CN106525793B - 一种利用荧光酶谱印迹技术检测mmp-9的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用荧光酶谱印迹技术检测MMP‑9的方法，属于生物技术技术领域，包括：1)对待检测血清样本通过凝胶浓缩蛋白法，进行孵育离心操作，将待检测血清样本中的酶浓度提高5倍；2)将浓缩后待检测血清样本采用荧光酶谱印迹法，通过电泳利用分子量区分出待检测样品中的各种酶及蛋白；3)通过毛细印迹法将步骤2)区分出的蛋白转移至硝酸纤维素膜表面，降解预先固化在硝酸纤维素膜表面的底物；4)底部被降解后，荧光基团与淬灭基团分离，在特异激发波长下发出荧光，通过检测荧光强度来判断待检测血清样本中MMP9的酶活性。本发明在保留明胶酶谱法优势的前提下，先浓缩血清，提高了检测灵敏度。然后再利用荧光酶谱印迹法，使得实验结果背景低，更灵敏，且结果可量化。

Description

一种利用荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，涉及低浓度MMP-9样品酶活性检测方法，具体涉及一种利用荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法。
背景技术
基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinase,MMP)是一组Ca2+/Zn2+依赖性中性蛋白酶，其主要功能是降解和重塑全身各种组织的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)，现已发现20多种。其中MMP2与MMP-9(明胶酶B)是基质金属蛋白酶家族中的重要成员，在一些病理过程中，这两种蛋白酶的异常激活，会降解参与血脑屏障基膜的主要成分层粘蛋白和纤粘蛋白等，破坏血脑屏障，引起血脑屏障的通透性升高或开放。
近年来研究表明MMP9与脑血管病关系密切，参与了缺血性卒中后炎症反应以及继发性脑损伤病理过程。在疾病早期检测MMPs的水平，有助于对疾病预后进行准确评估。如脑出血患者，在发病24小时内即可能检测出MMP9明显升高，并与脑水肿高峰一致。之后至72小时，MMP9的水平始终与血肿面积，水肿体积，病情严重程度呈正相关。一般认为早期即有MMP9水平高的患者预后不佳。如对MMP9水平高的患者及时干预，可能会减轻脑水肿及炎症带来的不良后果。因此对出血性疾病患者，快速准确的检测其体内MMPs蛋白酶家族，尤其是MMP9，的活性，有助于临床治疗方式的选择及准确预后评估。
MMP9在体内存在酶原和活性酶两种形式。MMP-9是以酶原的形式从胞内分泌到胞外。MMP9酶原没有酶活性，大小约为92-94KD。在生理或病理状态下，经过一系列蛋白酶(如MMP2，MMP3等)的级联反应被切除一小段肽而激活。活化的MMP9大小约为83KD。活化的MMP9可以通过a2球蛋白结合而被清除。MMP9酶原或活化形式与金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)结合而被抑制活性。TIMP与活化的MMP9结合时亲和力很高，在一般条件下难以分离。对MMP9的活性检测即是检测游离的激活后的MMP9的活性。
目前常用的MMP-9检测方法主要分为ELISA和明胶酶谱两种。其中ELISA方法可以分为两种，一种是以特异识别MMP9蛋白的一个或一组抗体，联合化学显色方法来识别样品中MMP9的浓度。由于目前抗体难以特异识别活化的MMP9，因此，此方法实际检测的是MMP9酶原形式及活化形式两者总体的浓度。另一种方式是用一个抗体将MMP9捕获至介质表面，在与MMP9的底物孵育，其中MMP9的底物已做化学分子或荧光分子标记，最后通过化学显色或荧光方法检测被捕获的MMP9的活性。此种方法可以排除酶原的干扰。但一方面抗体与MMP9结合，因空间位阻效应可能会影响酶与底物的识别效率。另一方面，血清中的成分比较复杂，存在MMP家族的其他蛋白酶，在催化部位与MMP9有共同的高序列同源性，只依靠底物序列难以区分各蛋白酶，因此此种方法的特异性完全依赖所选抗体的特异性。而实际检测过程中，血清中大量的蛋白及复杂的离子成分会严重干扰抗体的特异性。
与上述ELISA法相比，明胶酶谱法结合电泳技术及酶底物反应，是一种可靠的区分MMP9活性形式，MMP9酶原及其它蛋白酶的方法。明胶酶谱法首先通过非变性电泳，将样本中不同的蛋白根据其分子量做有效区分，比如MMP家族中与MMP9相似的MMP2的分子大小72KD，在凝胶上的位置与83KD的活化MMP9区分明显。之后凝胶中的MMP9在适宜的缓冲液中降解底物，如预先加入凝胶中的明胶。最后通过蛋白染色来确定酶活性，酶活性高的样本MMP9所在位置上降解底物更为彻底，因而染色后颜色更浅。但是传统的酶谱法在实际操作中检测灵敏度较低，结果难以量化。比如在含有底物的胶内，有些血清样本中的蛋白的迁移率收到影响，导致难以确定各蛋白分子量。有些血清样本中含有较高的总蛋白量，导致该泳道染色本底明显高于其它泳道，结果难以判断。有研究者使用无底物的凝胶进行电泳，之后采用电转的方法将蛋白转至另一张带底物的凝胶上，或直接将凝胶浸泡至底物液内。虽然这两种方法一定程度上解决底物对蛋白电泳迁移率的影响，但仍然无法避免因样本总蛋白含量不同造成最终染色本底不同，因而难以准确量化的问题。并且也引入了新的问题，前者使用电转时，局部温度或离子强度的变化可能会导致酶失活，后者使用底物浸泡的方法，在实际操作中，分子量大于几十KD底物，如明胶，难以扩散到凝胶中；较小的底物则会局部扩散，并不能得到明显的降解条带。
明胶酶谱法的另外一个难以解决的问题是，在临床应用中，区分患者有无出血倾向的MMP9浓度阈值约为50-140ng/ml，而明胶酶谱法的检测底物浓度下限约为1nM，或83ng/ml。明胶酶谱法难以满足临床检测所需的灵敏度。如果采用常规的超滤，透析，离子交换层析等实验室方法预先浓缩血清，则对设备仪器及操作者技术经验上有非常高的要求。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，该方法操作简单，检测灵敏度高，结果可量化。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种利用荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，包括以下步骤：
1)对待检测血清样本通过凝胶浓缩蛋白法，进行孵育离心操作，将待检测血清样本中的酶浓度提高5倍；
2)将浓缩后待检测血清样本采用荧光酶谱印迹法，通过电泳利用分子量区分出待检测样品中的各种酶及蛋白；
3)通过毛细印迹法将步骤2)区分出的蛋白转移至硝酸纤维素膜表面，降解预先固化在硝酸纤维素膜表面的底物；
4)底部被降解后，荧光基团与淬灭基团分离，在特异激发波长下发出荧光，通过检测荧光强度来判断待检测血清样本中MMP9的酶活性。
步骤1)中，凝胶浓缩蛋白法采用的浓缩介质为葡聚糖凝胶SephadexG-25干粉，葡聚糖凝胶SephadexG-25干粉与待检测血清样本的用量比为50mg：100μl。
步骤1)中，孵育离心操作后，待检测血清样本的体积为初始体积的1/5。
步骤3)中，预先在硝酸纤维素膜表面固化底物的操作为：将硝酸纤维素膜浸入0.1-1μM的底物液内3-5分钟，取出后于室温晾15-20分钟。
所述底物为MCA-Pro-Arg-Ser-Leu-DPA-Ser-Gly-NH2。
底物中MCA基团的最大激发波长为328nm，最大发射波长为393nm；DPA基团的最大激发波长为363nm，在410nm处有明显肩峰。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的利用荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，首先采用简化的凝胶浓缩蛋白的方法，通过简单的孵育离心操作，提高样本中酶浓度5倍，因此可提高检测灵敏度。浓缩的样本通过荧光酶谱印迹法，首先通过电泳利用分子量来区分样本中的各种酶/蛋白，再通过毛细印迹技术将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜表面，降解预先固化在膜表面的底物。后者被降解后，荧光基团与淬灭基团分离，在特异激发波长下发出荧光。通过检测荧光强度来判断样本中MMP9的酶活性。本发明采用荧光标记的底物来替代传统的明胶，完整的底物标记有荧光基团和淬灭基团，因能量共振转移(FRET)，无荧光或只有很低的荧光信号。在有MMP-9条带的地方，底物被切割，荧光基团与淬灭基团分离，会出现荧光条带。本发明采用荧光酶谱印迹法，一方面因检测的是荧光信号的变化，可以避免传统明胶酶谱法中的样本中总蛋白量不同造成的背景着色不同。另一方面，通过毛细印迹法将酶转移到硝酸纤维素膜表面，避免了通常使用的电转法引起的局部温度，离子强度变化等引起的酶失活。另外荧光酶谱印迹法与有些人所采用的底物孵育方法相比，优点在于，底物预先固化在膜表面，荧光信号变化只会在原位发生，而底物孵育方法会引物底物过小而在凝胶内扩散，或底物较大而难以扩散到凝胶内被酶降解。因此本发明在保留明胶酶谱法优势的前提下，先浓缩血清，提高了检测灵敏度。然后再利用荧光酶谱印迹法，使得实验结果背景低，更灵敏，且结果可量化。
附图说明
图1为浓缩装置示意图；
图2为毛细印迹法示意图；
图3为本发明所述方法检测低浓度标准品-血清样本酶活性与传统明胶酶谱方法的比较结果图。
其中，1为浓缩介质；2为浓缩管；3为收集管；4为管盖。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明在保留明胶酶谱法优势的前提下，加入简单的血清浓缩步骤，使样品中的酶浓度提高5倍。同时利用一种荧光标记的底物替代传统的明胶，使用毛细印迹方法将蛋白转移至硝酸纤维膜表面与底物反应，不存在其它酶谱检测方法中常见的样本中大量蛋白造成的背景着色，可明显提高检测的灵敏度，并可准确量化分析。针对血清中MMP-9浓度低，本方法在保持酶谱法检测特异性高的基础上，增加一步简单的浓缩步骤，提高灵敏度，最低检测阈值为5-10ng/ml，适用于临床血清等酶含量极低的样品的检测。同时用荧光底物替换明胶，避免背景不均一造成的检测误差，检测结果可以量化分析。
如图1所示，浓缩装置包括一个收集管3和一个浓缩管2，收集管3上有管盖4；浓缩管2底部镂空，在离心时可使液体流出至收集管3中。浓缩管的底部放置一层低蛋白吸附的0.45um孔径的PVDF膜，PVDF膜上方为浓缩介质1，即葡聚糖凝胶SephadexG-25干粉。SephadexG-25干粉为50mg时，浓缩装置适合浓缩100μl的血清。或SephadexG-25干粉为100mg时，适合浓缩200μl的血清，依次类推。血清浓缩后体积为初始体积的1/5。血清样本首先离心去除可能有的颗粒沉淀，上清直接加进浓缩管，颠倒使血清与浓缩介质充分混匀，室温15分钟。之后低转速离心，浓缩的样本流入收集管内。
浓缩后的样本电泳条件为常规的非变性电泳条件。
底物预固定的方法非常简单，即将硝酸纤维素膜浸入0.1-1μM的底物液内，3-5分钟，取出后于室温晾15-20分钟，避免过分干燥。其中底物为MCA-Pro-Arg-Ser-Leu-DPA-Ser-Gly-NH2.其中MCA的最大激发波长是328nm，最大发射波长为393nm。DPA基团最大激发波长为363nm，至410nm处有明显的肩峰。该肩峰与MCA荧光发射谱重叠，从而导致了显著的荧光猝灭。如果底物-Ser-Leu-部位被MMP9切开，MCA与DPA分离，荧光信号显著增强，约为初始状态的100倍以上。
参见图2，自下而上摆放的为盛放MMP-9反应缓冲液的容器，底座(放至容器中央)，纸巾(纸巾的边缘浸入反应缓冲液中)，4-5层滤纸，凝胶，预固定底物的硝酸纤维素膜，4-5层滤纸，硬塑料板，500g左右的重物。2-3个小时。毛细印迹法用于蛋白转膜效率实际是比较低的，因主要依靠扩散至膜附近再靠静电吸附与膜牢固结合。但在本发明里，毛细印迹法的缺点实际正是所需要的，因为酶与硝酸纤维素膜过快的结合会抑制酶的活性。通过重物压迫凝胶，使凝胶结构变形或破坏，有利于蛋白的逸出，从下而上的反应缓冲液毛细流动将带着酶流向凝胶与硝酸纤维素膜质检的缝隙处，并有充足的时间识别并降解预固定在膜上的底物。
将反应后的膜取出，用PBS缓冲液漂洗2-3次后，使用通过荧光酶标仪读数，荧光WesternBlot成像系统或落射荧光显微镜照相后分析荧光光密度值。
以下是本发明所述方法检测低浓度标准品-血清样本酶活性与传统明胶酶谱方法的比较。
一、试剂配制
1、本发明所需溶液
5×上样缓冲液：25％甘油，0.1％溴酚蓝，60mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，2％SDS；
电泳缓冲液：25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，pH 8.3；
30％的丙烯酰胺水溶液，过滤储存；
0.5mol/L Tris-HCl，pH 6.8；
1.5mol/L Tris-HCl，pH 8.8；
10％过硫酸铵；
10％TEMED；
2.5％TritonX-100溶液；
MMP-9反应缓冲液：50mM Tris，pH7.5，100mM NaCl，10mM CaCl2，50μM ZnCl2。
2、明胶酶谱法所需溶液
1％明胶贮存液：称取10mg明胶，加入去离子水，室温放置2h，使其吸水膨胀，然后65℃水浴，快速溶解成均匀液体，然后定容至10ml，4℃保存备用。
5％(w/v)考马斯亮蓝R-250：称取2g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中；量取100ml异丙醇(isopropanol)加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入40ml冰醋酸(acetic acid)，搅拌均匀；加入260ml去离子水，搅拌溶解；用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。
考马斯亮蓝脱色液：甲醇：乙酸：水＝5：1：4。
5×上样缓冲液：25％甘油，0.1％溴酚蓝，60mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，2％SDS；
电泳缓冲液(25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，pH 8.3)；
30％的丙烯酰胺溶液，过滤储存；
0.5mol/L Tris-HCl，pH 6.8；
1.5mol/L Tris-HCl，pH 8.8；
10％过硫酸铵；
10％TEMED；
2.5％TritonX-100溶液；
MMP-9反应缓冲液(50mM Tris,pH7.5,100mM NaCl,10mM CaCl2,50μM ZnCl2)。
二、样品制备
取活化的MMP9标准品与正常人血清混合，使活化MMP9终浓度为5ng/ml15ng/ml,45ng/ml,135ng/ml。
1、本发明所需样品准备方法
取混合好的血清各150-200μl，4℃，13000g离心2min。取上清100μl加入如图1所示的浓缩管中，颠倒使血清与浓缩介质充分混匀，室温静置15分钟。200g离心2min，收集管中的血清即为浓缩后的样品。取浓缩的血清样品16μl与4μl不含-巯基乙醇或其它还原剂的5×上样缓冲液于冰上混合。
2、明胶酶谱法所需样品准备方法
取混合好的血清各150-200μl，4℃，13000转/分离心2min。取16μl上清与4μl不含-巯基乙醇或其它还原剂的5×上样缓冲液混匀冰上混合。
三、配制非变性电泳凝胶
1、本发明所需凝胶准备方法
配制浓度为12.5％的分离胶：30％丙烯酰胺溶液1.6m1,pH 8.8的1.5mol/L Tris-HCl 1.0ml,蒸馏水1.4ml,10％过硫酸铵25μl,TEMED 2.5μl。
混匀后立即将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入3m1蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。聚合完成之后,倒掉覆盖液体。
配制浓度为5％的上层浓缩胶：30％丙烯酰胺溶液0.15m1,pH 6.8的0.5mol/LTris-HCl 0.35ml,蒸馏水0.5ml,10％过硫酸铵20μl,TEMED 2.0μl。
插入梳子，避免混入气泡，室温下等待凝胶聚合，分离胶及浓缩胶之间形成明显反光。
2、明胶酶谱法所需凝胶准备方法
配制浓度为12.5％的分离胶(含0.1％明胶)：30％丙烯酰胺溶液1.6m1,pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl 1.0ml,蒸馏水1.0ml,1％明胶贮存液0.4ml，10％过硫酸铵25μl,TEMED2.5μl。
混匀后立即将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入3m1蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。聚合完成之后,倒掉覆盖液体。
配制浓度为5％的上层浓缩胶的方法与上述相同。
四、电泳
本发明所述方法与明胶酶谱法相同：电泳缓冲液为pH8.8的Tris-甘氨酸缓冲液。电泳在冰浴中进行；采用垂直板式不连续系统电泳方法，5mA稳流进祥后,10mA稳流分离样品直至溴酚蓝指示剂到达分离胶的最下沿。
五、洗胶
本发明所述方法与明胶酶谱法相同：电泳结束后,用预冷的2.5％TritonX-100将胶洗一次,15min，然后用预冷的蒸馏水漂洗一次去除残留的TritonX-100，最后用室温的MMP9反应缓冲液预孵育5min。
六、底物降解及检测
1、本发明所述方法包括底物预固定膜的制备，毛细印迹，荧光密度值分析。
底物预固定膜的制备：于电泳的同时，进行底物预固定膜的制备，用MMP-9反应缓冲液将底物多肽MCA-Pro-Arg-Ser-Leu-DPA-Ser-Gly-NH2稀释为终浓度0.1-1μM，然后将底物稀释液与NC膜共同孵育2-5分钟，取出后于室温放置15-20分钟，半晾干。
毛细印迹：洗胶结束后，切掉没有上样的多余的泳道。自下而上摆放盛放MMP-9反应缓冲液的容器，底座(放至容器中央)，纸巾(纸巾的边缘浸入反应缓冲液中)，用反应缓冲液预浸湿的4-5层滤纸，凝胶，预固定底物的硝酸纤维素膜，4-5层干滤纸，硬塑料板，500g左右的重物。室温孵育1-2h。取出硝酸纤维素膜，在1XDPBS溶液中漂洗2-3次。
荧光密度值分析：通过荧光酶标仪读数或荧光WesternBlot成像系统分析荧光光密度值。
2、明胶酶谱法包括原位底物降解，考马斯亮蓝显色及脱色，照相或扫描并进行灰度值分析。
原位底物降解：洗胶结束后，换上新的MMP9反应缓冲液，室温摇动孵育1-2小时。
考马斯亮蓝显色及脱色：用5％考马斯亮蓝R-250染色30分钟后，使用考马斯亮蓝脱色液脱色，有MMP9活性的地方，为白色透明的条带。
灰度值分析：照相或扫描方法保存图片，颜色反转，使白色透明的部位变为灰色条带，使用图像分析软件分析各部位灰度值。
结果参见图3，以正常人血清梯度稀释MMP9标准品作为检测样本，用来模拟临床样品。使用明胶酶谱方法在MMP9酶低浓度下难以检测出可分析的信号。使用本发明所述方法，在5ng/ml至135ng/ml可检测出浓度梯度下的荧光信号变化，这一浓度区间也是大多数临床血清样本MMP9的浓度区间。与明胶酶谱方法比较，本发明所述方法更适于临床血清样品的检测。

Claims (4)

1.一种用于非诊断目的的荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）对待检测血清样本通过凝胶浓缩蛋白法，进行孵育离心操作，将待检测血清样本中的酶浓度提高5倍；
2）将浓缩后待检测血清样本采用荧光酶谱印迹法，通过电泳利用分子量区分出待检测样品中的各种酶及蛋白；
3）通过毛细管印迹法将步骤2）区分出的蛋白转移至硝酸纤维素膜表面，降解预先固化在硝酸纤维素膜表面的底物；
其中，预先在硝酸纤维素膜表面固化底物的操作为：将硝酸纤维素膜浸入0.1-1μM的底物液内3-5分钟，取出后于室温晾15-20分钟；所述底物为MCA-Pro-Arg-Ser-Leu-DPA-Ser-Gly-NH2；
4）底物被降解后，荧光基团与淬灭基团分离，在特异激发波长下发出荧光，通过检测荧光强度来判断待检测血清样本中MMP-9的酶活性。
2.根据权利要求1所述的用于非诊断目的的荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，其特征在于，步骤1）中，凝胶浓缩蛋白法采用的浓缩介质为葡聚糖凝胶SephadexG-25干粉，葡聚糖凝胶SephadexG-25干粉与待检测血清样本的用量比为50mg：100μl。
3.根据权利要求1所述的用于非诊断目的的荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，其特征在于，步骤1）中，孵育离心操作后，待检测血清样本的体积为初始体积的1/5。
4.根据权利要求1所述的用于非诊断目的的荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，其特征在于，底物中MCA基团的最大激发波长为328nm，最大发射波长为393nm；DPA基团的最大激发波长为363nm，在410nm处有明显肩峰。
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