CN114113017B - 一种基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，该方法采用固态纳米孔作为检测工具，使用光学和电学检测装置对待测样本在电泳过程中通过所述固态纳米孔时的电学信号和光学信号进行联合检测，并根据电学信号和光学信号对待测样本进行分析；待测样本为单分子功能蛋白待测样本和/或复合物待测样本；复合物待测样本为单分子功能蛋白与其带荧光基团的适配体结合形成。通过采集待测样本通过纳米孔的离子电流信号和荧光显微成像信号，可以实现对待测样本电学信号与光学信号的同步检测，可视化待测样本通过纳米孔易位及与适体互作的构象变化过程，是一种新型的多维度的功能蛋白检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法。
背景技术
C-反应蛋白(CRP)是由五个相同的同源亚基非共价结合而成的的五聚体蛋白，每个亚基含有206个氨基酸残基，分子量约为120KDa，每个亚基与亚基直接通过静电盐桥与两个钙离子相连，从而形成对称的环状五聚体结构。CRP是在肝脏合成的，不仅是组织炎症和感染过程的重要介质，而且与肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌和胰腺癌、骨肉瘤、肾细胞癌、心血管疾病和类风湿性关节炎等癌症进展阶段密切相关。并且，在不同疾病的不同阶段，CRP的浓度不同，通过跟踪和精确测定人体内的CRP水平可以评估炎症进展、肿瘤侵袭性和监测治疗结果。因此，CRP是肿瘤诊断和预后判断的重要生物标志物。
传统的用于C-反应蛋白的检测方法包括：荧光法、SPR法、SERS法、量子点法、电化学和光学法等多种方法。这些技术已被证明可以成功地检测CRP，但存在不同的缺点，它们通常需要较长的反应时间，较为复杂的反应步骤，且不能实现单分子尺度的分子检测。虽然传统纳米孔技术具有免标记、速度快、低成本、单分子检测等优势。然而，基于离子电流的测量，受到仪器检测限及分辨率、缺乏特异性和分子操纵性等问题的限制，不足以可视化单分子CRP通过纳米孔的易位过程及构象变化。而荧光显微镜能观察和捕获单分子信息，并能实时监测分子构象动力学，从而可以实现C-反应蛋白易位行为及与适体、抗体和配体互作的构象变化的直接可视化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，将纳米孔电学检测平台与荧光显微镜集成，构建光电联合检测的单分子分析平台。通过膜片钳采集单分子蛋白通过纳米孔的离子电流信号和荧光显微成像信号，可以实现对CRP电学信号与光学信号的同步检测，可视化CRP通过纳米孔易位及与适体互作的构象变化过程，是一种新型的多维度的CRP检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，所述方法采用固态纳米孔作为检测工具，使用光学和电学检测装置对待测样本在电泳过程中通过所述固态纳米孔时的电学信号和光学信号进行联合检测，并根据所述电学信号和光学信号对待测样本进行分析；所述待测样本为单分子功能蛋白待测样本和/或复合物待测样本；所述复合物待测样本为单分子功能蛋白与其带荧光基团的适配体结合形成。
进一步地，所述固态纳米孔的孔径为15nm；所述固态纳米孔的载体材料为硅基氮化硅薄膜；所述固态纳米孔采用介电击穿薄膜的方式制备得到。
进一步地，使用微型膜片钳对所述待测样本在偏压下进入所述固态纳米孔产生的阻塞时间、阻塞电流幅值和阻塞率进行检测；
在背光环境下，使用荧光显微镜对所述待测样本在进入所述固态纳米孔的易位过程中的构象变化进行检测；
通过所述阻塞时间、阻塞电流、阻塞率和构象变化分析待测样本的体积、表面电荷、构象、浓度。
进一步地，所述功能蛋白为单分子C-反应蛋白，所述带荧光基团的适配体为CRP－apt－Cy3。
进一步地，所述介电击穿薄膜的具体方法包括：
将预处理后的硅基氮化硅薄膜固定在流动池中并添加缓冲液；
对硅基氮化硅薄膜施加电流脉冲，将氮化硅薄膜暴露于与其介电强度相当的电场中，以介电击穿的方式形成固态纳米孔。
进一步地，所述电泳过程为：
所述流动池包括两个独立的检测腔：反式腔和顺式腔；分别在顺式腔和反式腔中添加电解液，将两个检测腔的电极连接电源，通过施加一定的电压驱使待测样本通过固态纳米孔。
进一步地，对所述硅基氮化硅薄膜进行预处理的步骤包括：
使用过热的食人鱼溶液对所述硅基氮化硅薄膜进行处理，并依次使用乙醇和超纯水去除所述硅基氮化硅薄膜表面的杂质。
进一步地，配置30nM单分子功能蛋白溶液，将该溶液溶于2M LiCl、5mM CaCl2、10mM Tris、pH 7.4的缓冲溶液中，得到单分子功能蛋白待测样本。
进一步地，在避光环境下，将150nM带荧光基团的适配体溶于2M LiCl、5mM CaCl2、10mM Tris、pH 7.4的缓冲溶液中，95℃加热5min后降至室温，将30nM单分子功能蛋白加入该适配体溶液中，孵育1h以上，得到复合物待测样本。
进一步地，在对所述待测样本进行检测前，在流动池的顺式腔加入所述待测样本，在反式腔加入含有2M LiCl、5mM CaCl2、10mM Tris、pH 7.4的缓冲溶液；
在对所述待测样本进行检测时，先使用电学检测装置获得待测样本在偏压条件下通过固态纳米孔时的电学信号，然后使用光学检测装置获得待测样本通过固态纳米孔时的光学信号，最后同时使用电学和光学检测装置获得待测样本通过固态纳米孔时的光学和电学信号。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明基于单分子固态纳米孔检测技术与荧光显微镜技术，用硅基氮化硅薄膜作为纳米孔载体材料，对C-反应蛋白与其带荧光基团的适配体结合形成的复合物进行电学维度与光学维度的信号检测。通过电学方法，分析偏压下C-反应蛋白进入纳米孔所产生的阻塞电流与阻塞时间的长短，可以得到蛋白质的体积、表面电荷、构象、浓度等信息。而引入了光学维度的检测，特别是荧光显微镜具有单分子特有的灵敏度和特异性，可以得到C-反应蛋白与适配体的复合物在易位过程中的构象变化信息。并且，电学和光学的协同效应对呈现复杂生物分子构象信息具有更高的分辨率，能获取实时可视化的单分子构象信息，对理解功能蛋白在生理环境与配体互作的构象变化及功能机制有重要参考。相较于许多传统单一的光学、电学、酶学传感方法以及单分子纳米孔不能解决的问题，如蛋白过孔时间分辨率和特异性检测的问题，可以通过该方法来解决。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明中利用固态纳米孔进行功能蛋白光电联合检测的原理示意图；
图2为本发明中光电联合检测过程中使用的流动池结构示意图；
图3为30nM的C－反应蛋白在穿过固态纳米孔时的电学信号数据图，其中a为阻塞时间柱状图，b为阻塞电流幅值柱状图，c为阻塞率柱状图；
图4为30nM的C－反应蛋白与其适配体形成的复合物在穿过固态纳米孔时的电学信号数据图，其中a为阻塞时间柱状图，b为阻塞电流幅值柱状图，c为阻塞率柱状图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中对两种待测样本进行光电联合检测，一种为C－反应蛋白(CRP)待测样本，另一种为C－反应蛋白(CRP)与其带荧光基团的适配体(CRP-apt-Cy3)形成的复合物待测样本。本实施例通过电学检测装置检测待测样本通过固态纳米孔时的电学信号，通过光学检测装置检测待测样本通过通过固态纳米孔时的光学信号，原理参见图1，分别在流动池的顺式腔和反式腔中添加电解液，将两个检测腔的电极连接电源，通过施加一定的电压驱使待测样本通过固态纳米孔。
本实施例中对待测样本进行光电联合检测的方法包括以下步骤：
(1)氮化硅芯片预处理与固态纳米孔的制备
采用的硅基氮化硅纳米芯片购于加拿大Norcada公司(膜厚：12～20nm，窗口：10-20μm2)。硅基氮化硅芯片在使用前需经过热的食人鱼溶液处理，并依次用乙醇和超纯水清洗，去除膜表面的有机与无机污染物，以得到实验预用的纳米孔。将处理后的硅基氮化硅薄膜固定在定制的flowcell流动池中，注入1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA、pH 8缓冲液，flowcell流动池的结构参见图2。通过电源表提供电流脉冲，硅基氮化硅薄膜会暴露于强度与膜的介电强度相当的电场中。强电场的电荷聚集以及热效应会在薄膜的结构缺陷处产生漏电流，从而导致膜的介电击穿并形成孔径稳定的纳米孔，纳米孔的孔径为15nm。
(2)待测样本的配置
待测样本1：配制30nM CRP溶液，将30nM CRP溶于2M LiCl、5mM CaCl2、10mM Tris、pH 7.4的缓冲溶液中，得到待测样本1。
待测样本2：配制CRP与CRP-apt-Cy3配比为1：5的复合物待测样本。在避光环境下，将150nM适配体CRP-apt-Cy3溶于2M LiCl、5mM CaCl2、10mM Tris、pH 7.4的缓冲溶液中，95℃加热5min后降至室温，将30nM CRP加入该适配体溶液中，孵育1h以上，得到CRP与CRP-apt-Cy3配比为1：5的复合物待测样本2。
(3)纳米孔与光电联合检测平台的组装
将flowcell流动池中固定硅基氮化硅薄膜的一端朝下。flowcell流动池含有两个检测腔：反式腔和顺式腔，通过Ag/AgCl电极将flowcell流动池的两个检测腔连接到e-One-HS微型膜片钳上。同时，荧光显微镜的100W水银灯置于flowcell流动池的下端，并用配备60倍物镜的荧光倒置显微镜进行观察，使用增强型电荷耦合器件(CCD)相机记录荧光图像。
(4)待测样本通过纳米孔的光电信号检测
待测样本1的检测：在flowcell流动池的顺式腔中加入待测样本1，在反式腔中仅加入含有2M LiCl、5mM CaCl2、10mM Tris、pH 7.4的缓冲溶液。开始检测时，首先仅打开e-One-HS微型膜片钳，施加100mV偏压，检测得到C-反应蛋白的电学信号；然后仅打开水银灯，并用荧光显微镜观察有无荧光信号，若有荧光信号则记录该荧光信号；最后同时打开膜片钳与荧光显微镜，同时检测其电学信号与光学信号。
待测样本2的检测：在flowcell流动池的顺式腔中加入待测样本2，在反式腔中仅加入含有2M LiCl、5mM CaCl2、10mM Tris、pH 7.4的缓冲溶液。开始检测时，首先仅打开eOne-HS微型膜片钳，施加100mV偏压，检测得到复合物的电学信号；然后仅打开水银灯，并用荧光显微镜观察有无荧光信号，若有荧光信号则记录该荧光信号；最后同时打开膜片钳与荧光显微镜，同时检测其电学信号与光学信号。
(5)分析对比数据
对比在同样的孔径下，仅通过膜片钳检测时，C-反应蛋白与复合物的电学信号大小，分析其各自的阻塞时间、阻塞电流幅值及阻塞率；然后分析在仅通过荧光显微镜检测时，C-反应蛋白与复合物各自有无荧光信号，及其强弱；最后，在同时打开膜片钳与荧光显微镜的情况下，分析C-反应蛋白与复合物的电学信号与光学信号的同步对应情况。
图3为C-反应蛋白在2M LiCl、5mM CaCl2、10mM Tris、pH 7.4电解液溶液中，检测到的阻塞时间、阻塞电流幅值及阻塞率的图。图4为复合物在2M LiCl、5mM CaCl2、10mMTris、pH 7.4电解液溶液中，检测到的阻塞时间、阻塞电流幅值及阻塞率的图。参见图3、图4可以看出，CRP复合物在不同偏压下的纳米孔易位信号具有明显特征，符合过孔时间随着电压的增大而减小且阻塞电流幅值随着电压增大而增大的基本规律。同时可以分析得到，当C-反应蛋白结合上带荧光基团的适配体后，其过孔时间从0.1594±0.0051ms增长到0.2544±0.0106ms，过孔时间得到明显延长，这是由于其复合物具有较大的空间尺寸，且复合物与纳米孔的相互作用增强；并且，发现CRP与其复合物的阻塞电流幅值与ΔI/Io分布得到了很好的区分，并且ΔI/Io从0.0752±0.0008增长到0.1071±0.00与0.1457±0.0008，这是因为大部分CRP与适配体结合形成了复合物，产生两个峰是归属于游离的CRP及与适配体结合后的复合物。因而可以证明该适配体可以与CRP进行特异性结合，且能调控CRP过孔的模式。
本实施例提供了用光电联合检测的手段对C-反应蛋白的定量检测与特异性识别的检测方法。通过光电联合检测得到的电学信号和光学信号形成数据库，对数据库进行分析能够得到更详细的C-反应蛋白的体积、表面电荷、构象、浓度等信息，还可以进行单分子穿孔速率调控和特异性检测，并且制样简单，操作便捷。通过电学信号与光学信号的对比，能够更清晰的呈现C-反应蛋白的单分子信息；并且特异性鉴别C-反应蛋白与其带荧光基团的适配体的复合物。同时，本方法也适用与其他生物功能蛋白与其适配体、抗体等相互作用的调控与检测。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (9)
1.一种基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，其特征在于:
所述方法采用固态纳米孔作为检测工具，使用光学和电学检测装置对待测样本在电泳过程中通过所述固态纳米孔时的电学信号和光学信号进行联合检测，并根据所述电学信号和光学信号对待测样本进行分析；
所述待测样本为单分子功能蛋白待测样本和复合物待测样本；
所述复合物待测样本为单分子功能蛋白与其带荧光基团的适配体结合形成；所述功能蛋白为单分子C-反应蛋白；
所述方法使用微型膜片钳对所述待测样本在偏压下进入所述固态纳米孔产生的阻塞时间、阻塞电流幅值和阻塞率进行检测；在背光环境下，使用荧光显微镜对所述待测样本在进入所述固态纳米孔的易位过程中的构象变化进行检测；通过所述阻塞时间、阻塞电流幅值、阻塞率和构象变化分析待测样本的体积、表面电荷、构象、浓度。
2.根据权利要求1所述基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，其特征在于：
所述固态纳米孔的孔径为15nm；所述固态纳米孔的载体材料为硅基氮化硅薄膜；所述固态纳米孔采用介电击穿薄膜的方式制备得到。
3.根据权利要求1所述的基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，其特征在于：
所述带荧光基团的适配体为CRP－ａｐｔ－Ｃｙ３。
4.根据权利要求２所述的基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，其特征在于，所述介电击穿薄膜的具体方法包括：
将预处理后的硅基氮化硅薄膜固定在流动池中并添加缓冲液；
对硅基氮化硅薄膜施加电流脉冲，将氮化硅薄膜暴露于与其介电强度相当的电场中，以介电击穿的方式形成固态纳米孔。
5.根据权利要求4所述的基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，其特征在于，所述电泳过程为：
所述流动池包括两个独立的检测腔：反式腔和顺式腔；分别在顺式腔和反式腔中添加电解液，将两个检测腔的电极连接电源，通过施加一定的电压驱使待测样本通过固态纳米孔。
6.根据权利要求4所述的基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，其特征在于，对所述硅基氮化硅薄膜进行预处理的具体步骤包括：
使用过热的食人鱼溶液对所述硅基氮化硅薄膜进行处理，并依次使用乙醇和超纯水去除所述硅基氮化硅薄膜表面的杂质。
7.根据权利要求1所述的基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，其特征在于：
配置３０ｎM单分子功能蛋白溶液，将该溶液溶于含有2 M LiCl、5 mM CaCl2、10 mMTris，pH 7.4的缓冲溶液中，得到单分子功能蛋白待测样本。
8.根据权利要求1所述的基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，其特征在于：
在避光环境下，将150 nM带荧光基团的适配体溶于含有2 M LiCl、5 mM CaCl2、10 mMTris，pH 7.4的缓冲溶液中，95℃加热5 min后降至室温，将30 nM 单分子功能蛋白加入该适配体溶液中，孵育1h以上，得到复合物待测样本。
9.根据权利要求5所述的基于固态纳米孔的功能蛋白光电联合检测方法，其特征在于：
在对所述待测样本进行检测前，在流动池的顺式腔加入所述待测样本，在反式腔加入含有2 M LiCl、5 mM CaCl2、10 mM Tris，pH 7.4的缓冲溶液；
在对所述待测样本进行检测时，先使用电学检测装置获得待测样本在偏压条件下通过固态纳米孔时的电学信号，然后使用光学检测装置获得待测样本通过固态纳米孔时的光学信号，最后同时使用电学和光学检测装置获得待测样本通过固态纳米孔时的光学和电学信号。
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