 생성량을 측정함으로써, 상기 생물학적 시료 수용부에 포획된 노로바이러스의 농도를 측정할 수 있다.
상기 전기화학 효소는, HRP(horseradish peroxidase), ALP(alkaline phosphatase), 또는 β-galactosidase를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 전기화학 효소는 pH에 따라 활성화 정도가 달라질 수 있으므로, 사용되는 효소에 따라 활성화가 최적화될 수 있는 pH를 조성하여 측정효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 전기화학 측정용액으로 4-aminophenyl phosphate(APP)를 포함한 수용액을 사용할 경우, 하기 반응식1과 같이, 상기 전기화학 효소에 의해 산화환원반응이 생성될 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112014083873255-pat00001

상세하게는, 상기 1차 항체 및 상기 전기화학 효소가 연결된 상기 2차 항체를 표지시킨 상기 생물학적 시료 수용부에 포획되어 있는 노로바이러스의 농도를 측정하기 위하여, APP를 포함한 전기화학 측정용 물질이 공급되면, 상기 2차 항체에 연결된 전기화학 효소에 의해 상기 APP가 산화되어, 상기 반응식 1과 같이, 4-aminophenol(AP)가 되고, 0.1V의 전압하에서 다시 산화되어 4-quinoneimine(QI)가 되며, 이 때 전자가 생성될 수 있다. 이와 같이, 상기 전기화학 효소에 의해 상기 전기화학 측정용 물질이 산화되면서 전자가 발생되고, 발생되는 전자의 생성량을 측정하여 상기 전기화학 효소가 연결된 2차 항체로 표지된 노로바이러스의 농도를 측정할 수 있다.
실시예에 따라, 상기 전기화학용 측정용액은 Ascorbic acid 2-phosphate (AAP), 1-naphthyl phosphate (NPP), 또는 4-amino-1-naphthyl phosphate (ANP) 등을 사용할 수도 있다.
상기 단계 1-4)는 상기 검출신호 측정부를 이용하여 상기 전기화학적 신호를 측정하는 단계이다. 구체적으로, 상기 검출신호 측정부를 이용하여, 상기 단계 1-3)에서 상기 검출신호 표지용 항체, 즉 상기 검출신호 표지용 항체와 연결된 전기화학 효소에 의해 생성되는 전기화학적 신호를 물리적 측정값으로 변환하여 측정값을 산출해내는 것일 수 있다. 상기 전기화학적 신호변환기는 공지된 장치를 사용할 수 있으므로, 특별히 한정하지는 않는다.
상기 본 발명의 검출신호 표지용 항체를 이용한 전기화학적 센싱방법은, 후술하는 도 3a 내지 도 3c를 참조하여 구체적으로 설명될 수 있으나, 도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 일 실시예로, 이에 한정되지는 않는다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법의 진행과정을 나타낸 모식도이다.
도 3a를 참조하면, 3차원 골드 나노표면 전극으로 이루어진 기판(111) 상에 메르캅토헥산올(121)과 함께 생물학적 시료 포획제인 콘카나발린 A(121)이 고정된 노로바이러스 검출 센서의 생물학적 시료 수용부에, 노로바이러스 시료를 접촉시켜, 상기 콘카나발린 A(121)가 상기 노로바이러스(201)와 결합된 결합체를 형성시킬 수 있다.
이 후, 도 3b와 같이, 상기 콘카나발린 A(121)에 의해 포획된 노로바이러스(201)만을 선택적으로 결합할 수 있는 1차 항체(310)를 상기 결합체에 표지시킬 수 있다. 상기 1차 항체(310)는 상기 결합체에 포함된 노로바이러스(201)를 선택적으로 감지하여 상기 노로바이러스(201)와 항원-항체 결합을 형성할 수 있다.
그런 다음, 도 3c와 같이, 상기 노로바이러스(201)와 결합된 상기 1차 항체(310)을 항원으로 인식하여 결합할 수 있는, 2차 항체(320)를 표지시킬 수 있다. 상기 2차 항체(320)는 전기화학 효소(325)가 연결되어 있다. 이에, 상기 노로바이러스(201)는 최종적으로 표지될 수 있고, 상기 전기화학 효소에 의해 전기화학적 신호가 생성되고, 이를 측정함으로써 노로바이러스(201)를 센싱(sensing)할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법은, 상기 노로바이러스 검출 센서의 고 민감도 및 고 선택성으로 포획된 노로바이러스에 전기화학적 효소가 연결된 검출신호 표지용 항체를 표지시킴으로써, 검출 소요시간을 감소시킬 수 있다.
또한, 상기 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 통해, 35 copies/mL 내지 60 copies/mL의 검출한계를 가질 수 있으며, 노로바이러스에 대하여 98% 이상의 검출 선택성을 가질 수 있다. 구체적으로 이는, 후술하는 실시예 및 도 6 내지 도 8을 통해 설명될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 제공할 수 있다. 구체적으로, 상기 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법은, 생물학적 시료 수용부 및 검출신호 측정부를 포함하는 노로바이러스 검출 센서를 이용하는 것으로, 2-1) 상기 생물학적 시료 수용부의 3차원 골드 나노표면 전극 상에 고정된 노로바이러스와 결합할 수 있는 포획제인 콘카나발린 A(concanavalin A)와 페리시안화 (ferricyanide)용액을 포함하는 노로바이러스 시료를 결합시키는 단계, 및 2-2) 상기 검출신호 측정장치를 이용하여 상기 페리시안화 용액의 산화환원반응으로 생성되는 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 2-1)은 상기 생물학적 시료 수용부의 3차원 골드 나노표면 전극 상에 고정된 노로바이러스와 결합할 수 있는 포획제인 콘카나발린 A(concanavalin A)와 페리시안화 (ferricyanide)용액을 포함하는 노로바이러스 시료를 결합시키는 단계이다.
상기 노로바이러스 검출센서에 포함된 상기 생물학적 시료 수용부는, 앞서 본 발명의 일 측면에서 설명한 바와 같이, 기판으로 3차원 골드 나노표면 전극을 사용하고, 여기에 노로바이러스를 포획할 수 있는 포획제로, 노로바이러스와 결합할 수 있는 콘카나발린 A가 고정된 것일 수 있다. 추가적으로, 상기 기판 상에는 콘카나발린 A와 함께 메르캅토헥산올이 형성되어 있을 수 있다.
상기 생물학적 시료 수용부에 상기 페리시안화 용액을 포함하는 노로바이러스 시료를 접촉시켜 반응시킬 수 있다. 상기 페리시안화 용액은 자가산화환원물질로, 상기 기판인 3차원 골드 나노표면 전극에 전압이 가해지면, 상기 페리시안화 용액은 상기 전극 표면에서 전자를 주고 받을 수 있다. 이러한 특징을 가진 페리시안화 용액을 노로바이러스 시료와 함께 접촉시킴으로써, 상기 시료 내 노로바이러스가 상기 노로바이러스 검출 센서의 상기 생물학적 시료 수용부에 고정된 콘카나발린 A에 포획됨에 따라, 상기 3차원 골드 나노표면 전극의 표면이 덮이게 되면서 상기 페리시안화 용액이 상기 전극과 전자를 주고 받는 면적이 감소될 수 있다. 즉, 상기 생물학적 시료 수용부에 접촉되어 상기 콘카나발린 A와 반응하는 노로바이러스의 농도가 높아질수록, 함께 공급되는 페리시안화 용액의 전기화학적 신호가 감소할 수 있다. 이에, 상기 노로바이러스 시료의 농도에 따라 상기 상기 페리시안화 용액의 산화환원반응로 생성되는 전기화학적 신호의 세기가 변화될 수 있다.
상기 단계 2-2)는 상기 검출신호 측정장치를 이용하여 상기 페리시안화 용액의 산화환원반응으로 생성되는 전기화학적 신호를 측정하는 단계이다.
상기 단계 2-1)에서 발생되는 페리시안화 용액의 산화환원반응에 따른 전기화학적 신호를 상기 노로바이러스 검출 센서의 검출신호 측정부를 이용하여 측정하는 것으로, 상기 검출신호 측정부는 상기 전기화학적 신호를 감지하여 물리적 측정값으로 나타낼 수 있는 신호변환 장치일 수 있다. 상기 검출신호 측정부는, 공지된 전기화학 신호변환 장치를 사용할 수 있으므로, 특별히 한정하지는 않는다.
상기 본 발명의 페리시안화 용액을 이용한 전기화학적 센싱방법은, 후술하는 도 4를 참조하여 구체적으로 설명될 수 있으나, 도 4는 본 발명의 일 실시예로, 이에 한정되지는 않는다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 나타낸 모식도이다.
도 4를 참조하면, 3차원 골드 나노표면 전극으로 이루어진 기판(112) 상에 메르캅토헥산올(122)과 함께 생물학적 시료 포획제인 콘카나발린 A(122) 고정된 노로바이러스 검출 센서의 생물학적 시료 수용부에 페리시안화 용액과 함께 노로바이러스 시료를 접촉시켜, 상기 콘카나발린 A(121)과 상기 노로바이러스(202)가 결합된 결합체가 형성되고, 상기 결합체에 의해 상기 기판(112)이 덮여짐에 따라 상기 페리시안화 용액의 산화환원 반응이 감소될 수 있다. 이러한 페리시안화 용액의 산화환원 반응 생성정도를 통해 상기 생물학적 시료 수용부의 콘카나발린 A(122)에 의해 포획된 상기 노로바이러스(202)의 농도를 측정할 수 있다.
상기와 같이, 상기 3차원 골드 나노표면 전극과의 산화환원반응을 통해 전기화학적 신호를 생성할 수 있는 페리시안화 용액을 노로바이러스 시료와 함께 접촉시키는, 본 발명의 전기화학적 센싱방법은, 별도의 라벨링(labeling) 없이도 노로바이러스의 존재 여부 및 농도를 측정할 수 있고, 고 민감도를 가진 3차원 골드 나노표면 전극에 의해 고감도 센싱이 가능할 수 있다.
[실시예]
<실시예1: 노로바이러스 검출 센서의 제조>
유리 기판 상에 약 30nm 두께의 크롬(Cr)박막층, 및 약 300nm 두께의 금(Au) 박막층을 순차적으로 형성한 뒤, 포토레지스트(GXR-601)로 패턴을 형성하였다. 리소그래피 공정을 수행한 뒤, 식각액(Sigma Aldrich 社)을 이용하여 상기 유리 기판에 금(Au) 박막층 및 크롬(Cr)박막층의 일부를 제거하였다. 0.5M의 황산에 용해된 3mg/ml 정도의 금(III) 클로라이드 수화물에 상기 기판을 침지시켰다. 은/염화은을 기준 전극으로 하며, 백금(Pt)을 상대전극으로 하고, 상기 기판을 작업전극으로 배치하여, -400mV의 전압을 약 400초의 시간 동안 인가하여 전기화학 증착을 수행하였다. 이에, 도 5와 같이, 3차원 나노 표면 구조를 가진 골드 전극을 형성하였다.
기판으로 사용하는 상기 3차원 골드 나노표면 전극에 완충용액인 TBS와 함께 콘카나발린 A(Con A) 100㎍/mL을 4℃ 온도에서 1시간 동안 드롭캐스팅법(drop-casting)을 이용하여 형성하였다. 상기 콘카나발린 A가 고정된 기판에 1.0 mM/ml 메캅토헥산올(mercaptohexanol)을 25℃ 온도에서 2시간 동안 드롭캐스팅법(drop-casting)을 이용하여 형성하고, 증류수(DI water)로 세척하였다.
<실시예2: 검출표지용 항체를 이용한 전기화학적 센싱방법>
상기 실시예1에서 제조된 콘카나발린 A가 고정된 3차원 골드 나노표면 전극을 4℃ 온도에서, 노로바이러스의 농도가 101 copies/mL 내지 106 copies/mL의 범위를 가지도록, 여섯 개의 농도로 나누어 배양하였다. 1차 항체를 표지하기 위해 상기 전극을 10㎍/mL 정도의 rabbit polyclonal anti-NoV 항체가 담긴 10㎕의 우유(milk)에 침지시켰다. 이 후, 전기화학 효소가 연결된 2차 항체로 1㎍/mL 정도의 anti-rabbit IgG-ALP 용액에 담가 배양하였다. 이 후, 상기 전극을 세척 완충액(1x TBS 및 0.05% Tween)으로 세정하였다.
<실험예1: 검출표지용 항체를 사용한 전기화학적 센싱방법(1)>
노로바이러스 검출을 위하여 20mM의 APP가 포함된 10mM의 MgCl2를 공급하고, 적정 pH9.6을 조성하기 위하여, 50mM Tris-HCl의 전기화학 측정용액을 함께 공급하면서 -0.2V 내지 +0.3V의 전압을 인가하였다.
도 6(a) 내지 도 6(b)는 각각 본 발명의 실시예2에서 제조된 노로바이러스 농도별 순환전압전류법 측정결과 및 산화환원전위 0.1V에서의 전기화학신호를 이용한 검정곡선을 나타낸 그래프이다.
도 6(a)를 참조하면, 상기 순환전압전류법의 측정결과에서 전류의 증가곡선은, 노로바이러스에 고정되는 전기화학 효소(ALP)가 증가하는 것을 의미하는 것으로, 이를 통해 노로바이러스 농도에 대하여 측정할 수 있다. 구체적으로, 노로바이러스의 농도가 102 copies/mL 에서 106 copies/mL로 증가할수록 전류가 전압전류곡선이 뚜렷한 곡선을 나타내며 전류강도가 증가하는 것을 확인할 수 있다.
도 6(b)를 참조하면, 노로바이러스 농도가 102 copies/mL 내지 106 copies/mL 증가함에 따라, 산화환원전위 0.1V에서 측정한 전류의 변화가 선형(linear)으로 나타나는 것을 확인할 수 있다. 또한, 상기 선형 곡선을 나타내는 측정값을 통해 본 발명의 노로바이러스 검출 센서의 검출한계가 35 copies/mL을 갖는 것을 알 수 있다. 구체적으로 이는, 상기 검출 한계는 하기와 같은 식 1에 의해서 계산될 수 있다.
Figure 112014083873255-pat00002
…… 식 1
상기 식에서, y는 검출한계이며, x 는 blank에서의 전류값에 대한 표준편차(standard deviation)이며, a는 상기 선형 곡선의 기울기값으로, blank에서의 전류값과 blank와 차이가 나는 농도에서의 전류값을 의미하는 것일 수 있다.
이에, 상기 식 1에 의해 상기 실험예1의 노로바이러스 검출 센서의 검출한계는 3*(12.95/1.1)가 되어, 35copies/mL로 도출될 수 있다.
<실험예2: 검출표지용 항체를 사용한 전기화학적 센싱방법(2)>
노로바이러스 선택적 검출 측정능력을 평가하기 위하여, 103 copies/mL 농도의 노로바이러스와 함께 A형 간염 바이러스(HAV) 및 E형 간염 바이러스(HEV)를 각각 103 copies/mL의 농도로 혼합한 뒤, 센싱하였다.
도 7은 본 발명의 실험예2에서 측정한 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법의 선택성 실험 결과이다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 노로바이러스 검출 센서가 다른 바이러스에 비해, 노로바이러스를 98%의 선택성으로 검출하는 것을 확인할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 노로바이러스 검출 센서는 표면적이 넓은 3차원 골드 나노표면 전극 상에 콘카나발린 A의 배치함으로써, 간소화된 센서장치를 통해 고 선택성의 검출효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
<실험예3: 검출표지용 항체를 사용한 전기화학적 센싱방법(3)>
10g의 상추를 상온에서 stomacher(LB-400, Sibata 사)를 이용하여 50mL의 Tris elution buffer에서 15분 정도 균질화시켰다. 이 후, 원심 분리하여 상등액을 수거하였다. 노로바이러스는 농도별로 미포함, 101 copies/mL, 102 copies/mL, 103 copies/mL, 104 copies/mL, 105 copies/mL, 및 106 copies/mL, 및 노로바이러스가 미포함된 시료로 나누어 제조하였다. 이 후, 상기 노로바이러스와 상기 상추 추출물을 혼합하여 센싱하였다.
도 8은 본 발명의 실험예3에 따른 노로바이러스 농도별 산화환원전위 0.1V에서의 전기화학적 신호를 이용한 검정곡선을 나타낸 그래프이다.
도 8을 참조하면, 노로바이러스 농도가 102 copies/mL 내지 106 copies/mL 증가함에 따라 산화환원전위 0.1V에서 측정한 전류의 변화가 선형(linear)으로 나타나는 것을 확인할 수 있다. 또한, 상기 선형 곡선을 나타내는 측정값을 상기 식 1을 통해 계산해 보면, 본 발명의 노로바이러스 검출 센서의 검출한계는 3*(21.89/1.09)가 되어, 60 copies/mL로 도출될 수 있다.
이는, 다른 이물질이 없는 순수한(pure)한 시료에서보다 다소 높은 값이지만, 노로바이러스 감염 여부를 판단하는 102 copies/mL 보다 적은 값으로, 본 발명의 노로바이러스 검출 센서 및 이를 이용한 전기화학적 센싱방법이 실제 음식물 추출용액에서도 노로바이러스를 용이하게 검출하는 것을 확인할 수 있다.
<실시예3: 페리시안화 용액을 이용한 전기화학적 센싱방법>
상기 실시예1에서 제조된 콘카나발린 A가 고정된 3차원 골드 나노표면 전극을 4℃ 온도에서, 노로바이러스가 없는 시료, 및 노로바이러스의 농도가 103 copies/mL 정도 포함된 시료로 나누어, 각각 페리시안화 용액과 함께 혼합하여 접촉시킨 뒤, 센싱하였다.
도 9는 본 발명의 실시예3에 따른 전압전류변화의 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 9를 참조하면, 0.2V에서의 노로바이러스가 없을 때와 103 copies/mL 정도 의 노로바이러스가 포함되어 있을 때의 전압전류의 측정값이 크게 차이나는 것을 알 수 있다. 이는, 노로바이러스의 유무에 따라 페리시안화 용액의 전기화학적 신호가 감소함을 나타내는 것으로, 노로바이러스의 농도가 커질수록 기판으로 사용되는 3차원 골드 나노표면 전극에 고정된 콘카나발린 A의 포획으로 전극이 노로바이러스로 덮여짐에 따라, 페리시안화 용액의 산화환원반응이 감소한 것을 의미할 수 있다.
이와 같이, 페리시안화 용액을 사용하는 전기화학적 센싱방법을 별다른 라벨링(labeling) 없이도 노로바이러스 농도에 따른 전기화학적 신호를 생성할 수 있어, 검출 소요시간 감소 효과를 가질 수 있다.
한편, 본 명세서와 도면에 개시된 본 발명의 실시예들은 이해를 돕기 위해 특정 예를 제시한 것에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시예들 이외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형 예들이 실시 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.
100: 생물학적 시료 수용부 110, 111, 112: 기판
120, 121, 122: 콘카나발린 A 130, 131, 132: 메르캅토헥산올
200, 201, 202: 노로바이러스 300: 검출신호 측정부
310: 1차 항체 320: 2차 항체
325: 전기화학 효소

Claims (11)

  1. 생물학적 시료 수용부 및 검출신호 측정부를 포함하는 노로바이러스 검출 센서에 있어서,
    3차원 골드 나노표면 전극을 기판으로 하고,
    상기 기판에 고정된 시료 포획제(capture agent)로서 상기 노로바이러스와 결합할 수 있는 콘카나발린 A(concanavalin A)를 이용하는 생물학적 시료 수용부를 포함하며,
    상기 3차원 골드 나노표면 전극은 전기화학 증착공정을 통해 형성되며,
    상기 콘카나발린 A가 고정된 기판 상에 상기 콘카나발린 A가 형성되어 있지 않아 노출된 상기 3차원 골드 나노표면 전극에 메르캅토헥산올(mercaptohexanol)을 추가로 첨가한 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 검출신호 측정부는,
    상기 생물학적 시료 수용부에서 생성되는 전기화학적 신호를 감지하여 생물학적 시료의 정성적·정량적 측정값을 산출하는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서.
  5. 청구항 1 및 4 중 어느 한 항의 노로바이러스 검출 센서를 이용하는 것으로,
    상기 생물학적 시료 수용부의 3차원 골드 나노표면 전극 상에 고정된 노로바이러스와 결합할 수 있는 포획제인 콘카나발린 A(concanavalin A)와 노로바이러스 시료를 결합시키는 단계;
    검출신호 표지용 항체를 이용하여 상기 결합으로 조성된 결합체를 표지하는 단계;
    상기 검출신호 표지용 항체에 의해 전기화학적 신호가 생성되는 단계;및
    상기 검출신호 측정부를 이용하여 상기 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 검출신호 표지용 항체를 이용하여 상기 결합으로 조성된 결합체를 표지하는 단계는,
    상기 결합체에 포함된 노로바이러스만을 선택적으로 결합하는 1차 항체 및 전기화학 효소가 연결된 2차 항체를 순차적으로 사용하여 표지하는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 결합체에 표지시킨 상기 2차 항체와 연결된 전기화학 효소에 의해 전기화학적 신호가 생성되는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 통해,
    35 copies/mL 내지 60 copies/mL의 검출한계를 갖는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법을 통해,
    노로바이러스에 대하여 98% 이상의 검출 선택성을 갖는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법.
  10. 청구항 1 및 4 중 어느 한 항의 노로바이러스 검출 센서를 이용하는 것으로,
    상기 생물학적 시료 수용부의 3차원 골드 나노표면 전극 상에 고정된 노로바이러스와 결합할 수 있는 포획제인 콘카나발린 A(concanavalin A)와 페리시안화 (ferricyanide)용액을 포함하는 노로바이러스 시료를 결합시키는 단계; 및
    상기 검출신호 측정부를 이용하여 상기 페리시안화 용액의 산화환원반응으로 생성되는 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 노로바이러스 시료의 농도에 따라 상기 페리시안화 용액의 산화환원반응로 생성되는 신호의 세기가 변화되는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 센서를 이용한 전기화학적 센싱방법.
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