CN112326747A - 一种快速、超灵敏的atp检测方法及其应用 - Google Patents

一种快速、超灵敏的atp检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，所述ATP检测方法包括三个基本步骤，分别为：锥形聚合物纳米通道的制备；ATP的检测；数据处理。本发明在检测生物细胞ATP分子时，具有操作简单、耗时较少、成本较低的特点，通过设计捕获探针DNA(H1，H2)和辅助探针DNA(H3，H4)的DNA序列，实现ATP分子的特异性检测，同时具有良好的抗干扰能力，且在检测生物细胞ATP分子时无需分子标记，可实现高通量、超灵敏检测，检出限可低至pM级别，同时还可观测到单分子指纹信息。

Description

一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物细胞分子检测、诊断技术领域，尤其涉及一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)是细胞内能量来源的主要提供者，它参与细胞内的新陈代谢过程，在维持生物体正常机能方面起着重要作用。近年来，已有多种疾病被证实与ATP的含量异常有关，如心血管疾病、帕金森症和阿尔茨海默氏症。又由于细胞的增值、分化和死亡等过程均会引起ATP含量的改变，因此通过监测ATP含量的变化可用来评价药物敏感性与细胞免疫活性，进而推动细胞生理病理、癌症调控机理等方面的研究。此外，ATP也是用于治疗肌肉萎缩、脑溢血后遗症、心肌疾病、肝炎等疾病的辅酶类药物。目前，ATP的检测方法已被应用于肿瘤药物敏感性筛选、细胞凋亡检测、细胞活性和微生物含量分析等领域，但对于生物体复杂细胞环境中ATP含量的实时监测仍然存在挑战。因此，建立一种简单、快速、灵敏、准确的ATP检测方法对于临床医学诊断具有重要的指导意义。
传统的ATP的检测方法主要有电泳法、高效液相色谱法、同位素示踪法、生物发光法和化学发光法等；电泳法测定ATP，样品需先经电泳分离，然后再采用紫外光谱法进行比色分析，操作复杂；高效液相色谱法也需要复杂的分离过程，且仪器与试剂价格昂贵。同位素示踪法具有简单、灵敏等优点，但放射性同位素不利于研究者的身体健康，限制了其应用；化学发光法和生物发光法虽然具有较高的测量精度，但其方法的稳定性和特异性仍是急需待解决的难题。于是开发一种性能稳定、高灵敏度的ATP检测方法势在必行。
近年来，核酸适配体作为新兴的分子识别探针，以其高亲和力、高特异性、高稳定性与设计灵活等优点受到了研究者的青睐。于是基于荧光法、比色法和电化学法的ATP核酸探针传感方法相继出现，核酸适配体是利用指数富集配体系统进化技术筛选出的寡聚核苷酸片段，可以与目标物质高特异性、高选择性地结合。然而，单链核酸适配体序列较长，自身的构型也会发生变化，导致假阳性信号的产生，限制了其在实际样品中的应用。随后，研究者通过对核酸适配体进行裂分，获得了裂开型核酸适配体，弥补了单链核酸适配体探针的缺点。裂开型核酸探针是由两条单链寡核苷酸组成，目标分子的存在可以促使两条核酸探针相结合，使裂开型适配体彼此靠近，产生阳性信号。但上述方法大多是基于检测目标分子总体事件的平均值，背景干扰较大，并且ATP在细胞外分布较少、浓度低、流失迅速，难以检测。
因此，急需建立一种快速、超灵敏的ATP检测方法，能够快速、简便、灵敏、可靠的用于细胞内ATP的检测。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，所述ATP检测方法包括三个基本步骤，分别为：
步骤一：锥形聚合物纳米通道的制备；将厚度为8-20微米的含有单个离子轰击径迹的PET膜暴露在波长为365nm的紫外光下照射一整夜，使原存于PET膜上的细小径迹更加充分，将照射后的PET膜贴在两个聚四氟乙烯的半电解池上，使电解池形成两个相互隔离的腔体，在一侧腔体中加入9M的NaOH作为蚀刻液，另一侧加入1M的HCOOH和1M的KCl作为蚀刻阻止液，并在两侧溶液中分别插入Pt电极，在两电极间施加1V的电压进行不对称蚀刻，蚀刻过程通过皮安计监测跨膜电流来控制，当跨膜电流达到0.1nA时，停止蚀刻程序，将刻蚀液替换成刻蚀阻止液，中和刻蚀液以阻止进一步刻蚀，随后，将稀释的1M的NaOH加入到两个电解池内，并施加相同的1V的跨膜电压，当电流值达到2nA时，停止刻蚀，将PET膜取出，洗涤后备用；
步骤二：ATP的检测：将制备好的PET聚合物锥形纳米通道膜紧密地贴在两个半电解池上，将聚合物锥形纳米通道的小口端一侧作为顺式腔，大口端一侧作为反式腔，向两侧腔体中均加入1M KCl的溶液作为支持电解质，然后将两支自制的Ag/AgCl电极分别对称地插入两侧腔体中，将一系列不同浓度ATP的溶液与捕获探针DNA(H1，H2)和辅助探针DNA(H3，H4)溶液反应，然后将反应混合溶液加入大口端一侧的KCl溶液中，施加-1.0V的电压，使含ATP的dsDNA迁移通过聚合物锥形纳米通道，采用膜片钳放大器测量并同步采集通过锥形纳米通道的电流信号数据，并使用滤波器，以获得单分子检测的脉冲信号；
步骤三：数据处理：利用Clampfit和origin软件对电流信号数据中的事件脉冲频率、事件脉冲振幅、滞留时间及事件间隔进行处理分析，以获得频率-浓度线性范围图、平均电流脉冲振幅、平均滞留时间和平均事件间隔，确定待测样品中ATP的含量。
优选的，所述蚀刻液一侧的Pt电极与电源正极相连，所述刻蚀阻止液一侧的Pt电极与电源负极相连。
优选的，所述步骤二中1M的KCl溶液中包含10mM的Tris-HCl，且所述1M的KCl溶液的pH值为7.0。
优选的，所述捕获探针DNA(H1，H2)具有与待检测的ATP分子生物学相匹配的DNA序列，使得H1，H2能够将ATP捕获，同时辅助探针DNA(H3，H4)能够在ATP捕获后，被捕获探针新暴露出来的序列引发杂交链式反应，形成含有目标物ATP的长链的dsDNA，使ATP更易于被检测。
优选的，所述膜片钳放大器的采样频率为20kHz，所述滤波器频率为5kHz。
优选的，所述待测样品中ATP的含量由事件频率数对照频率-浓度线性范围图来确定，ATP的构象信息和动力学行为可通过平均电流脉冲振幅、平均滞留时间和平均事件间隔进行分析。
优选的，所述ATP检测方法的应用包括ATP相关疾病的临床诊断、ATP辅酶类药物分析、肿瘤药物敏感性筛选、细胞凋亡检测、细胞活性和微生物含量分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明在检测生物细胞ATP分子时，具有操作简单、耗时较少、成本较低的特点。
(2)本发明在检测生物细胞ATP分子时无需分子标记，可实现高通量、超灵敏检测，检出限可低至pM级别，同时还可观测到单分子指纹信息。
(3)本发明可通过设计捕获探针DNA(H1，H2)和辅助探针DNA(H3，H4)的DNA序列，实现ATP分子的特异性检测，同时具有良好的抗干扰能力。
附图说明
图1为本发明实施例中捕获探针DNA和辅助发卡DNA的DNA序列图；
图2为本发明实施例中目标物ATP的特异性识别及HCR机理示意图；
图3为本发明实施例中不含ATP的待测样品在锥形聚合物纳米通道中的易位电流-时间曲线图；
图4为本发明实施例中含有ATP的待测样品在锥形聚合物纳米通道中的易位电流-时间曲线图；
图5为本发明实施例中事件频率随ATP浓度变化的曲线图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做进一步描述：
实施例：
本发明提供一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，所述ATP检测方法包括三个基本步骤，分别为：
步骤一：锥形聚合物纳米通道的制备；将厚度为8-20微米的含有单个离子轰击径迹的PET膜暴露在波长为365nm的紫外光下照射一整夜，使原存于PET膜上的细小径迹更加充分，将照射后的PET膜贴在两个聚四氟乙烯的半电解池上，使电解池形成两个相互隔离的腔体，在一侧腔体中加入9M的NaOH作为蚀刻液，另一侧加入1M的HCOOH和1M的KCl作为蚀刻阻止液，并在两侧溶液中分别插入Pt电极，所述蚀刻液一侧的Pt电极与电源正极相连，所述蚀刻阻止液一侧的Pt电极与电源负极相连，在两电极间施加1V的电压进行不对称刻蚀，刻蚀过程通过皮安计监测跨膜电流来控制，当跨膜电流达到0.1nA时，停止蚀刻程序，将刻蚀液替换成刻蚀阻止液，中和刻蚀液以阻止进一步刻蚀，随后，将稀释的1M的NaOH加入到两个电解池内，并施加相同的1V的跨膜电压，当电流值达到2nA时，停止刻蚀，将PET膜取出，洗涤后备用；
步骤二：ATP的检测：将制备好的PET聚合物锥形纳米通道膜紧密地贴在两个半电解池上，将聚合物锥形纳米通道的小口端一侧作为顺式腔，大口端一侧作为反式腔，向两侧腔体中均加入1M KCl的溶液作为支持电解质，其中KCl溶液中包含10mM的Tris-HCl，且KCl溶液的pH值为7.0，然后将两支自制的Ag/AgCl电极分别对称地插入两侧腔体中，将一系列不同浓度ATP的溶液与捕获探针DNA(H1，H2)和辅助探针DNA(H3，H4)溶液反应，如附图2所示，其为由ATP引发的杂交链式反应过程，其中，H1和H2为ATP的捕获探针，H3和H4为上述杂交链式反应的辅助探针，当向体系中存在ATP时，H1和H2适配体共同将ATP捕获，发卡H1打开，将一部分新的序列释放出来，新暴露部分的DNA序列将作为H3和H4杂交链式反应的引发剂，使辅助探针H3和H4交替打开进行杂交反应，最后聚合成一条带切口的长链dsDNA串联体，然后将反应混合溶液加入大口端一侧的KCl溶液中，施加-1.0V的电压，使含ATP的dsDNA迁移通过聚合物锥形纳米通道，采用频率为20kHz的膜片钳放大器测量并同步采集通过锥形纳米通道的电流信号数据，并使用频率为5kHz的滤波器，以获得单分子检测的脉冲信号；
步骤三：数据处理：利用Clampfit和origin软件对电流信号数据中的事件脉冲频率、事件脉冲振幅、滞留时间及事件间隔进行处理分析，以获得频率-浓度线性范围图、平均电流脉冲振幅、平均滞留时间和平均事件间隔，确定待测样品中ATP的含量，所述待测样品中ATP的含量由事件频率数对照频率-浓度线性范围图来确定，ATP的构象信息和动力学行为可通过平均电流脉冲振幅、平均滞留时间和平均事件间隔进行分析。
具体的，所述捕获探针DNA(H1，H2)具有与待检测的ATP分子生物学相匹配的DNA序列，使得H1，H2能够将ATP捕获，同时辅助探针DNA(H3，H4)能够在ATP捕获后，被捕获探针新暴露出来的序列引发杂交链式反应，形成含有目标物ATP的长链的dsDNA，使ATP更易于被检测，且所示捕获探针DNA(H1，H2)和辅助探针DNA(H3，H4)的DNA的序列如附图1所示。
具体的，如附图3所示，在不存在ATP待测样品，仅有捕获探针DNA和辅助探针DNA的情况下，得到不含ATP待测样品在纳米通道的易位电流-时间曲线，在记录的电流-时间曲线上未观测到脉冲信号；如附图4所示，当样品中含有ATP待测样品时，在记录的电流-时间曲线上清晰的观测到了脉冲信号；如附图5所示，将ATP的浓度依次为20、200、500、1000、3000、5000、6000pM的样品重复上述步骤一至三，可绘制事件频率随ATP浓度变化的曲线图，利用该图，可对待检测样品的ATP含量进行定量分析，因此可以确定本实施例样品中的ATP浓度为500pM。
具体的，所述ATP检测方法的应用包括ATP相关疾病的临床诊断、ATP辅酶类药物分析、肿瘤药物敏感性筛选、细胞凋亡检测、细胞活性和微生物含量分析。
利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，设计出类似的技术方案，而达到上述技术效果的，均是落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 许昌学院
<120> 一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用
<140> 2020109993814
<141> 2020-09-22
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccatgcgga ggaaggtagt ctaggattcg gcgtgggtta a 41
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acctggggga gtattggg 18
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaacccacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtg 48
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtctaggat tcggcgtggg ttaacacgcc gaatcctaga ctactttg 48

Claims (7)

1.一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述ATP检测方法包括三个基本步骤，分别为：
步骤一：锥形聚合物纳米通道的制备；将厚度为8-20微米的含有单个离子轰击径迹的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜暴露在波长为365nm的紫外光下照射一整夜，使原存于PET膜上的细小径迹更加充分，将照射后的PET膜贴在两个聚四氟乙烯的半电解池上，使电解池形成两个相互隔离的腔体，在一侧腔体中加入9M的NaOH作为蚀刻液，另一侧加入1M的HCOOH和1M的KCl作为蚀刻阻止液，并在两侧溶液中分别插入Pt电极，在两电极间施加1V的电压进行不对称蚀刻，蚀刻过程通过皮安计监测跨膜电流来控制，当跨膜电流达到0.1nA时，停止蚀刻程序，将刻蚀液替换成刻蚀阻止液，中和刻蚀液以阻止进一步刻蚀，随后，将稀释的1M的NaOH加入到两个电解池内，并施加相同的1V的跨膜电压，当电流值达到2nA时，停止刻蚀，将PET膜取出，洗涤后备用；
步骤二：ATP的检测：将制备好的PET聚合物锥形纳米通道膜紧密地贴在两个半电解池上，将聚合物锥形纳米通道的小口端一侧作为顺式腔，大口端一侧作为反式腔，向两侧腔体中均加入1M KCl的溶液作为支持电解质，然后将两支自制的Ag/AgCl电极分别对称地插入两侧腔体中，将一系列不同浓度ATP的溶液与捕获探针DNA(H1，H2)和辅助探针DNA(H3，H4)溶液反应，然后将反应混合溶液加入大口端一侧的KCl溶液中，施加-1.0V的电压，使含ATP的dsDNA迁移通过聚合物锥形纳米通道，采用膜片钳放大器测量并同步采集通过锥形纳米通道的电流信号数据，并使用滤波器，以获得单分子检测的脉冲信号；
步骤三：数据处理：利用Clampfit和origin软件对电流信号数据中的事件脉冲频率、事件脉冲振幅、滞留时间及事件间隔进行处理分析，以获得频率-浓度线性范围图、平均电流脉冲振幅、平均滞留时间和平均事件间隔，确定待测样品中ATP的含量。
2.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述蚀刻液一侧的Pt电极与电源正极相连，所述蚀刻阻止液一侧的Pt电极与电源负极相连。
3.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述步骤二中1M的KCl溶液中包含10mM的Tris-HCl，且所述1M的KCl溶液的pH值为7.0。
4.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述捕获探针DNA(H1，H2)具有与待检测的ATP分子生物学相匹配的DNA序列，使得H1，H2能够将ATP捕获，同时辅助探针DNA(H3，H4)能够在ATP捕获后，被捕获探针新暴露出来的序列引发杂交链式反应，形成含有目标物ATP的长链的dsDNA，使ATP更易于被检测。
5.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述膜片钳放大器的采样频率为20kHz，所述滤波器频率为5kHz。
6.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述待测样品中ATP的含量由事件频率数对照频率-浓度线性范围图来确定，ATP的构象信息和动力学行为可通过平均电流脉冲振幅、平均滞留时间和平均事件间隔进行分析。
7.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述ATP检测方法的应用包括ATP相关疾病的临床诊断、ATP辅酶类药物分析、肿瘤药物敏感性筛选、细胞凋亡检测、细胞活性和微生物含量分析。
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