CN113430204A

CN113430204A - 一种特异性检测环丙沙星的裂开型核酸适配体及其应用

Info

Publication number: CN113430204A
Application number: CN202110563581.XA
Authority: CN
Inventors: 李胎花; 王婷; 吕新月; 宫磊; 金龙
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113430204B

Abstract

本发明公开了一种特异性检测环丙沙星的核酸适配体及其应用，属于氟喹诺酮类抗生素的检测领域。本发明的提供的包括两段核酸序列，其中一段核酸序列如SEQ ID NO.1所示，另一段核酸序列如SEQ ID NO.2所示。核酸序列如SEQ ID NO.1所示的一段在5′端修饰FAM后在缓冲液中对环丙沙星的检测实验结果表明：本发明提供的核酸适配体与环丙沙星结合的特异性强，受其他氟喹诺酮类抗生素干扰小，最低检测限低至5nM，还具有对检测环境和时间要求不严格、操作简单及检测快速的优点。

Description

一种特异性检测环丙沙星的裂开型核酸适配体及其应用

技术领域

本发明属于氟喹诺酮类抗生素的检测领域，更具体地说，涉及一种特异性检测环丙沙星的裂开型核酸适配体及其应用。

背景技术

自意大利科学家Bartolomeo Gosio在青霉中分离得到第一种抗生素--霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)以来，人类已经开发了数千种抗生素，其广泛应用于医学、畜牧及水产养殖业、农业防治等领域。抗生素按其化学结构或作用机理可分为氟喹诺酮类、四环素类、青霉素类、大环内酯类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、磺酰胺类等，其中氟喹诺酮类、大环内酯类和氨基糖苷类多用于人类临床疾病的治疗，而青霉素类、四环素类和大环内酯类则广泛应用于兽药，此外，在畜牧及水产养殖业中多种抗生素作为促生长剂而广泛使用。有数据统计，我国每年生产抗生素约21万吨，其中医疗使用约42％，畜牧和水产养殖业使用约48％。由于抗生素的滥用，而进入动物体内的抗生素不能完全被吸收，残留的抗生素随动物的尿液、粪便等进入生态环境，导致抗生素环境的诞生。进入水体、土壤中的抗生素会影响其生态系统中的微生物群落，威胁生物的正常生长及繁殖。长期暴露在抗生素环境中，势必会产生耐药性的“超级细菌”。不合理使用抗生素将损害人类的身体健康，如损伤人体器官、产生过敏反应、破坏人体免疫系统等。因此，开发具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测实时快速等优势的分析检测方法对检测环境中的抗生素具有十分重要的意义。

环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)是一种典型的氟喹诺酮类抗生素，因具有很强的抗菌性，被广泛应用于医学上预防畜禽疾病和各种细菌病原体感染引起的疾病。欧盟规定抗生素类药物在动物体内的最大残留限量为1900μg/kg。我国规定畜禽类动物的肌肉、脂肪、肝、肾食品中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量为1900μg/kg。在欧盟，牛奶中环丙沙星的最大残留水平(MRL)被设定为100μg/kg。世界卫生组织(WHO)推荐恩诺沙星最大残留量为40μg/kg。

为了减少抗生素滥用对人类健康及生态环境的危害，第一要务是检测抗生素在使用过程中释放到环境中的量，再加以限制。鉴于抗生素通常在实际样本中的残留浓度较低，高温下易氧化分解，化学热稳定性差等，对抗生素的检测方法和仪器设备要求很高。现阶段，对抗生素的检测方法多为理化检测方法和免疫检测方法。常用的理化检测方法主要包括：高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、分子印迹固相萃取、酶联免疫吸附测定(ELISA)和分光光度法等是检测中常用的方法。这些方法虽能够准确的检测出抗生素的含量及种类，但这些方法一般存在耗时、操作复杂、检测仪器昂贵、携带不方便、需要专业的技术人员等问题。因此，开发具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测实时快速等优势的分析检测方法。适配体传感器的开发和应用则能有效地解决上述检测方法存在的缺陷。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种特异性检测环丙沙星的核酸适配体。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述特异性检测环丙沙星的核酸配体的具体应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种特异性检测环丙沙星的核酸配体，包括两段核酸序列，其中一段核酸序列如SEQ ID NO.1所示，另一段核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的核酸适配体为人工合成或PCR扩增后单链化获得。

进一步地，所述的核酸序列如SEQ ID NO.1所示的一段在5′端修饰纳米物质、荧光物质、相关酶类材料或生物素。

进一步地，所述荧光物质为FAM。

所述的特异性检测环丙沙星的核酸适配体在定性检测氟喹诺酮类抗生素环丙沙星中的应用。

所述的特异性检测环丙沙星的核酸适配体在定量检测氟喹诺酮类抗生素环丙沙星中的应用。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

1)相对于其他适配体传感器，本发明只需环丙沙星的适配体链，能够降低花费，还具有操作简单及检测快速的优点，对检测环境和时间要求不严格；

2)特异性强，受其他氟喹诺酮类抗生素干扰小，如氧氟沙星、培氟沙星、恩氟沙星、诺氟沙星，使用该方法检测环丙沙星时，可以排除样品中其他氟喹诺酮类抗生素的影响，实验结果更加准确。

3)灵敏度高，环丙沙星的最低检测限为5nM。

附图说明

图1是FAM标记的裂开型核酸适配体传感器检测环丙沙星的工作原理图；

图2是一定浓度的CIP分别对裂开型核酸适配体分段组合1、2、3中的FAM的猝灭效应图；

图3是缓冲液对CIP淬灭FAM荧光强度的影响；

图4是适配体浓度对CIP淬灭FAM荧光强度的影响；

图5是孵育时间对CIP淬灭FAM荧光强度的影响；

图6是不同浓度的CIP通过与适配体特异性结合，对FAM荧光强度的影响曲线图，固定激发波长为480nm；

图7是加入环丙沙星体系溶液中FAM荧光强度和空白对照体系溶液中FAM的荧光强度的差值随环丙沙星浓度变化的标准曲线图；

图8是特异性分析实验图(所有抗生素的浓度为10μM)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1：

一、适配体的设计

裂开型核酸适体是将原始完整的核酸适配体在恰当的位置断裂成两个或两个以上片段，这些片段能够特异性识别目标物，当目标物存在时与目标物结合形成复合体，使适配体片段之间相互靠近，从而激发检测信号的产生。本实施例利用的CIP的完整核酸适配体链由98-mer DNA序列组成。为了有效降低DNA探针序列的长度，进而降低合成成本及提高荧光素修饰的核酸适配体片段的纯化率，更重要的是能有效避免长序列DNA探针易形成二级结构的缺陷，有利于识别构型的形成，本实施例设计裂开型核酸适配体中一段长度不超过59-mer DNA，并在其中的核酸序列一段中的5’端或者3’端修饰了FAM。

二、适配体断点的确定

将环丙沙星的适配体裂成A、B两段，其中一段链修饰荧光素FAM，而另一端链无任何修饰。

适配体1：

1A段：

5′-ATACCAGCTTATTCAATTGCAGGGTATCTGAGGCTTGATCTACTAAATGTCGTGGGGCA-3′

1B段-FAM：

5′-TTGCTATTGGCGTTGATACGTACAATCGTAATCAGTTAG-3′-FAM

适配体2：

2A段-FAM：

FAM-5′-ATACCAGCTTATTCAATTGCAGGGTATCTGAGGCTTGATCTACT-3′

2B段：

5′-AAATGTCGTGGGGCATTGCTATTGGCGTTGATACGTACAATCGTAATCAGTTAG-3′

适配体3：

3A段-FAM：

FAM-5′-ATACCAGCTTATTCAATTGCAGGGTATCTGAGGCTTGA-3′

3B段：

5′-TCTACTAAATGTCGTGGGGCATTGCTATTGGCGTTGATACGTACAATCGTAATCAGTTAG-3′

在若干支1.5mL离心管中分别加入94.6μL pH＝7.65 10mM Tris-HCl缓冲溶液，接着在离心管中分别加入2.2μL 25μM Aptamer A(1A/2A/3A)和2.2μL 25μM Aptamer B(1B/2B/3B)，用金属浴95℃加热5min后，在冰水混合物中静置1min，最后加入11μL不同浓度的环丙沙星，在30℃条件下静置反应2h。用PerkinElmer荧光分光光度计在激发波长480nm处测荧光。

在含钾离子、镁离子的缓冲溶液中，当CIP存在时会与适配体A-FAM链和B链结合，会形成适配体A-FAM/适配体B/CIP复合体，此时CIP使FAM荧光猝灭(图1)。采用荧光分光光度计测定不同浓度环丙沙星体系溶液中FAM荧光强度和空白对照体系溶液中FAM的荧光强度的差值作为纵坐标，以环丙沙星的浓度作为横坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示，在设计的1，2，3核酸链组合中选取最佳性能的核酸链组合2，以下实验均以核酸链组合2进行。

三、缓冲液的确定

在若干支1.5mL离心管中分别加入含不同浓度的K⁺和Mg²⁺的94.6μL pH＝7.4 10mMPBS和pH＝7.5 10mM Tris-HCl缓冲溶液，接着在离心管中分别加入2.2μL 25μM Aptamer A和2.2μL 25μM Aptamer B，用金属浴95℃加热5min后，在冰水混合物中静置1min，最后加入11μL不同浓度的环丙沙星，在30℃条件下静置反应2h。用PerkinElmer荧光分光光度计在激发波长480nm处测荧光。由图3可以看出，虽在含1mM K⁺、5mM Mg²⁺的PBS缓冲溶液中，体系的荧光猝灭效果最明显，但从整体来说，Tris-HCl缓冲溶液使溶液体系更稳定。含1mM K⁺、1mMMg²⁺的Tris-HCl缓冲溶液对荧光猝灭值较大，为适配体与目标物结合及CIP与FAM之间发生内滤效应提供了一个良好的环境。因此，选取10mM、pH 7.5的Tris-HCl缓冲溶液(含1mM K⁺、1mM Mg²⁺)作为缓冲溶液。图3中1、2、3、4、5分别代表缓冲溶液中无K⁺或Mg²⁺、1mM K⁺、5mM Mg² ⁺、1mM K⁺/1mM Mg²⁺和1mM K⁺/5mM Mg²⁺。

四、适配体浓度的确定

在若干支1.5mL离心管中分别加入94.6μL pH＝7.5 10mM Tris-HCl缓冲溶液，缓冲溶液含1mM K⁺/1mM Mg²⁺，接着在离心管中分别加入2.2μL 0.5/1/2.5/10/25μM AptamerA和2.2μL 0.5/1/2.5/10/25μM Aptamer B，用金属浴95℃加热5min后，在冰水混合物中静置1min，最后加入11μL不同浓度的环丙沙星，在30℃条件下静置反应1h。用PerkinElmer荧光分光光度计在激发波长480nm处测荧光。结果如图4所示，随着环丙沙星适配体浓度的增加，FAM的荧光猝灭值先增加后减少，当适配体浓度为200nM时，荧光猝灭效果最明显。因此，选取200nM为最佳适配体浓度。五、孵育时间的确定

在若干支1.5mL离心管中分别加入94.6μL pH＝7.5 10mM Tris-HCl缓冲溶液，缓冲溶液含1mM K⁺/1mM Mg²⁺，接着在离心管中分别加入2.2μL 10μM Aptamer A和2.2μL 10μMAptamer B，用金属浴95℃加热5min后，在冰水混合物中静置1min，最后加入11μL不同浓度的环丙沙星，在30℃条件下静置反应0.5h/1h/2h/3h。用PerkinElmer荧光分光光度计在激发波长480nm处测荧光。结果如图5所示，在加入环丙沙星后，随着结合时间的延长，CIP猝灭FAM的荧光强度先增加后减少，当结合时间为2h时，猝灭的荧光强度最大。因此，选取2h为最适结合时间。

五、标准曲线的建立

设置环丙沙星的浓度梯度为0nM、10nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1000nM、5000nM、8000nM，且每个浓度设计四组平行试验。在离心管中分别加入94.6μL pH＝7.6510mM Tris-HCl缓冲溶液，缓冲溶液含1mM K+/1mM Mg2+，接着在离心管中分别加入2.2μL10μM Aptamer A和2.2μL 10μM Aptamer B，用金属浴95℃加热5min后，在冰水混合物中静置1min，最后加入11μL一系列浓度梯度的环丙沙星，在30℃条件下静置反应2h。用PerkinElmer荧光分光光度计在激发波长480nm处测荧光。最后选取在激发波长为480nm的荧光波谱图，取520nm处的荧光强度绘制标准曲线，以环丙沙星浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程及相关系数。如图6和7所示，在环丙沙星的浓度在0-8000nM范围内，相对荧光强度与环丙沙星浓度之间线性关系为y＝0.2884x+0.3047，R²＝0.9994，表明相关性很高。环丙沙星的最低检出限为：5nM。

六、特异性分析

在若干支1.5mL离心管中分别加入94.6μL pH＝7.65 10mM Tris-HCl缓冲溶液，缓冲溶液含1mM K⁺/1mM Mg²⁺，接着在离心管中分别加入2.2μL 10μM Aptamer A和2.2μL 10μMAptamer B，用金属浴95℃加热5min后，在冰水混合物中静置1min，最后依次加入11μL10pM氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星(CIP)、恩氟沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、培氟沙星(PEF)、诺氟沙星(NOR))，在30℃条件下静置反应2h。每种抗生素做三组平行样，空白样加入11μL0.005M的氢氧化钠，用PerkinElmer荧光分光光度计在激发波长480mm处测荧光。由图8可知，其他氟喹诺酮类的抗生素对本发明的影响不大，该检测方法对环丙沙星的检测具有良好的特异性。

七、实际水样中的回收率实验

在超纯水、饮用水、湖水、自来水四种水质中配置CIP的浓度为200nM，重复三组实验。在若干支1.5mL离心管中分别加入94.6μL pH＝7.65 10mM Tris-HCl缓冲溶液，缓冲溶液含1mM K⁺/1mM Mg²⁺，接着在离心管中分别加入2.2μL 10μM Aptamer A和2.2μL 10μMAptamer B，用金属浴95℃加热5min后，在冰水混合物中静置1min，最后依次加入11μL含有200nM CIP的超纯水、饮用水、河水、湖水、自来水，在30℃条件下静置反应2h。空白样加入11μL 0.005M的氢氧化钠，用PerkinElmer荧光分光光度计在激发波长480nm处测荧光。

如表1所示，饮用水、湖水、自来水三种水质中CIP的浓度检测结果在数值上没有明显差异。由结果可知CIP在不同水样中的回收率分别为：农夫山泉纯净水94.21％、洪泽湖105.47％、玄武湖101.94％、南京林业大学自来水104.84％。结果表明，该检测方法在实际水样中检测CIP具有准确性和可靠性。

表1不同水样中CIP的回收率

需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种特异性检测环丙沙星的裂开型核酸适配体及其应用

<130> 100

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 2A段-FAM序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataccagctt attcaattgc agggtatctg aggcttgatc tact 44

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 2B段序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaatgtcgtg gggcattgct attggcgttg atacgtacaa tcgtaatcag ttag 54

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 1A段序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataccagctt attcaattgc agggtatctg aggcttgatc tactaaatgt cgtggggca 59

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 1B段-FAM序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgctattgg cgttgatacg tacaatcgta atcagttag 39

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 3A段-FAM序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ataccagctt attcaattgc agggtatctg aggcttga 38

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 3B段序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctactaaat gtcgtggggc attgctattg gcgttgatac gtacaatcgt aatcagttag 60

Claims

1.一种特异性检测环丙沙星的核酸适配体，其特征在于，包括两段核酸序列，其中一段核酸序列如SEQ ID NO.1所示，另一段核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体为人工合成或PCR扩增后单链化获得。

3.根据权利要求1所述特异性检测环丙沙星的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸序列如SEQ ID NO.1所示的一段在5′端修饰纳米物质、荧光物质、相关酶类材料或生物素。

4.根据权利要求2所述特异性检测环丙沙星的核酸适配体，其特征在于，所述荧光物质为FAM。

5.权利要求1-4任一项所述的特异性检测环丙沙星的核酸适配体在定性检测环丙沙星中的应用。

6.权利要求1-4任一项所述的特异性检测环丙沙星的核酸适配体在定量检测环丙沙星中的应用。