WO2021230267A1 - 金被覆銀ナノプレートの懸濁液、その用途及び製造方法、並びにイムノクロマトキット - Google Patents

金被覆銀ナノプレートの懸濁液、その用途及び製造方法、並びにイムノクロマトキット Download PDF

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suspension
silver nanoplate
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coated silver
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芳和 宗
暁生 ▲高▼山
愛美 中村
重明 鈴木
雄太 宮澤
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    • C23C18/31—Coating with metals
    • C23C18/42—Coating with noble metals
    • C23C18/44—Coating with noble metals using reducing agents

Definitions

  • the present invention relates to a suspension of a gold-coated silver nanoplate having a silver nanoplate as a core and a gold layer covering the silver nanoplate, and its use and manufacturing method.
  • the present invention also relates to an immunochromatographic kit, and more particularly to an immunochromatographic kit using a gold-coated silver nanoplate.
  • silver nanoplates absorb light by interaction with light (localized surface plasmon resonance: LSPR), it is known that the suspension shows a color according to the shape of the nanoplate. It is also known that the absorbed light can be changed, that is, the color can be changed by controlling the size and shape of the silver nanoplate.
  • silver nanoplates are dissolved by oxidation and their shape changes. This oxidation-induced change in the shape of the silver nanoplates can cause the intended color change. Therefore, in order to stabilize the silver nanoplate against oxidation, the surface of the silver nanoplate is coated with gold.
  • Patent Document 1 describes that gold-coated silver nanoplates are stable and can be suitably used for an immunochromatographic test.
  • Patent Document 2 prepares a gold-coated silver nanoplate in the form of a stable suspension by adjusting the concentration and pH of the water-soluble polymer, and labels the detection reagent of the test substance (for example, of the target protein). It is described that it is used as an antibody label used for detection) and applied to detect various test substances with high sensitivity. Further, Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 3 describe gold-coated silver nanoplates having a thick gold layer and a large particle size. However, in any prior art document, a gold-coated silver nanoplate having a thick gold layer relative to the size of the core silver nanoplate (for example, a gold-coated silver nanoplate having a relatively thick gold layer and a small particle size). Plate) is not listed.
  • test strip As a test strip used for an immunochromatographic test, a "half strip” composed of a membrane and an absorption pad and a “full strip” having a sample pad and a conjugate pad in addition to the "half strip” are known. "Full strip” is widely sold. In the half strip, the test substance detection reagent is used as the developing solution, but in the full strip, the test substance detection reagent is impregnated into the conjugate pad and dried, so the sample containing the test substance is applied to the sample pad. You can use it just by doing it. On the other hand, neither prior art document describes the use of gold-coated silver nanoplates with a thick gold layer in the immunochromatographic test.
  • the gold-coated silver nanoplate having a thin gold layer which has been conventionally used for the immunochromatographic test, can be suitably used for the half strip, but the color development property may be deteriorated in the full strip. It was considered that the cause was that the gold-coated silver nanoplate was deteriorated by oxidation by impregnating the conjugate pad with the detection reagent of the test substance containing the gold-coated silver nanoplate and drying it.
  • the gold-coated silver nanoplates with a thin gold layer had insufficient oxidation resistance, and therefore the detection sensitivity of the immunochromatographic test was not sufficient. Therefore, another aspect of the present invention is to provide an immunochromatographic kit using a gold-coated silver nanoplate having high oxidation resistance.
  • the present inventors use a gold ion complexing agent when coating the silver nanoplate with gold, and adjust the balance between the silver concentration and the gold concentration.
  • a gold-coated silver nanoplate having a thick gold layer for a small particle size can be stably produced, and the present invention has been completed. That is, the present invention relates to a suspension of gold-coated silver nanoplates shown below, a dried product thereof, and a method for producing the suspension, a method for detecting a test substance using the suspension, and a method for detecting the test substance. It provides a kit.
  • the average particle size of the silver nanoplate is 55 nm or less, and the gold layer is formed on the main plane and the end face of the silver nanoplate.
  • the ratio (T / D) of the average thickness (T) of the gold layer on the end face to the average particle size (D) of the silver nanoplate is 0.05 or more.
  • the suspension has a maximum absorption wavelength in the visible light region, and the ratio of the extinction degree (E max ) at the maximum absorption wavelength to the extinction degree (E 900 ) at the wavelength of 900 nm of the suspension (E max / E 900). ) Is 5 or more, suspension.
  • a kit for detecting a test substance which comprises the suspension according to any one of the above [1] to [6] or the dried product according to the above [7].
  • a coating mixture containing a silver nanoplate having an average particle size of 55 nm or less, a gold-containing water-soluble compound, and a gold ion complexing agent is prepared to form the gold layer on the main plane and end face of the silver nanoplate.
  • the ratio (T / D) of the average thickness (T) of the gold layer on the end face to the average particle size (D) of the silver nanoplate is 0.05 or more.
  • the silver concentration (C Ag) is 0.25mM hereinafter gold concentration (C Au) is not less than 0.1 mM
  • the ratio of C Au for C Ag (C Au / C Ag ) is A manufacturing method of 0.50 or more.
  • a mixed solution of the suspension and the specific binding substance for the test substance is prepared to support the specific binding substance, which comprises a step of contacting the gold-coated silver nanoplate with the specific binding substance. It is a method of manufacturing gold-coated silver nanoplates.
  • the average particle size of the silver nanoplate is 55 nm or less, and the gold layer is formed on the main plane and the end face of the silver nanoplate.
  • the ratio (T / D) of the average thickness (T) of the gold layer on the end face to the average particle size (D) of the silver nanoplate is 0.05 or more.
  • the suspension has a maximum absorption wavelength in the visible light region, and the ratio of the extinction degree (E max ) at the maximum absorption wavelength to the extinction degree (E 900 ) at the wavelength of 900 nm of the suspension (E max / E 900). ) Is 5 or more, A production method in which the quenching degree of the suspension at the maximum absorption wavelength is 2 or more, and the concentration of the specific binding substance in the contacting step is 100 ⁇ g / mL or less with respect to the total volume of the mixed solution.
  • the extinction degree of the suspension at the maximum absorption wavelength is 100 or less, and / or The production method according to the above [13], wherein the concentration of the specific binding substance in the contact step is 0.5 ⁇ g / mL or more with respect to the total volume of the mixed solution.
  • An immunochromatographic kit in which the average thickness of the gold layer is more than 1.0 nm, and the gold-coated silver nanoplate carries a specific binding substance for detection of the test substance [16] The immunochromatographic kit according to the above [15], wherein the average thickness of the gold layer is 1.5 nm to 10.0 nm. [17] The immunochromatographic kit according to the above [15] or [16], wherein the gold-coated silver nanoplate is included in a dry state. [18] The immunochromatographic kit according to any one of [15] to [17], wherein the test strip contains a conjugate pad containing the gold-coated silver nanoplate. [19] The gold layer is formed on the main plane and the end face of the silver nanoplate.
  • the immunochromatographic kit according to item 1. [20] The immunochromatographic kit according to any one of [15] to [19] above, wherein the silver nanoplate as the core has an average particle size of 55 nm or less. [21] The gold-coated silver nanoplate has a maximum absorption wavelength in the visible light region, and the extinction degree (E max ) at the maximum absorption wavelength with respect to the extinction degree (E 900) at a wavelength of 900 nm of the gold-coated silver nanoplate.
  • the sample contains a plurality of types of test substances, and the sample contains a plurality of types of test substances. A capture-specific binding substance for each of the plurality of types of test substances is immobilized on the membrane.
  • control-specific binding substance comprises an antibody
  • capture-specific binding substance comprises an antibody
  • the antibody of the control-specific binding substance is a host animal different from the antibody of the capture-specific binding substance.
  • the test substance contains at least one selected from the group consisting of influenza virus antigen and coronavirus antigen.
  • the silver concentration is set to a certain value or less
  • the gold concentration is set to a certain value or more
  • both concentrations are predetermined.
  • a gold-coated silver nanoplate having a thick gold layer for a small particle size can be stably produced. Therefore, it is possible to produce a gold-coated silver nanoplate having an excellent oxidation resistance and a small particle size.
  • the gold-coated silver nanoplate having a small particle size has a maximum absorption wavelength in the visible light region, it is possible to achieve multicoloring of a method for detecting a test substance that requires visual determination such as immunochromatography. Further, since the gold-coated silver nanoplate having a small particle size and a thick gold layer has high dispersibility and can efficiently support a specific binding substance to a test substance, the amount of the specific binding substance used can be increased. It is possible to save money.
  • the spectroscopic spectrum of the suspension of gold-coated silver nanoplates (Ag @ Au suspensions 1 to 3) is shown.
  • the transmission scanning electron microscope (STEM) observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 1 is shown.
  • the STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 2 is shown.
  • the STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 3 is shown.
  • the spectroscopic spectrum of the suspension of gold-coated silver nanoplates (Ag @ Au suspensions 4 and 5) is shown.
  • the STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 4 is shown.
  • the STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 5 is shown.
  • the high-angle scattering annular dark-field scanning transmission microscope (HAADF-STEM) observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 4 is shown.
  • the spectroscopic spectrum of the suspension of gold-coated silver nanoplates (Ag @ Au suspensions 6 and 7) is shown.
  • the STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 6 is shown.
  • the STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 7 is shown.
  • the spectroscopic spectrum of the suspension (Ag @ Au suspension 8) of the gold-coated silver nanoplate is shown.
  • the effect on the spectroscopic spectrum due to the addition of the aqueous sodium chloride solution is shown.
  • the effect on the spectroscopic spectrum due to the addition of the aqueous sodium chloride solution is shown.
  • the spectroscopic spectrum of the suspension (Ag @ Au suspension 9-11) of the gold-coated silver nanoplate is shown.
  • the STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 9 is shown.
  • the STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in the Ag @ Au suspension 10 is shown.
  • the HAADF-STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in Ag @ Au suspension 9 is shown.
  • the HAADF-STEM observation photograph of the gold-coated silver nanoplate in the Ag @ Au suspension 10 is shown.
  • the spectroscopic spectrum of the suspension (Ag @ Au suspension 12-14) of the gold-coated silver nanoplate is shown.
  • the present invention relates to a suspension of a gold-coated silver nanoplate having a silver nanoplate as a core and a gold layer covering the silver nanoplate.
  • silver nanoplate refers to plate-like particles made from silver that have a size on the order of nanometers (nm), and are the upper and lower surfaces of the main plane, as well as the lower surface.
  • the end face (side surface) between the upper surface and the lower surface is provided, and the end face may be a flat surface or a curved surface, and the corners may be rounded.
  • the shape of the upper surface and the lower surface of the silver nanoplate is not particularly limited, and may be, for example, a polygon such as a triangle, a quadrangle, a pentagon, or a hexagon (including a shape with rounded corners) or a circle. ..
  • the gold layer is formed on the main plane and the end face of the silver nanoplate, and a so-called silver nanoplate and a core-shell structure of the gold layer are formed.
  • the maximum major axis of the main plane of the silver nanoplate is called the particle diameter, which corresponds to the diameter in the case of a circle and the length of the maximum side in the case of a triangle, for example.
  • the average particle size of the silver nanoplates used in the suspension of the present invention is about 55 nm or less, preferably about 50 nm or less, about 40 nm or less, or about 30 nm or less.
  • the lower limit of the average particle size of the silver nanoplate is not particularly limited, but may be, for example, about 1 nm or more, preferably about 10 nm or more.
  • the average thickness of the silver nanoplate is not particularly limited, but may be, for example, about 20 nm or less, preferably about 3 to about 15 nm.
  • the particle size and thickness of the silver nanoplate may be measured by, for example, observation with a scanning electron microscope (SEM), observation with a scanning transmission electron microscope (STEM), or observation with a transmission electron microscope (TEM).
  • the particle size may be measured by a dynamic light scattering type particle size distribution measuring device (DLS).
  • DLS dynamic light scattering type particle size distribution measuring device
  • the upper and lower parts are obtained from a total of 100 points of data obtained by measuring the particle size of 100 arbitrary silver nanoplates.
  • the average particle size may be calculated by preparing 80 points of data excluding 10% and obtaining the average value thereof.
  • the ratio of the width of the axis orthogonal to the plane containing the maximum major axis, that is, the index defined by "maximum major axis / thickness" is called “aspect ratio", which is one of the indexes for expressing the shape of the nanoplate. It can be used as one. Since the position of the maximum absorption wavelength changes when the shape of the silver nanoplate changes, the aspect of the silver nanoplate can be said to be an index of the maximum absorption wavelength.
  • the aspect ratio of the silver nanoplate is not particularly limited, but may be, for example, larger than about 1, preferably about 1.5 to about 10. When the aspect ratio is in such a range, it is easy to adjust the maximum absorption wavelength due to surface plasmon resonance in the aqueous suspension to the visible light region.
  • the ratio (T / D) of the average thickness (T) of the gold layer on the end face to the average particle size (D) of the silver nanoplate is about 0.05 or more. , It is preferably formed to be about 0.1 or more, and more preferably about 0.16 or more. In some embodiments, the T / D may be about 0.5 or less, about 0.4 or less, or about 0.3 or less. In some embodiments, the average thickness of the gold layer is from about 1.5 nm to about 10.0 nm or from about 2.0 nm to about 10.0 nm, preferably from about 2.0 nm to about 8.0 nm.
  • the thickness of the gold layer on the end face can be measured using a high-angle scattering annular dark-field scanning transmission electron microscope (HAADF-STEM). Specifically, for 10 arbitrary particles selected from the HAADF-STEM observation photograph, 10% above and below were excluded from the data of a total of 100 points in which the thickness of gold was measured at 10 arbitrary ends of each particle.
  • the average thickness (T) may be calculated by preparing data of 80 points and obtaining the average value thereof.
  • the thickness of the gold layer on the end face can be calculated from the size of the silver nanoplate before and after the gold coating measured by using a transmission scanning microscope.
  • the average thickness (T) can be calculated by.
  • the shape of the main plane of the silver nanoplate is an equilateral triangle
  • the average thickness (T) can be calculated by.
  • the color tone of the suspension of the present invention is adjusted by adjusting the size and / or shape of the core silver nanoplate and the thickness of the gold layer, and changing the maximum absorption wavelength of the gold-coated silver nanoplate. It is possible to do. That is, the size and shape of the silver nanoplate are adjusted so that the suspension of the present invention has a maximum absorption wavelength in the visible light region in consideration of the subsequent change in the maximum absorption wavelength due to the gold coating. In some embodiments, the maximal absorption wavelength is present in the range of about 400 nm to about 680 nm.
  • the gold-coated silver nanoplates in the suspension of the present invention have high particle size uniformity, so that the suspension exhibits a sharp spectroscopic spectrum. That is, the color of the suspension of the present invention is vivid and the saturation is high.
  • the ratio of the extinction degree (E max) at the maximum absorption wavelength for the extinction degree (E 900) at a wavelength of 900nm of the suspension (E max / E 900) is about 5 or more, preferably about 10 or more.
  • the suspension of the invention may have a degree of quenching at the maximum absorption wavelength of about 2 or more or about 4 or more, preferably about 2 to about 100, more preferably about 2 to about 50. , Or about 2 to about 20.
  • the gold-coated silver nanoplates in the suspension of the present invention have a thick gold layer and therefore can exist stably even at a high concentration.
  • the silver nanoplate for preparing the gold-coated silver nanoplate in the suspension of the present invention those usually used in the art can be adopted without particular limitation, and for example, a commercially available product. May be used, or those manufactured according to a known production method or the method described in Examples described later may be used.
  • a commercially available product May be used, or those manufactured according to a known production method or the method described in Examples described later may be used.
  • simply increasing the concentration of gold in the coating step makes silver more than gold.
  • the electronegativity is low, electrons are emitted and easily ionized, and as a result, silver is eluted from the silver nanoplate of the core and the optical characteristics change before and after coating.
  • the silver nanoplate in the suspension of the present invention has a relatively small particle size and a large specific surface area, and is therefore susceptible to oxidation. Furthermore, when the grown gold layer comes into contact with the gold layer of other particles, agglomerates are formed. Therefore, in the step of forming the gold layer on the main plane and the end face of the silver nanoplate, the silver concentration ( CA Ag ) is 0.25 mM or less, and the gold concentration (C Au ) is 0.1 mM or more. and as the ratio of C Au for C Ag (C Au / C Ag ) is 0.50 or more, said silver nano plate, gold-containing water-soluble compounds, and coating mixture containing a complexing agent for gold ion preparation Then, let it stand for a predetermined time. By using such a coating mixture, the gold-coated silver nanoplate can be efficiently and stably produced. See below for more details.
  • a solid gold-coated silver nanoplate is suspended in a liquid dispersion medium.
  • the dispersion medium can be used without particular limitation as long as it can disperse the gold-coated silver nanoplates, and is, for example, water, an aqueous buffer solution (phosphate buffered saline, Tris hydrochloric acid buffer solution, HEPES buffer solution, etc.).
  • Alcohols ethanol, methanol, etc.
  • ketones acetone, methyl ethyl ketone, etc.
  • tetrahydrofuran etc.
  • the suspension of the present invention may be one in which the gold-coated silver nanoplates are dispersed in the dispersion medium in a stationary state, and in the static state, the gold-coated silver nanoplates are settled, but shaken or ultrasonically generated. It may be in a distributed state by processing.
  • the suspension of the present invention may or may not contain a water-soluble polymer.
  • water-soluble polymer refers to a water-soluble substance having a molecular weight of 500 or more, preferably 500 to 1,000,000, and more preferably 500 to 100,000.
  • water-soluble as used herein means that the polymer dissolves in water in an amount of 0.001% by mass or more under normal temperature and pressure.
  • the water-soluble polymer include polystyrene sulfonic acid or a sodium salt thereof, polyvinylpyrrolidone (PVP), polyethylene glycol, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyallylamine, dextran, and polymethacrylamide.
  • Polyvinylphenol, vinyl polybenzoate, phospholipid polymer, bovine serum albumin (BSA), casein, or bis (p-sulfonatophenyl) phenylphosphine may be used, and these may be used with the gold-coated silver nanoplate. It may be modified with a hydroxyl group, a mercapto group, a disulfide group, an amino group, a carboxyl group or the like which are functional groups to be chemically bonded.
  • the water-soluble polymer is polystyrene sulfonic acid or a sodium salt thereof, PVP, or thiol-terminated polyethylene glycol.
  • the type of water-soluble polymer contained in the suspension of the present invention can be selected according to the use of the suspension. For example, when used in a biological experiment or a cell experiment, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, or the like having good biocompatibility may be used.
  • the concentration of the water-soluble polymer dissolved or dispersed in the suspension may be, for example, 100 ⁇ M or less, preferably 50 ⁇ M or less. , More preferably 10 ⁇ M or less.
  • the concentration of the water-soluble polymer may be, for example, 1% by mass or less, preferably 0.5% by mass or less, and more preferably 0.1% by mass or less.
  • the dispersion stability of the gold-coated silver nanoplate is improved in the suspension.
  • concentration of the water-soluble polymer is 100 ⁇ M or less or 1% by mass or less
  • the present invention is compared with the case where the concentration exceeds 100 ⁇ M or 1% by mass.
  • Methods for measuring the concentration of water-soluble polymers include nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), size exclusion chromatography (SEC) (eg, gel filtration chromatography (GPC)), and differential thermal / thermal weight measurement (TG-DTA). And so on.
  • NMR nuclear magnetic resonance spectroscopy
  • SEC size exclusion chromatography
  • GPC gel filtration chromatography
  • TG-DTA differential thermal / thermal weight measurement
  • the suspension of the present invention can be measured, and the concentration of the water-soluble polymer can be calculated from the peak area derived from the water-soluble polymer in the obtained chart.
  • the water-soluble high molecular weight can be calculated from the weight change when the dry solid content of the suspension of the present invention is measured.
  • the suspension of the present invention may or may not contain sodium citrate arbitrarily.
  • the inclusion of sodium citrate improves the dispersibility of the gold-coated silver nanoplates in the suspension.
  • the concentration of sodium citrate in the suspension may be, for example, 50 mM or less, preferably 25 mM or less, and more preferably 13 mM or less.
  • the concentration of sodium citrate is 50 mM or less, the gold-coated silver nanoplates in the suspension are less likely to aggregate.
  • the suspension of the present invention may contain any component as long as it does not adversely affect the gold-coated silver nanoplate.
  • the optional component include reagents (for example, sodium borohydride and ascorbic acid) and dispersants (for example, polyethylene glycol having a molecular weight of less than 500) used in producing gold-coated silver nanoplates.
  • the suspension of the invention can be used to label a specific binding agent to a test substance, i.e., a detection reagent, for the purpose of detecting the test substance.
  • a test substance i.e., a detection reagent
  • the gold-coated silver nanoplate can carry a specific binding substance to the test substance.
  • the term "supported” means that the gold-coated silver nanoplate is bound to a specific binding substance to a test substance regardless of the mode such as covalent bond, non-covalent bond, or direct or indirect bond. It means that they form a complex.
  • a normal carrying method can be used without particular limitation, and physical adsorption, chemical adsorption (covalent bond to the surface), chemical bond (covalent bond, coordination bond, ionic bond or metal bond) and the like can be used.
  • a method of directly binding the gold-coated silver nanoplate and a specific binding substance to the test substance or by binding a part of the above-mentioned water-soluble polymer to the surface of the gold-coated silver nanoplate.
  • a method of directly or indirectly binding a specific binding substance to a test substance to the terminal or main chain or side chain of the water-soluble polymer can be adopted.
  • the specific binding substance to the test substance is an antibody
  • the gold-coated silver nanoplate and the solution of the antibody are mixed, shaken, and centrifuged to carry the gold-coated silver nanoplate.
  • (Labeled detection reagent) can be obtained as a precipitate.
  • the support efficiency of the antibody can be improved by coating the surface of the gold-coated silver nanoplate with polystyrene sulfonic acid having a negative charge.
  • the specific binding substance to the test substance can improve the dispersion stability of the gold-coated silver nanoplate in the suspension of the present invention, and thus the test substance in particular. It is also suitable as a dispersant for gold-coated silver nanoplates carrying a specific binding substance to.
  • the test substance to be detected can be detected by forming a complex with the test substance, and the gold-coated silver nanoplate can be used as a label.
  • Any substance can be used without particular limitation.
  • Specific examples of the combination of the test substance and the specific binding substance to the test substance include an antigen and an antibody that binds to the test substance, an antibody and an antigen that binds to the antibody, a sugar chain or a complex sugar and a lectin that binds to the nucleic acid, and a lectin that binds to the antibody.
  • the second nucleic acid may be a nucleic acid containing a sequence complementary to the first nucleic acid.
  • the specific binding substance to the antigen may be an antibody.
  • the antibody may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a single chain antibody or a fragment thereof that specifically binds to the antigen, and the fragment may be an F (ab) fragment, an F (ab') fragment, and the like. It may be an F (ab') 2 fragment or an F (v) fragment.
  • the antigen as a test substance may be a lectin such as concanavalin A (ConA), malt aglutinin and lysine, and may be influenza virus, coronavirus, adenovirus, RS virus, rotavirus, human papillomavirus, human immunodeficiency virus and B. It may be a virus such as hepatitis virus, decavirus, dengue virus or a substance contained therein (for example, hepatitis B virus antigen (HBs antigen) or hemagglutinin of influenza virus), aspergillus flavus, chlamydia, syphilis treponema, lytic fungus.
  • ConA concanavalin A
  • HBs antigen hepatitis B virus antigen
  • hemagglutinin of influenza virus aspergillus flavus
  • chlamydia chlamydia
  • IgG immunoglobulin G
  • CRP C-reactive protein
  • It may be a protein, a glycoprotein such as mutin, insulin, pituitary hormone (eg, growth hormone (GH), corticostimulatory hormone (ACTH), thyroid stimulating hormone (TSH), follicular stimulating hormone).
  • FSH luteinizing hormone
  • LH prolactin
  • MSH melanin cell stimulating hormone
  • TRH thyroid stimulating hormone-releasing hormone
  • GABA luteinizing hormone
  • TRH thyroid hormone-releasing hormone
  • villous Gonadotropin calcium metabolism regulatory hormone (eg, calcitonin or paratormon), pancreatic hormone, gastrointestinal hormone, vasoactive intestinal peptide, follicular hormone (eg, estron), natural or synthetic luteinizing hormone (eg, progesterone), male hormone (eg, progesterone) , Teststerone), and hormones such as corticosteroids (eg, cortisol), and other in vivo substances such as serotonin, urokinase, ferritin, substance P
  • It may be a tumor marker such as acid phosphatase (PAP), prostate-specific antigen (PSA), alkaline phosphatase, transaminase, trypsin, pepsinogen, ⁇ -fet protein (AFP) and cancer fetal antigen (CEA), and blood.
  • PAP acid phosphatase
  • PSA prostate-specific antigen
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • transaminase transaminase
  • trypsin ⁇ -fet protein
  • CEA cancer fetal antigen
  • blood may be a sugar chain antigen such as a liquid antigen, or a marker used for detecting fecal occult blood such as hemoglobin and transferase, and is cross-linked by the action of active factor XIII in the blood coagulation / fibrin system.
  • the stabilized fibrin may be a D-dimer, which is a kind of fibrin degradation product degraded by plasmin, or may be a protein or nucleic acid possessed by extracellular vesicles.
  • the antigen as the test substance is an in vivo substance such as a hormone or a cytokine
  • the specific binding substance to the in vivo substance may be not only an antibody but also a receptor, and the antigen as a test substance.
  • the specific binding substance for the sugar chain or the complex sugar having a sugar chain may be a lectin as well as an antibody.
  • the antigen as a test substance may be a hapten such as penicillin and cadmium.
  • the specific binding substance for the antibody may be an antigen.
  • the antigen may be an entire antigen or a fragment thereof that specifically binds to the antibody, or may be a fusion substance in which they are bound to another carrier.
  • the antibody as a test substance may be an autoantibody such as an anti-cyclic citrullinated peptide (CCP) antibody or an anti-phospholipid antibody, and is an antibody against a foreign antigen such as an anti-Chlamydia antibody, an anti-HIV antibody or an anti-HCV antibody. You may.
  • the specific binding substance for the sugar chain may be a lectin.
  • the lectin may be a galectin, a C-type lectin, a legume lectin or a fragment thereof that specifically binds to the sugar chain.
  • the sugar chain as a test substance may be a monosaccharide or a polysaccharide, or may be a complex sugar in which they are bound to a protein or a lipid.
  • ConA concanavalin A
  • a legume lectin can be used as a specific binding substance for the sugar chain.
  • the specific binding substance to the lectin may be a sugar chain.
  • the sugar chain may be a monosaccharide, a polysaccharide, a complex sugar that specifically binds to the lectin, or a fusion substance in which they are bound to another carrier.
  • the lectin as a test substance may be galectin, C-type lectin or legume lectin.
  • ConA concanavalin A
  • a sugar chain containing mannose can be used as a specific binding substance for the lectin.
  • the combination of the test substance and the specific binding substance to the test substance is a protein and a nucleic acid aptamer or a peptide aptamer that binds to the protein
  • the nucleic acid aptamer is, for example, Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus.
  • RNA aptamer that binds to the Tat protein or Rev protein of a human immunodeficiency virus
  • the peptide aptamer may be, for example, a peptide aptamer that binds to the neoplastic protein HPV16E6 of human papillomavirus (HPV).
  • the specific binding substance for the vitamin may be a vitamin-binding protein such as transcobalamin that binds to vitamin D and transcobalamin that binds to vitamin B12.
  • the specific binding substance to the antibiotic may be a penicillin-binding protein such as PBP1 and PBP2 that binds to penicillin.
  • the nucleic acid as a test substance or a substance that binds to the test substance may be, for example, DNA, RNA, oligonucleotide, polynucleotide, or an amplified product thereof.
  • the invention also relates to a dried product of the suspension described above.
  • the dried product of the present invention can be appropriately prepared from the suspension by a method usually used in the art.
  • the dried product of the present invention is in a suitable form for transporting or storing the gold-coated silver nanoplate.
  • the dried product is a lyophilized product.
  • the above-mentioned dispersion medium can be appropriately added and resuspended to reconstitute the suspension.
  • the invention also relates to a method of detecting a test substance using the suspension described above, wherein the method comprises a specific binding agent to the test substance in the suspension. It includes a step of contacting the supported gold-coated silver nanoplate with the test substance to form a complex thereof, and a step of detecting the complex.
  • the gold-coated silver nanoplate carrying the specific binding substance to the test substance may be prepared immediately before carrying out the method of the present invention.
  • the method of the present invention carries it on a gold-coated silver nanoplate that does not carry a specific binding agent for the test substance, and carries a gold-coated silver nanoplate that carries the specific binding substance for the test substance.
  • the method of the present invention may further include a step of resuspending a dried product of a suspension of gold-coated silver nanoplates carrying a specific binding substance to the test substance.
  • the complex can be detected by using a means usually used in the field of detecting a test substance or a means usually used for detecting an agglomerate or a precipitate without particular limitation.
  • the formation of the complex can be measured by dimming degree measurement, absorbance measurement, particle size distribution measurement, particle size measurement, Raman scattered light measurement, color tone change observation, aggregation or precipitation formation observation, immunochromatography method, electrophoresis, and It may be detected by a means selected from the group consisting of flow cytometry.
  • the invention also relates to a kit for detecting a test substance, including the suspensions or dried products described above.
  • the kit of the present invention may further include a standard product of the test substance, an immunochromatographic test strip (test strip), an instruction manual describing the method of use, and the like.
  • the invention also relates to a method for producing a gold-coated silver nanoplate having a silver nanoplate as a core and a gold layer covering the silver nanoplate, wherein the method comprises an average particle size.
  • the gold layer can be formed by allowing the coating mixture to stand for a predetermined time.
  • the ratio (T / D) of the average thickness (T) of the gold layer on the end face to the average particle size (D) of the silver nanoplate is about 0.05 or more, preferably about 0.1 or more. Yes, more preferably about 0.16 or more.
  • the T / D may be, for example, about 0.5 or less, about 0.4 or less, or about 0.3 or less.
  • the silver concentration (C Ag ) is about 0.25 mM or less, preferably about 0.20 mM or less.
  • the gold concentration (C Au ) is about 0.1 mM or more, preferably about 0.13 mM or more.
  • the ratio of C Au for C Ag (C Au / C Ag ) is from about 0.50 or greater, preferably about 1.00 or more.
  • C Au / C Ag may be, for example, about 3.50 or less or about 3.00 or less.
  • the "gold-containing water-soluble compound” described in the present specification means a water-soluble compound containing a gold atom as a component.
  • the gold-containing water-soluble compound is not particularly limited as long as it can form a gold layer on the main plane and the end face of the silver nanoplate, and is, for example, gold (III) chloride acid or a sodium salt or potassium salt thereof, or gold cyanide (I). ) Potassium, gold (II) cyanide, or gold (I) sodium sulfite, and the like, preferably gold (III) chloride acid or a sodium salt or potassium salt thereof.
  • the "gold ion complexing agent” described in the present specification refers to a compound capable of forming a complex with gold ions.
  • the complexing agent is not particularly limited as long as it does not interfere with the formation of a gold layer on the main plane and the end face of the silver nanoplate, and is, for example, sulfate (sodium sulfate, potassium sulfite, ammonium sulfite, etc.), thiosulfate (, etc.).
  • the complexing agent reduces the chances of contact between the silver nanoplate and the gold ions and gently proceeds with the coating reaction, resulting in a highly uniform gold-coated silver nanoplate. It is considered that it can contribute to the stable production of.
  • the coating mixture may contain any component as long as it does not interfere with the formation of the gold layer.
  • the optional component include reagents (for example, sodium borohydride and ascorbic acid) and dispersants (for example, polyethylene glycol having a molecular weight of less than 500) used for producing silver nanoplates.
  • the present invention comprises a step of preparing a suspension of a gold-coated silver nanoplate having a silver nanoplate as a core and a gold layer covering the silver nanoplate, and the suspension and a test.
  • a gold-coated silver nano carrying the specific binding substance which comprises a step of preparing a mixed solution with the specific binding substance to the substance and bringing the gold-coated silver nanoplate into contact with the specific binding substance. It is also related to the method of manufacturing the plate.
  • the average particle size of the silver nanoplate is about 55 nm or less, preferably about 50 nm or less, about 40 nm or less, or about 30 nm or less.
  • the average particle size of the silver nanoplates may be about 1 nm or more, preferably about 10 nm or more.
  • the gold layer is formed on the main plane and the end face of the silver nanoplate.
  • the ratio (T / D) of the average thickness (T) of the gold layer on the end face to the average particle size (D) of the silver nanoplate is about 0.05 or more, preferably about 0.1 or more. Yes, more preferably about 0.16 or more.
  • the T / D may be, for example, about 0.5 or less, about 0.4 or less, or about 0.3 or less.
  • the suspension has a maximum absorption wavelength in the visible light region, and the ratio of the quenching degree (E max ) at the maximum absorption wavelength to the quenching degree (E 900 ) at a wavelength of 900 nm of the suspension (E max / E 900). ) Is about 5 or more, preferably about 10 or more.
  • the quenching degree of the suspension at the maximum absorption wavelength is about 2 or more, preferably about 4 or more. In some embodiments, the quenching degree at the maximum absorption wavelength of the suspension may be about 100 or less, about 50 or less, or about 20 or less.
  • the concentration of the specific binding substance in the contact step is about 100 ⁇ g / mL or less, preferably about 50 ⁇ g / mL or less, based on the total volume of the mixed solution. In some embodiments, the concentration of the specific binding agent in the contacting step may be about 0.5 ⁇ g / mL or higher, preferably about 1.0 ⁇ g / mL or higher.
  • the invention also relates to an immunochromatographic kit for detecting a test substance in a sample.
  • a test strip containing a membrane to which a specific binding substance for capturing the test substance is immobilized, and a test strip.
  • a gold-coated silver nanoplate having a silver nanoplate as a core and a gold layer covering the silver nanoplate and carrying a specific binding substance for detection of the test substance.
  • the average thickness of the gold layer of the gold-coated silver nanoplate is thicker than that used in the conventional lateral flow test kit, and in particular, the end face is more than about 1.0 nm.
  • the gold-coated silver nanoplate with a thick gold layer has high storage stability due to its high oxidation resistance, and the test substance can be detected with good sensitivity even in the form of an immunochromatographic kit that is not used immediately after preparation.
  • the average thickness of the gold layer of the gold-coated silver nanoplate is from about 1.5 nm to about 10.0 nm. When the thickness of the gold layer is in such a range, the oxidation of the silver nanoplate can be more effectively suppressed while maintaining the optical characteristics of the silver nanoplate.
  • the ratio (T / D) of the average thickness (T) of the gold layer on the end face to the average particle size (D) of the silver nanoplate is about 0.05 or more, preferably about 0.1.
  • the above is the above, and more preferably, it is formed so as to be about 0.16 or more.
  • the T / D may be, for example, about 0.5 or less, about 0.4 or less, or about 0.3 or less.
  • the gold-coated silver nanoplate has a maximum absorption wavelength in the visible light region, and the quenching degree at the maximum absorption wavelength (E 900 ) with respect to the quenching degree (E 900) of the gold-coated silver nanoplate at a wavelength of 900 nm (the extinction degree at the maximum absorption wavelength).
  • the ratio of E max ) (E max / E 900 ) may be about 5 or more, preferably about 10 or more. That is, as one aspect of the present invention, the gold-coated silver nanoplate contained in the suspension of the gold-coated silver nanoplate described above can be preferably used in the immunochromatographic kit of the present invention.
  • the gold-coated silver nanoplate in the immunochromatographic kit of the present invention those usually used in the art can be adopted without particular limitation, and for example, a commercially available product may be used, which is known to be manufactured. Those manufactured according to the method or the method described in Examples described later may be used. In the case of producing a gold-coated silver nanoplate having a thick gold layer for a small particle size, it can be produced by the above-mentioned method for producing a gold-coated silver nanoplate as one aspect of the present invention.
  • the gold-coated silver nanoplates are included in the dry state in the inner flow test kit of the present invention.
  • the method for drying the gold-coated silver nanoplate is not particularly limited, and for example, the gold-coated silver nanoplate may be dried under normal temperature and reduced pressure, or may be dried by freeze-drying.
  • the gold-coated silver nanoplate used in the present invention has a thick gold layer and high oxidation resistance, so that such a form can be achieved.
  • the capture-specific binding substance refers to a substance specifically bound to the test substance, which is particularly immobilized on the membrane, and the detection-specific binding substance refers to a specific binding substance to the test substance.
  • the substances those supported on the gold-coated silver nanoplate in particular. These are also collectively referred to as "specific binding substances to the test substance".
  • Specific examples of the combination of the test substance and the specific binding substance to the test substance include the above-mentioned ones.
  • the sample contains a plurality of test substances.
  • a capture-specific binding substance for each of the plurality of types of test substances is immobilized on the membrane.
  • the gold-coated silver nanoplate carries a detection-specific binding agent for each of the plurality of test substances. That is, the immunochromatographic kit of the present invention can detect a plurality of types of test substances at the same time.
  • the capture-specific binding substance may be immobilized at a different site depending on the type of the test substance to be bound.
  • the detection-specific binding substance may be supported on a gold-coated silver nanoplate having a maximum absorption wavelength that differs depending on the type of the test substance to be bound. In this way, coloring is observed in different places or in different colors for each test substance to be detected, so that the test substance can be easily detected.
  • the test substance comprises at least one selected from the group consisting of influenza virus antigens and coronavirus antigens.
  • influenza virus antigen is not particularly limited, but may include, for example, influenza A virus antigen and / or influenza B virus antigen.
  • the coronavirus antigen is not particularly limited, but may include, for example, SARS-CoV antigen and / or SARS-CoV-2 antigen.
  • the test strip comprises a conjugate pad containing the gold-coated silver nanoplate.
  • the "conjugate pad” described in the present specification is a portion invaded by the gold-coated silver nanoplate, and when the sample is added thereto, the gold-coated silver nanoplate elutes and is on the membrane. It is configured to start the development (flow) at.
  • the conjugate pad can be made by any method commonly used in the art.
  • the membrane further comprises a control site for determining the success or failure of an immunochromatographic test.
  • the control site is not particularly limited, but may be, for example, a control line in which a substance such as an antibody capable of capturing the detection-specific binding substance is fixed.
  • the immunochromatographic kits of the invention further comprise a control-specific binding agent that specifically binds to said control site.
  • the control-specific binding material may be contained in the conjugate pad together with the gold-coated silver nanoplate.
  • the capture specific binding substance may flow out of the membrane and reach the control site during immersion in a blocking solution or washing solution, development of these solutions, or development of the sample.
  • the control-specific binding substance is not only the detection-specific binding substance but also the capture-specific binding substance at the control site. It is preferable that they do not compete with each other.
  • the control-specific binding substance antibody includes an antibody of the capture-specific binding substance. May be derived from different host animals.
  • the immunochromatographic kit of the present invention further comprises nanoparticles other than the gold-coated silver nanoparticles.
  • nanoparticles are not particularly limited as long as they can be used in an immunochromatographic test, and may be, for example, gold nanoparticles, palladium-coated gold nanoparticles, or the like.
  • the immunochromatographic kit of the present invention may further include any configuration normally used in the art as long as the object of the present invention is not impaired.
  • the immunochromatographic kit may further include a standard product of the test substance, a buffer solution, an instruction manual describing the method of use, and the like.
  • Preparation Example 1 (1) Preparation of seed particles for silver nanoplates 200 mL of 2.5 mM trisodium citrate aqueous solution, 10 mL of 0.5 g / L polystyrene sulfonic acid (molecular weight 70,000) aqueous solution, and 10 mM hydride sodium aqueous solution 11.5 mL was added with stirring, and then 200 mL of a 0.74 mM silver nitrate aqueous solution was added at 86 mL / min. After stopping stirring, the obtained solution was allowed to stand in an incubator (30 ° C.) for 60 minutes to prepare an aqueous dispersion (seed suspension) of silver nanoplate seed particles.
  • an aqueous dispersion seed suspension
  • the average particle size of the prepared silver nanoplates was 24.8 nm.
  • the average particle size was obtained by observing the AgPL suspension 1 with a scanning transmission electron microscope (STEM) and measuring the maximum major axis of 100 arbitrary silver nanoplates. It was calculated by calculating the average value of the data of 80 points.
  • AgPL suspension 2 and AgPL suspension 3 were prepared by the same method except that the amount of the seed suspension used was changed to 300 mL or 24 mL, respectively.
  • the average particle size of the prepared silver nanoplates was 13.2 nm (AgPL suspension 2) and 48.4 nm (AgPL suspension 3), respectively.
  • a growth solution 1 was prepared by mixing 150 mL of distilled water with 14 mL of a 24 mM gold chloride aqueous solution, 8 mL of a 200 mM sodium hydroxide aqueous solution, and 103 mL of a 10 mM sodium sulfite aqueous solution. ..
  • FIG. 1 shows a spectral spectrum obtained by appropriately diluting Ag @ Au suspensions 1 to 3 and measuring with a spectrophotometer V-770 (manufactured by JASCO Corporation). Then, STEM observation photographs of the gold-coated silver nanoplates in the Ag @ Au suspensions 1 to 3 are shown in FIGS. 2 to 4, respectively.
  • FIG. 5 shows a spectroscopic spectrum obtained by appropriately diluting Ag @ Au suspension 4 or 5 and measuring with a spectrophotometer V-770 (manufactured by JASCO Corporation).
  • the STEM observation photographs of the gold-coated silver nanoplates in the Ag @ Au suspensions 4 and 5 are shown in FIGS. 6 and 7, respectively, and the HAADF-STEM observations of the gold-coated silver nanoplates in the Ag @ Au suspension 4 are shown. The photograph is shown in FIG.
  • the Ag @ Au suspension was used in the same manner as the Ag @ Au suspension 1 except that the AgPL suspension 1 was doubled (624 mL) and distilled water was not used during the gold coating reaction. 6 was prepared. Further, instead of the growth solution 1, a growth solution 2 (prepared by mixing 25 mL of distilled water with 28 mL of a 24 mM gold chloride aqueous solution, 16 mL of a 200 mM sodium hydroxide aqueous solution, and 206 mL of a 10 mM sodium sulfite aqueous solution) was used. The Ag @ Au suspension 7 was prepared in the same manner as the Ag @ Au suspension 6 except that it was used. FIG.
  • FIGS. 10 and 11 shows a spectroscopic spectrum obtained by appropriately diluting Ag @ Au suspension 6 or 7 and measuring with a spectrophotometer V-770 (manufactured by JASCO Corporation). Then, STEM observation photographs of the gold-coated silver nanoplates in the Ag @ Au suspensions 6 and 7 are shown in FIGS. 10 and 11, respectively.
  • FIG. 12 shows a spectroscopic spectrum obtained by appropriately diluting the Ag @ Au suspension 8 and measuring it with a spectrophotometer V-770 (manufactured by JASCO Corporation).
  • Ag @ Au suspensions 1 to 5 all exhibited bright colors and showed sharp spectral spectra (FIGS. 1 and 5). In addition, uniform particles were formed in each suspension (FIGS. 2 to 4 and 6 to 8). On the other hand, the colors exhibited by Ag @ Au suspensions 6 and 7 were turbid, and in their spectral spectra, light absorption was observed even on the wavelength side longer than the maximum absorption wavelength (FIG. 9). In the Ag @ Au suspensions 6 and 7, many aggregated and connected particles were also observed (FIGS. 10 and 11). Light absorption was also observed on the longer wavelength side than the maximum absorption wavelength, and the saturation was reduced as a whole, probably because of the influence of such agglomerates.
  • Oxidation resistance test example 1 Sodium chloride aqueous solution was added to each of Ag @ Au suspensions 1 to 8 so that the final concentration was 5%, and the change in color tone before and after the addition was visually observed.
  • the spectral spectra of Ag @ Au suspensions 3 and 8 before and after the addition of the aqueous sodium chloride solution were measured and compared. The results are shown in Table 2 and FIGS. 13 and 14.
  • the oxidation resistance improving action of the gold-coated silver nanoplates of the examples is not related to the dispersion stabilizing action of the water-soluble polymer (polyvinylpyrrolidone)
  • the gold-coated silver nanoplates are washed.
  • An oxidation resistance test with sodium chloride was carried out. Specifically, gold-coated silver nanoplates in Ag @ Au suspensions 1 to 8 are precipitated by centrifugation, the supernatant is removed, and a 0.5 mM trisodium citrate aqueous solution is added to precipitate gold.
  • the coated silver nanoplates were redistributed. The same operation was repeated twice to prepare Ag @ Au suspensions 1'to 8'.
  • the developing solution 3 was prepared by adjusting the concentration so as to be 0.0. Further, in the same manner, developing liquids 4 and 5 were prepared from Ag @ Au suspensions 4 and 5, respectively.
  • the anti-hCG antibody was linearly fixed as a capture antibody in the center of an immunochromatographic test paper (manufactured by Fordix Co., Ltd.) equipped with a strip-shaped nitrocellulose membrane to which a water absorption pad was attached to one end.
  • the end of the immunochromatographic test strip to which the water absorption pad is not attached is dipped in 50 ⁇ L of a test solution containing or not containing 200 mIU / mL hCG (10 mM phosphate buffered saline containing 0.25 mM BSA).
  • mIU / mL hCG 10 mM phosphate buffered saline containing 0.25 mM BSA
  • the coloration of the portion where the capture antibody was immobilized was evaluated visually or by luminance analysis.
  • the immunochromatographic test paper after developing the developing liquids 3 to 5 is scanned by a scanner (device name: CanoScan LiDE500F, manufacturer: Canon Co., Ltd.), and the detection line (the part where the captured antibody is fixed) and the detection line are scanned.
  • Image-J Open source and public image processing software developed by Wayne Rasband at the National Institutes of Health; http: // It was quantified using imagej.nih.gov/ij/). More specifically, the minimum luminance of each portion was measured 5 times each, and the median of the obtained numerical values was adopted as the minimum luminance of the detection line or the control region. Then, the minimum luminance of the detection line was subtracted from the minimum luminance of the control region to obtain the luminance difference. The results are shown in Table 4.
  • the detection antibody could be carried on a gold-coated silver nanoplate having a thick gold layer and used for the immunochromatography method.
  • the test substance could be labeled with various color tones.
  • Ag @ Au suspension except that AgPL suspension 4 was used instead of AgPL suspension 1 and growth solution 1 diluted 1.7 times was used.
  • Ag @ Au suspension 9 was prepared in the same manner as in turbid liquid 1. Further, Ag @ was used in the same manner as Ag @ Au suspension 1 except that AgPL suspension 5 was used instead of AgPL suspension 1 and the growth solution 1 diluted 1.4 times was used.
  • Au suspension 10 was prepared. Then, Ag @ was used in the same manner as Ag @ Au suspension 1 except that AgPL suspension 2 was used instead of AgPL suspension 1 and the growth solution 1 diluted 2.9-fold was used. Au suspension 11 was prepared.
  • FIGS. 16 and 17 show a spectroscopic spectrum obtained by appropriately diluting Ag @ Au suspensions 9 to 11 and measuring with a spectrophotometer V-770 (manufactured by JASCO Corporation).
  • the STEM observation photographs of the gold-coated silver nanoplates in the Ag @ Au suspensions 9 and 10 are shown in FIGS. 16 and 17, respectively, and the HAADF-STEM observation photographs of the gold-coated silver nanoplates are shown in FIGS. 18 and 19, respectively. show.
  • the average thickness of the gold layer on the end face of the gold-coated silver nanoplates in the Ag @ Au suspensions 9 to 11 was calculated.
  • Table 5 shows the silver concentration and gold concentration of the mixed solution during the gold coating operation, the average particle size of the core silver nanoplate and the average thickness of the gold layer at the end face, and the maximum absorption wavelength and the maximum of the gold-coated silver nanoplate. The absorption wavelength or the degree of extinction at 900 nm are collectively shown.
  • Oxidation resistance test example 2 An aqueous sodium chloride solution was added to each of the Ag @ Au suspensions 9 to 11 so that the final concentration of sodium chloride was 5%, and the change in color tone before and after the addition was visually observed. Since the gold-coated silver nanoplates of Ag @ Au suspensions 9 to 11 had a thick gold layer, the color tone did not change before and after the addition of sodium chloride (Table 6).
  • the gold-coated silver nanoplates were washed in the same manner as in the method described in item 2 above to prepare Ag @ Au suspensions 9'to 11'.
  • the concentration of each Ag @ Au suspension was adjusted so that the degree of quenching at the maximum absorption wavelength was 2.0.
  • Sodium chloride aqueous solution was added to each of these suspensions so that the final concentration was 5%, and the change in color tone before and after the addition was visually observed. The results are shown in Table 7.
  • Example of method for supporting a specific binding substance to a test substance A gold-coated silver nanoplate in an Ag @ Au suspension 10 is precipitated by centrifugation, the supernatant is removed, and then a 0.5 mM trisodium citrate aqueous solution is added. And the precipitated gold-coated silver nanoplates were dispersed. The same operation is repeated twice, and an aqueous solution of trisodium citrate is added so that the quenching degree at the maximum absorption wavelength becomes 2, 4, or 8, and the Ag @ Au suspension 10 (2), 10 ( 4) and 10 (8) were prepared. The suspension having a high concentration was appropriately diluted, and then the degree of quenching was measured, and the degree of quenching of the undiluted solution was calculated by multiplying by the dilution ratio.
  • the degree of quenching at the maximum absorption wavelength is 2.
  • the final concentration of the antibody is 0 and the final concentration of the antibody is 1.25 ⁇ g / mL or the quenching degree at the maximum absorption wavelength is 4.0 and the final concentration of the antibody is 2.50 ⁇ g / mL
  • the spherical gold nanoparticles are aggregated and immunochromatographic. It was not ready for testing.
  • the antibody is usually supported on the spherical gold nanoparticles under the conditions that the quenching degree at the maximum absorption wavelength is 1.0 and the final concentration of the antibody is 5 ⁇ g / mL.
  • Each suspension of gold-coated silver nanoplates was centrifuged to precipitate gold-coated silver nanoplates carrying anti-hCG antibodies and the supernatant was removed.
  • 0.40 mL of 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (containing 8 ⁇ M polyethylene glycol, 0.25 mM BSA, and 150 mM NaCl) was added and redispersed to quench the maximum absorption wavelength. Adjust the concentration so that the degree is 1.0, and develop solutions 10 (2) -1, 10 (2) -2, 10 (4) -1, 10 (8) -1, and 10 for the immunochromatographic test. (8) -2 was prepared. Table 8 summarizes the supporting conditions of the anti-hCG antibody and the corresponding developing solution.
  • aggregation of metal nanoparticles can be a problem in the step of carrying an antibody on metal nanoparticles (see the results of spherical gold nanoparticles in Table 8).
  • the suspension In order to prevent the aggregation of the metal nanoparticles, the suspension needs to have a protein concentration of a certain level or higher. Therefore, when the concentration of the metal nanoparticles is increased, it is required to increase the concentration of the antibody accordingly.
  • a gold-coated silver nanoplate having a small particle size and a thick gold layer is used, the antibody when the gold-coated silver nanoplate is thickened despite the increase in specific surface area. Aggregation did not occur even when the concentration was lowered.
  • the gold-coated silver nanoplate having a small particle size and a thick gold layer has excellent dispersibility and high efficiency of carrying an antibody.
  • the silver nanoplate when the silver nanoplate is coated with gold, a gold ion complexing agent is used, the silver concentration is set to a certain value or less, the gold concentration is set to a certain value or more, and the two concentrations have a predetermined relationship. It was found that by adjusting them to meet the requirements, a gold-coated silver nanoplate having a thick gold layer for a small particle size can be uniformly produced. Therefore, it is possible to produce a gold-coated silver nanoplate having an excellent oxidation resistance and a small particle size. Since the gold-coated silver nanoplate having a small particle size has a maximum absorption wavelength in the visible light region, it is possible to achieve multicoloring of a method for detecting a test substance that requires visual determination such as immunochromatography. Further, since the gold-coated silver nanoplate having a small particle size and a thick gold layer has high dispersibility and can efficiently support a specific binding substance to a test substance, the amount of the specific binding substance used can be increased. It is possible to save money.
  • the average thickness of the gold layer on the end face of the gold-coated silver nanoplates in the Ag @ Au suspensions 4 to 6 measured according to the method described in (4) above is 0.14 nm, 0.21 nm, and 0, respectively. It was .31 nm, both of which were thinner than 1.0 nm.
  • This mixed solution is uniformly applied to the entire surface of a glass fiber pad (GRADE 8964, manufactured by AHLSTROM) having a length of 8 mm and a width of 300 mm in an amount of 40 ⁇ L / cm, then placed in a vacuum desiccator (manufactured by AS ONE) and decompressed pump (belt).
  • a driven oil rotary vacuum pump TSW-50N (manufactured by Sato Vacuum Co., Ltd.) was dried overnight to prepare a conjugate pad 1 containing Ag @ Au carrying an anti-hCG antibody. Further, in the same manner, conjugate pads 2 to 6 containing Ag @ Au carrying the anti-hCG antibody were prepared from the anti-hCG antibody / Ag @ Au suspensions 10 to 14, respectively.
  • test strip for immunochromatography A 50 mM phosphate buffer solution containing 0.5 mg / mL anti-hCG antibody (host animal: mouse) was added to the detection site of the nitrocellulose membrane in an amount of 1 ⁇ L / cm. Apply evenly and linearly, and apply 50 mM phosphate buffer containing 0.5 mg / mL anti-mouse IgG antibody (host animal: rabbit) to the control site on the upper end side of the detection site in an amount of 1 ⁇ L / cm. These antibodies were fixed on the membrane by applying them uniformly and linearly. The membrane was blocked with 50 mM borate buffer (pH 8.5) (containing 0.5% casein). The blocked membrane was washed and dried by immersing it in 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.6) (containing 0.5% sucrose and 0.01% sodium dodecylbenzene sulfonate).
  • the dried membrane was attached to the adhesive tape portion of a backing sheet (GL-57888, manufactured by Lohmann) having a length of 40 mm and a width of 60 mm, and Ag @ carrying an anti-hCG antibody so as to overlap the lower end side of the membrane by 2 mm. Any of the conjugate pads 1 to 6 containing Au was attached.
  • a 17 mm long ⁇ 60 mm wide sample pad (GRADE0319, manufactured by Ahlstrom) impregnated with 25 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.2) was placed on the opposite side of the conjugate pad from the membrane so as to overlap it 4 mm. I pasted it.
  • a water absorption pad (GRADE0270, manufactured by Ahlstrom) having a length of 20 mm and a width of 60 mm was attached so as to overlap the upper end side of the membrane by 5 mm.
  • the backing sheet provided with the membrane, conjugate pad, sample pad, and water absorption pad is cut into strips with a length of 60 mm and a width of 5 mm with a roll cutter, and this is cut into a housing case (Type-T housing case, trust medical).
  • a test strip [hCG + M] was produced by installing the test strip [hCG + M].
  • the sample pad of the test strip [hCG + M] prepared in item 7 (4) above does not contain 10 mM phosphate buffered saline (containing 0.25 mM BSA) containing hCG at a concentration of 250 mIU / mL or hCG-free. 100 ⁇ L of phosphate buffered saline (blank) was added dropwise and developed on a membrane. Then, the coloring of the detection site and the control site was visually evaluated according to the following criteria, and when the test sample containing hCG was developed, the luminance analysis was also performed. (Criteria for visual judgment) ++: With vivid coloring +: With coloring-: Without coloring
  • the test strip after unfolding the test sample is scanned by a scanner (device name: CanoScan LiDE500F, manufacturer: Canon Co., Ltd.), and the minimum brightness of the detection site, control site, and other sites (control area).
  • Image-J open source and public image processing software developed by Wayne Rasband at the National Institutes of Health; http: //imagej.nih.gov/ij/) It was quantified using. More specifically, the minimum luminance of each portion was measured 5 times each, and the median value obtained was adopted as the minimum luminance of the detection region, the control region, or the control region. Then, the minimum luminance of the detection region or the control region was subtracted from the minimum luminance of the control region to obtain the luminance difference. The results are shown in Tables 10 and 11.
  • a suspension of Ag @ Au carrying an anti-Flu-B antibody in the same manner as in item 7 (2) above except that it contains BL802 (Nichiyu Co., Ltd.) and does not contain PEG.
  • a suspension of Ag @ Au carrying an anti-Flu-A antibody (suspension B), and a suspension of Ag @ Au carrying an anti-CoV2 antibody (suspension C) were prepared.
  • test strip for immunochromatography A 50 mM borate buffer (10%) containing 0.25 mg / mL of anti-CoV2 antibody in order from the lower end to the upper end of the nitrocellulose membrane at the detection site. 50 mM borate buffer containing 0.25 mg / mL anti-Flu-A antibody (containing 10% sucrose), and 50 mM borate buffer containing 0.25 mg / mL anti-Flu-B antibody. Apply the solution (containing 10% boric acid) linearly, and apply 2.1 mg / mL anti-mouse IgG antibody (host animal: rabbit) to the control site on the upper end side of the detection site.
  • a test strip [ABC + M] was produced in the same manner as in item 7 (4) above, except that the conjugate pad [ABC] was used as the conjugate pad. Also, change the concentration of the antibody solution applied to the detection site to 1.0 mg / mL, and change the antibody solution applied to the control site to 0.3 mg / mL anti-rabbit IgG antibody (host animal: goat). Further, a test strip [ABC + R] was produced in the same manner as the test strip [ABC + M] except that the conjugate pad [ABC + R] was used as the conjugate pad.
  • Immunochromatography test example 3 A 10 mM phosphate buffered saline solution (0.25 mM) containing the following test samples (a) to (e) on the sample pad of the test strip [ABC + M] or the test strip [ABC + R] prepared in the above item 9 (4). 100 ⁇ L (including BSA) was added dropwise and developed on the membrane. Then, the coloring of the detection site and the control site was evaluated according to the method described in item 8 above. The results are shown in Tables 12 and 13.
  • A Blank (no antigen)
  • B Flu-A antigen (1.5 ⁇ g / mL)
  • C Flu-B antigen (5.0 ⁇ g / mL)
  • D Flu-B antigen (5.0 ⁇ g / mL)
  • E Flu-A antigen (1.5 ⁇ g / mL) + Flu-B antigen (5.0 ⁇ g / mL) + CoV2 antigen (3.0 ⁇ g / mL)
  • test strip [ABC + M] or the test strip [ABC + R] When either the test strip [ABC + M] or the test strip [ABC + R] was used, Flu-A was detected in blue, Flu-B was detected in yellow, and CoV2 was detected in red, but when the test strip [ABC + R] was used. The one was detected with a larger brightness difference.
  • the test strip [ABC + M] exhibits black as a mixed color of blue, yellow, and red gold-coated silver nanoplates
  • the test strip [ABC + R] exhibits palladium-coated gold.
  • the color of the nanorod was black.
  • the capture-specific binding substance of the test substance does not compete with the substance that binds to the control site, such as the test strip [ABC + R]
  • the control is performed by increasing the fixed amount of the capture-specific substance. It is possible to increase the detection sensitivity without adversely affecting the determination of.

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Abstract

本発明のある態様は、粒子径が小さい割に厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを安定に提供することを目的としている。本発明に従えば、銀ナノプレートを金で被覆する際に、金イオンの錯化剤を使用し、かつ、銀濃度を一定値以下にし、金濃度を一定値以上にして、両濃度が所定の関係を満たすようにそれらを調整することによって、粒子径が小さい割に厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを安定に作製することができる。　また、本発明の別の態様は、酸化耐性の高い金被覆銀ナノプレートを使用したイムノクロマトキットを提供することを目的としている。本発明の試料中の被験物質を検出するためのイムノクロマトキットは、金層の平均厚みが１．０ｎｍ超であり、かつ前記被験物質の検出用特異的結合物質を担持している金被覆銀ナノプレートを含んでいる。

Description

金被覆銀ナノプレートの懸濁液、その用途及び製造方法、並びにイムノクロマトキット
　本発明は、コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの懸濁液、並びに、その用途及び製造方法に関する。また、本発明は、本発明は、イムノクロマトキットに関しており、特に金被覆銀ナノプレートを使用したイムノクロマトキットに関している。
　銀ナノプレートは、光との相互作用（局在表面プラズモン共鳴：ＬＳＰＲ）により光を吸収するため、その懸濁液はナノプレートの形状に応じて色を示すことが知られている。そして、銀ナノプレートの大きさや形状を制御することにより、吸収する光を変化させること、すなわち色を変化させることができることも知られている。一方、銀ナノプレートは酸化により溶解してその形状が変化する。この酸化による銀ナノプレートの形状変化は、意図していた色の変化を引き起こし得る。そこで、銀ナノプレートを酸化に対して安定化するため、銀ナノプレートの表面を金で被覆することが行われている。特許文献１には、金被覆銀ナノプレートは安定であり、イムノクロマトグラフィー試験に好適に利用できる旨が記載されている。特許文献２には、水溶性高分子の濃度とｐＨを調整することで、金被覆銀ナノプレートを安定な懸濁液の形態で調製し、被験物質の検出試薬の標識（例えば、目的タンパク質の検出に用いられる抗体の標識）として利用して、種々の被験物質を高い感度で検出するために応用することが記載されている。また、非特許文献１及び２並びに特許文献３には、厚い金層を有する粒子径の大きい金被覆銀ナノプレートが記載されている。しかしながら、いずれの先行技術文献にも、コアの銀ナノプレートの大きさに比して厚い金層を有する金被覆銀ナノプレート（例えば、比較的厚い金層を有する粒子径の小さい金被覆銀ナノプレート）は記載されていない。
　イムノクロマトグラフィー試験に用いるテストストリップとしては、メンブレンと吸収パッドで構成される「ハーフストリップ」や、それに加えてサンプルパッド及びコンジュゲートパッドを備える「フルストリップ」が知られており、市販品としては「フルストリップ」が広く販売されている。ハーフストリップでは、被験物質の検出試薬を展開液として使用するが、フルストリップでは、被験物質の検出試薬をコンジュゲートパッドに含浸させ、乾燥させているため、被験物質を含む試料をサンプルパッドに適用するだけで使用できる。他方、いずれの先行技術文献にも、厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートをイムノクロマトグラフィー試験に使用することは記載されていない。
特開２０１５－１９４４９５号公報 国際公開第２０１５／１８２７７０号 国際公開第２０１８／１８０２８６号
Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ（２０１５），２５，ｐｐ．５４３５－５４４３ Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ（２０１１），ＸＸ，ｐｐ．１－６，ＤＯＩ：１０．１００２／ａｄｆｍ．２０１１０２０２８
　銀ナノプレートを金で被覆することによって、酸化耐性を付与することができるものの、薄い被膜ではその保護効果は不十分であった。一方、金層を厚くするために被覆工程における金の濃度を高くすると、銀は金よりも電気陰性度が低いため電子を放出してイオン化しすくなり、結果としてコアの銀ナノプレートから銀が溶出して被覆前後で光学特性が変化してしまう。特に粒子径の小さい銀ナノプレートは、比表面積が大きいため、酸化の影響を受けやすい。さらに、成長した金層が他の粒子の金層と接触すると、凝集塊が形成されてしまう。そこで、本発明のある態様では、粒子径が小さい割に厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを安定に提供することを目的としている。
　また、従来からイムノクロマトグラフィー試験に用いられている金層の薄い金被覆銀ナノプレートは、ハーフストリップには好適に使用できるが、フルストリップでは、発色性が低下する場合があった。原因としては、金被覆銀ナノプレートを含む被験物質の検出試薬をコンジュゲートパッドに含浸させ、乾燥させることにより、当該金被覆銀ナノプレートが酸化により劣化していることが考えられた。金層の薄い金被覆銀ナノプレートは、酸化耐性が不十分であったため、イムノクロマトグラフィー試験の検出感度も十分ではなかった。そこで、本発明の別の態様では、酸化耐性の高い金被覆銀ナノプレートを使用したイムノクロマトキットを提供することを目的としている。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、銀ナノプレートを金で被覆する際に、金イオンの錯化剤を使用し、かつ、銀濃度と金濃度のバランスを調整することによって、粒子径が小さい割に厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを安定に作製できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示す金被覆銀ナノプレートの懸濁液及びその乾燥物及び製造方法、当該懸濁液を使用して被験物質を検出する方法、並びに、被験物質を検出するためのキットを提供するものである。
〔１〕コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの懸濁液であって、
　前記銀ナノプレートの平均粒子径が、５５ｎｍ以下であり、前記金層が、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に形成されており、
　前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が０．０５以上であり、
　前記懸濁液が可視光領域に極大吸収波長を有し、前記懸濁液の波長９００ｎｍにおける消光度（Ｅ900）に対する前記極大吸収波長における消光度（Ｅmax）の比率（Ｅmax／Ｅ900）が５以上である、懸濁液。
〔２〕前記金層の平均厚みが、１．５ｎｍ～１０．０ｎｍである、前記〔１〕に記載の懸濁液。
〔３〕前記コアとしての銀ナノプレートのアスペクト比が、１より大きく１０以下である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の懸濁液。
〔４〕前記極大吸収波長が、４００ｎｍ～６８０ｎｍに存在している、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の懸濁液。
〔５〕前記極大吸収波長における消光度が２以上である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の懸濁液。
〔６〕前記金被覆銀ナノプレートが、被験物質に対する特異的結合物質を担持している、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の懸濁液。
〔７〕前記〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の懸濁液の乾燥物。
〔８〕前記〔６〕に記載の懸濁液を使用して、被験物質を検出する方法であって、
　前記懸濁液中の前記金被覆銀ナノプレートと前記被験物質とを接触させて、これらの複合体を形成する工程、及び、
　前記複合体を検出する工程を含む、方法。
〔９〕前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の懸濁液中の前記金被覆銀ナノプレートに、前記被験物質に対する特異的結合物質を担持させて、前記〔６〕に記載の懸濁液を調製する工程をさらに含む、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の懸濁液又は前記〔７〕に記載の乾燥物を含む、被験物質を検出するためのキット。
〔１１〕コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの製造方法であって、
　平均粒子径が５５ｎｍ以下の銀ナノプレート、金含有水溶性化合物、及び金イオンの錯化剤を含む被覆混合液を調製して、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に前記金層を形成する工程を含み、
　前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が０．０５以上であり、
　前記被覆混合液において、銀濃度（ＣAg）が０．２５ｍＭ以下であり、金濃度（ＣAu）が０．１ｍＭ以上であり、かつＣAgに対するＣAuの比率（ＣAu／ＣAg）が０．５０以上である、製造方法。
〔１２〕前記錯化剤が、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、シアン塩、チオ硫酸、及びチオ尿素からなる群から選択される少なくとも１種である、前記〔１１〕に記載の製造方法。
〔１３〕コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの懸濁液を用意する工程と、
　前記懸濁液と被験物質に対する特異的結合物質との混合液を調製して、前記金被覆銀ナノプレートと前記特異的結合物質とを接触させる工程と
を含む、前記特異的結合物質を担持している金被覆銀ナノプレートの製造方法であって、
　前記銀ナノプレートの平均粒子径が、５５ｎｍ以下であり、前記金層が、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に形成されており、
　前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が０．０５以上であり、
　前記懸濁液が可視光領域に極大吸収波長を有し、前記懸濁液の波長９００ｎｍにおける消光度（Ｅ900）に対する前記極大吸収波長における消光度（Ｅmax）の比率（Ｅmax／Ｅ900）が５以上であり、
　前記懸濁液の極大吸収波長における消光度が２以上であり、前記接触工程における前記特異的結合物質の濃度が、前記混合液全体の容量に対して１００μｇ／ｍＬ以下である、製造方法。
〔１４〕前記懸濁液の極大吸収波長における消光度が１００以下であり、及び／又は、
　前記接触工程における前記特異的結合物質の濃度が、前記混合液全体の容量に対して０．５μｇ／ｍＬ以上である、前記〔１３〕に記載の製造方法。
〔１５〕メンブレンを含むテストストリップと、
　コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートと、
を含む、試料中の被験物質を検出するためのイムノクロマトキットであって、
　前記メンブレン上に、前記被験物質の捕捉用特異的結合物質が固定されており、
　前記金層の平均厚みが、１．０ｎｍ超であり、前記金被覆銀ナノプレートが、前記被験物質の検出用特異的結合物質を担持している、イムノクロマトキット。
〔１６〕前記金層の平均厚みが、１．５ｎｍ～１０．０ｎｍである、前記〔１５〕に記載のイムノクロマトキット。
〔１７〕前記金被覆銀ナノプレートが、乾燥状態で含まれている、前記〔１５〕又は〔１６〕に記載のイムノクロマトキット。
〔１８〕前記テストストリップが、前記金被覆銀ナノプレートを含むコンジュゲートパットを含む、前記〔１５〕～〔１７〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
〔１９〕前記金層が、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に形成されており、
　前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が０．０５以上である、前記〔１５〕～〔１８〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
〔２０〕前記コアとしての銀ナノプレートの平均粒子径が、５５ｎｍ以下である、前記〔１５〕～〔１９〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
〔２１〕前記金被覆銀ナノプレートが、可視光領域に極大吸収波長を有し、前記金被覆銀ナノプレートの波長９００ｎｍにおける消光度（Ｅ900）に対する前記極大吸収波長における消光度（Ｅmax）の比率（Ｅmax／Ｅ900）が５以上である、前記〔１５〕～〔２０〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
〔２２〕前記捕捉用特異的結合物質及び／又は前記検出用特異的結合物質が、抗体を含む、前記〔１５〕～〔２１〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
〔２３〕前記試料が、複数種類の被験物質を含んでおり、
　前記メンブレン上に、前記複数種類の被験物質それぞれに対する捕捉用特異的結合物質が固定されており、
　前記金被覆銀ナノプレートが、前記複数種類の被験物質それぞれに対する検出用特異的結合物質を担持している、前記〔１５〕～〔２２〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
〔２４〕前記捕捉用特異的結合物質が、結合する被験物質の種類ごとに異なる部位に固定されている、前記〔２３〕に記載のイムノクロマトキット。
〔２５〕前記検出用特異的結合物質が、結合する被験物質の種類ごとに異なる極大吸収波長の金被覆銀ナノプレートに担持されている、前記〔２３〕又は〔２４〕に記載のイムノクロマトキット。
〔２６〕前記メンブレンが、イムノクロマトグラフィー試験の成否を判定するコントロール部位をさらに備えている、前記〔１５〕～〔２５〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
〔２７〕前記コントロール部位に特異的に結合するコントロール特異的結合物質をさらに含み、
　前記コントロール特異的結合物質が抗体を含み、かつ前記捕捉用特異的結合物質が抗体を含む場合に、前記コントロール特異的結合物質の抗体は、前記捕捉用特異的結合物質の抗体とは異なる宿主動物に由来している、前記〔２６〕に記載のイムノクロマトキット。
〔２８〕前記金被覆銀ナノプレート以外のナノ粒子をさらに含む、前記〔１５〕～〔２７〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
〔２９〕前記被験物質が、インフルエンザウイルス抗原及びコロナウイルス抗原からなる群から選択される少なくとも１種を含む、前記〔１５〕～〔２８〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
　本発明に従えば、銀ナノプレートを金で被覆する際に、金イオンの錯化剤を使用し、かつ、銀濃度を一定値以下にし、金濃度を一定値以上にして、両濃度が所定の関係を満たすようにそれらを調整することによって、粒子径が小さい割に厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを安定に作製することができる。したがって、酸化耐性に優れた粒子径の小さい金被覆銀ナノプレートを作製することが可能となる。粒子径が小さい金被覆銀ナノプレートは可視光領域に極大吸収波長を有するため、イムノクロマトグラフィーなどの目視判定を必要とする被験物質の検出方法のマルチカラー化を図ることができる。また、粒子径が小さく厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートは、分散性が高く、被験物質に対する特異的結合物質を効率的に担持することができるため、当該特異的結合物質の使用量を節約することが可能となる。
　また、本発明に従えば、厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを使用することにより、たとえ酸化による劣化のリスクの高いフルストリップを用いてイムノクロマトグラフィー試験を行っても、高い検出感度が得られる。
金被覆銀ナノプレートの懸濁液（Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１～３）の分光スペクトルを示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１中の金被覆銀ナノプレートの透過走査電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）観察写真を示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液２中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液３中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を示す。 金被覆銀ナノプレートの懸濁液（Ａｇ＠Ａｕ懸濁液４及び５）の分光スペクトルを示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液４中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液５中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液４中の金被覆銀ナノプレートの高角散乱環状暗視野走査透過顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）観察写真を示す。 金被覆銀ナノプレートの懸濁液（Ａｇ＠Ａｕ懸濁液６及び７）の分光スペクトルを示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液６中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液７中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を示す。 金被覆銀ナノプレートの懸濁液（Ａｇ＠Ａｕ懸濁液８）の分光スペクトルを示す。 塩化ナトリウム水溶液の添加による分光スペクトルへの影響を示す。 塩化ナトリウム水溶液の添加による分光スペクトルへの影響を示す。 金被覆銀ナノプレートの懸濁液（Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９～１１）の分光スペクトルを示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１０中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９中の金被覆銀ナノプレートのＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ観察写真を示す。 Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１０中の金被覆銀ナノプレートのＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ観察写真を示す。 金被覆銀ナノプレートの懸濁液（Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１２～１４）の分光スペクトルを示す。
　以下、本発明をさらに詳細に説明する。
　本発明は、コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの懸濁液に関している。本明細書に記載の「銀ナノプレート」とは、銀から製造されたナノメートル（ｎｍ）オーダーの大きさを持つプレート（板）状粒子のことをいい、主平面となる上面及び下面、並びに、当該上面及び下面の間の端面（側面）を備えており、この端面は平面であっても曲面であってもよく、角が丸まっていてもよい。前記銀ナノプレートの上面と下面の形状は、特に制限されないが、例えば、三角形、四角形、五角形、六角形などの多角形（角が丸みを帯びた形状を含む）又は円形などであってもよい。前記金被覆銀ナノプレートにおいては、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に前記金層が形成されており、いわゆる銀ナノプレートと金層のコアシェル構造が形成されている。
　前記銀ナノプレートの主平面の最大長径を粒子径といい、これは、例えば円形の場合は直径に相当し、三角形の場合は最大辺の長さに相当する。前記銀ナノプレートの上面と下面で最大長径が異なる場合には、長い方をその銀ナノプレートの最大長径とする。本発明の懸濁液に使用される銀ナノプレートの平均粒子径は、約５５ｎｍ以下であり、好ましくは約５０ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、又は約３０ｎｍ以下である。前記銀ナノプレートの平均粒子径の下限値は、特に限定されないが、例えば、約１ｎｍ以上であってもよく、好ましくは約１０ｎｍ以上である。また、前記銀ナノプレートの平均厚さは、特に制限されないが、例えば、約２０ｎｍ以下であってもよく、好ましくは約３～約１５ｎｍである。なお、前記銀ナノプレートの粒子径及び厚さは、例えば、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察、走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）観察、又は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を行って計測してもよく、粒子径に関しては動的光散乱式粒度分布測定装置（ＤＬＳ）で測定してもよい。ＳＥＭ観察写真、ＳＴＥＭ観察写真、又はＴＥＭ観察写真を用いて前記銀ナノプレートの粒子径を計測する場合には、任意の銀ナノプレート１００個の粒子径を計測した合計１００点のデータから、上下１０％を除いた８０点のデータを用意し、それらの平均値を求めることによって平均粒子径を算出してもよい。
　最大長径対それを含む面に直交する軸の幅の比、すなわち「最大長径／厚さ」で定義される指数を「アスペクト比」といい、これはナノプレートの形状を表すための指標の１つとして用いることができる。銀ナノプレートの形状が変わると、その極大吸収波長の位置も変化するので、銀ナノプレートのアスペクトは、極大吸収波長の指標ともいえる。本発明の懸濁液においては、前記銀ナノプレートのアスペクト比は、特に制限されないが、例えば、約１より大きくてもよく、好ましくは約１．５～約１０である。アスペクト比がこのような範囲にあると、水懸濁液中における表面プラズモン共鳴による極大吸収波長を可視光領域に調節しやすい。
　前記金被覆銀ナノプレートの金層は、前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が、約０．０５以上、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．１６以上となるように形成されている。ある態様では、Ｔ／Ｄは、約０．５以下、約０．４以下、又は約０．３以下であってもよい。ある態様では、前記金層の平均厚みは、約１．５ｎｍ～約１０．０ｎｍ又は約２．０ｎｍ～約１０．０ｎｍ、好ましくは約２．０ｎｍ～約８．０ｎｍである。前記金層の厚さがこのような範囲であると、前記銀ナノプレートの光学特性を維持しつつ、当該銀ナノプレートの酸化をより効果的に抑制することができる。なお、前記端面での前記金層の厚みは、高角散乱環状暗視野走査透過顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）を用いて測定することができる。具体的には、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ観察写真から選択した任意の粒子１０個について、各粒子の任意の端部１０点で金の厚さを測定した合計１００点のデータから、上下１０％を除いた８０点のデータを用意し、それらの平均値を求めることによって平均厚み（Ｔ）を算出してもよい。
　また、前記端面での前記金層の厚みは、透過走査顕微鏡を用いて測定した金被覆前後の銀ナノプレートの大きさから算出することもできる。例えば、銀ナノプレートの主平面の形状が円形状の場合には、金被覆前の平均粒子径（ａ）及び金被覆後の平均粒子径（ｂ）を測定し、以下の式：
　　Ｔ＝（ｂ－ａ）／２
によって平均厚み（Ｔ）を算出することができる。銀ナノプレートの主平面の形状が正三角形状の場合には、金被覆前の正三角形の平均高さ（ｃ）及び金被覆後の正三角形の平均高さ（ｄ）を測定し、以下の式：
　　Ｔ＝（ｄ－ｃ）／３
によって平均厚み（Ｔ）を算出することができる。
　本発明の懸濁液が呈する色調は、コアとなる銀ナノプレートの大きさ及び／又は形状と金層の厚さを調整し、前記金被覆銀ナノプレートの極大吸収波長を変化させることによって調整することが可能である。すなわち、前記銀ナノプレートの大きさ及び形状は、その後の金被覆による極大吸収波長の変化を考慮し、本発明の懸濁液が可視光領域に極大吸収波長を有するように調整されている。ある態様では、前記極大吸収波長は、約４００ｎｍ～約６８０ｎｍに存在している。
　本発明の懸濁液中の金被覆銀ナノプレートは、粒子径の均一性が高いため、その懸濁液はシャープな分光スペクトルを示す。すなわち、本発明の懸濁液の色彩は鮮やかであり、彩度が高い。前記懸濁液の波長９００ｎｍにおける消光度（Ｅ900）に対する前記極大吸収波長における消光度（Ｅmax）の比率（Ｅmax／Ｅ900）は、約５以上、好ましくは約１０以上である。ある態様では、本発明の懸濁液においては、前記極大吸収波長における消光度が約２以上又は約４以上であってもよく、好ましくは約２～約１００、更に好ましくは約２～約５０、又は約２～約２０である。特定の理論に拘束されるものではないが、本発明の懸濁液中の金被覆銀ナノプレートは厚い金層を有しているため、高濃度でも安定に存在し得ると考えられる。
　本発明の懸濁液中の金被覆銀ナノプレートを調製するための銀ナノプレートとしては、当技術分野で通常使用されるものを特に制限されることなく採用することができ、例えば、市販品を用いてもよく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の方法に従って製造したものを用いてもよい。他方、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に、上述の条件を満たすような比較的厚い金層を形成しようとする場合、単純に被覆工程における金の濃度を高くしただけでは、銀は金よりも電気陰性度が低いため電子を放出してイオン化しやすくなり、結果としてコアの銀ナノプレートから銀が溶出して被覆前後で光学特性が変化してしまう。特に、本発明の懸濁液における銀ナノプレートは、粒子径が比較的小さく、比表面積が大きいため、酸化の影響を受けやすい。さらに、成長した金層が他の粒子の金層と接触すると、凝集塊が形成されてしまう。そこで、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に前記金層を形成する工程においては、銀濃度（ＣAg）が０．２５ｍＭ以下であり、金濃度（ＣAu）が０．１ｍＭ以上であり、かつＣAgに対するＣAuの比率（ＣAu／ＣAg）が０．５０以上となるように、前記銀ナノプレート、金含有水溶性化合物、及び金イオンの錯化剤を含む被覆混合液を調製して、所定の時間静置する。このような被覆混合液を用いれば、前記金被覆銀ナノプレートを効率よく安定に作製することができる。より詳細には後述を参照されたい。
　本発明の懸濁液においては、固体の金被覆銀ナノプレートが液体の分散媒中に懸濁されている。前記分散媒は、前記金被覆銀ナノプレートを分散できるものであれば特に制限なく採用できるが、例えば、水、水性緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など）、アルコール類（エタノール、メタノールなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、及びテトラヒドロフランなどを１種類又はそれ以上含んでもよく、好ましくは、生化学実験において好適である水又は水性緩衝液を含む。本発明の懸濁液は、静置状態で前記分散媒中に前記金被覆銀ナノプレートが分散しているものであってもよく、静置状態ではそれが沈降しているが振盪や超音波処理によって分散状態になるものであってもよい。
　本発明の懸濁液は、水溶性高分子を任意に含んでもよく、含まなくてもよい。本明細書に記載の「水溶性高分子」とは、分子量が５００以上、好ましくは５００～１，０００，０００、さらに好ましくは５００～１００，０００の水溶性物質のことをいう。本明細書に記載の「水溶性」とは、常温常圧下で高分子が水に０．００１質量％以上溶解することをいう。前記水溶性高分子としては、例えば、ポリスチレンスルホン酸又はそのナトリウム塩、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアリルアミン、デキストラン、ポリメタクリルアミド、ポリビニルフェノール、ポリ安息香酸ビニル、リン脂質ポリマー、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、又は、ビス（ｐ－スルホナトフェニル）フェニルホスフィンを使用してもよく、これらは、前記金被覆銀ナノプレートと化学結合する官能基である水酸基、メルカプト基、ジスルフィド基、アミノ基、カルボキシル基などで修飾されていてもよい。好ましくは、前記水溶性高分子は、ポリスチレンスルホン酸又はそのナトリウム塩、ＰＶＰ、又は、チオール末端ポリエチレングリコールである。
　本発明の懸濁液に含まれる水溶性高分子の種類は、その懸濁液の用途に応じて選択することができる。例えば、生体実験や細胞実験に使用する場合、生体適合性が良好なポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールやポリビニルアルコールなどを用いてもよい。本発明の懸濁液が水溶性高分子を含む場合には、その懸濁液中に溶解又は分散している水溶性高分子の濃度は、例えば１００μＭ以下であってもよく、好ましくは５０μＭ以下、さらに好ましくは１０μＭ以下である。あるいは、前記水溶性高分子の濃度は、例えば１質量％以下であってもよく、好ましくは０．５質量％以下、さらに好ましくは０．１質量％以下である。本発明の懸濁液に水溶性高分子を配合すると、前記懸濁液中において前記金被覆銀ナノプレートの分散安定性が向上する。特定の理論に拘束されるものではないが、水溶性高分子の濃度が１００μＭ以下又は１質量％以下であると、その濃度が１００μＭ又は１質量％を超える場合と比較して、例えば、本発明の懸濁液を被験物質の検出のために用いる際に、被験物質に対する特異的結合物質が前記金被覆銀ナノプレートに良好に担持されるか、又は、被験物質に対する特異的結合物質を担持した前記金被覆銀ナノプレートが被験物質と安定した複合体を形成するため、結果としてその被験物質の検出感度を高めることができる。
　水溶性高分子の濃度の測定方法として、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ））、示唆熱・熱重量測定（ＴＧ－ＤＴＡ）などが挙げられる。ＮＭＲの場合、本発明の懸濁液を乾燥させ、得られた固形分を重溶媒で溶解（分散）させて測定する。重溶媒には既知濃度の内部標準物質（例えば、マレイン酸）を予め添加し、得られたスペクトル中の水溶性高分子由来のシグナルの積分値と内部標準物質由来のシグナルの積分値を比較することで水溶性高分子の濃度を算出することができる。また、ＧＰＣの場合、初めに複数の既知濃度の水溶性高分子水溶液を分析し、得られたチャート中の水溶性高分子由来のピーク面積より検量線を作成する。次に、本発明の懸濁液を測定し、得られたチャート中の水溶性高分子由来のピーク面積より水溶性高分子の濃度を算出することができる。さらに、ＴＧ－ＤＴＡの場合、本発明の懸濁液の乾燥固形分を測定した際の、重量変化から水溶性高分子量を算出することができる。
　本発明の懸濁液は、クエン酸ナトリウムを任意に含んでもよく、含まなくてもよい。クエン酸ナトリウムが含まれていると、前記懸濁液中の前記金被覆銀ナノプレートの分散性が向上する。前記懸濁液がクエン酸ナトリウムを含む場合には、その懸濁液中のクエン酸ナトリウムの濃度は、例えば５０ｍＭ以下であってもよく、好ましくは２５ｍＭ以下、さらに好ましくは１３ｍＭ以下である。クエン酸ナトリウムの濃度が５０ｍＭ以下であると、前記懸濁液中の前記金被覆銀ナノプレートは凝集しにくい。
　本発明の懸濁液は、前記金被覆銀ナノプレートへ悪影響を与えない限り任意の成分を含んでいてもよい。任意成分としては、例えば、金被覆銀ナノプレートを製造する際に用いた試薬（例えば、水素化ホウ素ナトリウムやアスコルビン酸）や分散剤（例えば、分子量が５００より小さいポリエチレングリコール）などが挙げられる。
　ある態様では、本発明の懸濁液は、被験物質を検出することを目的として、被験物質に対する特異的結合物質、すなわち検出試薬を標識するために用いることができる。換言すると、前記金被覆銀ナノプレートは、被験物質に対する特異的結合物質を担持することができる。本明細書に記載の「担持」とは、共有結合若しくは非共有結合又は直接的若しくは間接的な結合などの様式にかかわらず、前記金被覆銀ナノプレートと被験物質に対する特異的結合物質とが結合して複合体を形成していることを意味している。担持の方法としては、通常の担持方法を特に制限なく用いることができ、物理吸着、化学吸着（表面への共有結合）、化学結合（共有結合、配位結合、イオン結合又は金属結合）等を利用して、前記金被覆銀ナノプレートと被験物質に対する特異的結合物質とを直接的に結合させる方法や、前記金被覆銀ナノプレートの表面に前述の水溶性高分子の一部を結合させて、その水溶性高分子の末端又は主鎖若しくは側鎖に、直接的又は間接的に被験物質に対する特異的結合物質を結合させる方法を採用することができる。例えば、被験物質に対する特異的結合物質が抗体である場合には、前記金被覆銀ナノプレートと抗体の溶液とを混合し、振盪し、遠心分離することで、抗体を担持した金被覆銀ナノプレート（標識された検出試薬）を沈殿物として得ることができる。また、前記金被覆銀ナノプレートと抗体とを静電吸着により担持させる場合、マイナス電荷を有するポリスチレンスルホン酸で前記金被覆銀ナノプレート表面を被覆すると、前記抗体の担持効率が向上し得る。なお、前記被験物質に対する特異的結合物質は、前記水溶性高分子と同様に、本発明の懸濁液中での前記金被覆銀ナノプレートの分散安定性を向上し得るので、特に前記被験物質に対する特異的結合物質を担持する金被覆銀ナノプレートの分散剤としても好適である。
　前記被験物質に対する特異的結合物質としては、検出の対象である被験物質を、該被験物質との複合体形成により検出できるものであって、前記金被覆銀ナノプレートを標識として利用することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。被験物質と被験物質に対する特異的結合物質との組み合わせの具体例としては、抗原とそれに結合する抗体、抗体とそれに結合する抗原、糖鎖又は複合糖質とそれに結合するレクチン、レクチンとそれに結合する糖鎖又は複合糖質、ホルモン又はサイトカインとそれに結合する受容体、受容体とそれに結合するホルモン又はサイトカイン、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー、酵素とそれに結合する基質、基質とそれに結合する酵素、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、ＩｇＧとプロテインＡ又はプロテインＧ、プロテインＡ又はプロテインＧとＩｇＧ、T細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４（Ｔｉｍ４）とホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＰＳとＴｉｍ４、あるいは、第１の核酸とそれに結合する（ハイブリダイズする）第２の核酸等があげられる。前記第２の核酸は、前記第１の核酸と相補的な配列を含む核酸であってもよい。
　被験物質が抗原である場合には、該抗原に対する特異的結合物質は抗体であってもよい。前記抗体は、前記抗原に対して特異的に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体又はそれらの断片であってもよく、該断片は、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント又はＦ（ｖ）フラグメントであってもよい。被験物質としての抗原は、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、麦芽アグルチニン及びリシンなどのレクチンであってもよく、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス及びＢ型肝炎ウイルス、ジカウイルス、デングウイルスなどのウイルス又はそれらが有する物質（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス抗原（ＨＢｓ抗原）又はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン）であってもよく、アスペルギルス・フラバス、クラミジア、梅毒トレポネーマ、溶連菌、炭疽菌、黄色ブドウ球菌、赤痢菌、大腸菌、サルモネラ菌、ネズミチフス菌、パラチフス菌、緑膿菌及び腸炎ビブリオ菌などの病原性微生物又はそれらが有する物質（例えば、アスペルギルス・フラバスのアフラトキシン（Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２又はＭ１など）、腸管出血性大腸菌のベロ毒素又は溶連菌のストレプトリジンＯ）であってもよく、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、リウマチ因子及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの血中タンパク質であってもよく、ムチンなどの糖タンパク質であってもよく、インスリン、下垂体ホルモン（例えば、成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロラクチン、又はメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ））、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、甲状腺ホルモン（例えば、ジヨードサイロニン又はトリヨードサイロニン）、絨毛性ゴナドトロピン、カルシウム代謝調節ホルモン（例えば、カルシトニン又はパラトルモン）、膵ホルモン、消化管ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、卵胞ホルモン（例えば、エストロン）、天然又は合成黄体ホルモン（例えば、プロゲステロン）、男性ホルモン（例えば、テストステロン）、及び副腎皮質ホルモン（例えば、コルチゾール）などのホルモンであってもよく、セロトニン、ウロキナーゼ、フェリチン、サブスタンＰ、プロスタグランジン及びコレステロールなどのその他生体内物質であってもよく、前立腺性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、アルカリ性フォスファターゼ、トランスアミナーゼ、トリプシン、ペプシノーゲン、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍マーカーであってもよく、血液型抗原などの糖鎖抗原であってもよく、ヘモグロビン及びトランスフェリンなどの便潜血の検出に用いられるマーカーであってもよく、血液凝固・線溶系において活性型第ＸＩＩＩ因子作用によりクロスリンクを受けた安定化フィブリンがプラスミンによって分解されたフィブリン分解産物の一種であるＤダイマーであってもよく、細胞外小胞が有するタンパク質や核酸であってもよい。そして、被験物質である抗原がホルモン又はサイトカインなどの生体内物質である場合には、該生体内物質に対する特異的結合物質は、抗体だけでなく受容体であってもよく、被験物質である抗原が糖鎖又は糖鎖を有する複合糖質である場合には、該糖鎖又は糖鎖を有する複合糖質に対する特異的結合物質は、抗体だけでなくレクチンであってもよい。また、被験物質としての抗原は、ペニシリン及びカドミウムなどのハプテンであってもよい。
　被験物質が抗体である場合には、該抗体に対する特異的結合物質は抗原であってもよい。前記抗原は、前記抗体に対して特異的に結合する抗原全体又はその断片であってもよく、それらを他の担体と結合した融合物質であってもよい。被験物質としての抗体は、抗環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）抗体又は抗リン脂質抗体などの自己抗体であってもよく、抗クラミジア抗体、抗ＨＩＶ抗体又は抗ＨＣＶ抗体などの外来抗原に対する抗体であってもよい。
　被験物質が糖鎖である場合には、該糖鎖に対する特異的結合物質はレクチンであってもよい。前記レクチンは、前記糖鎖に特異的に結合するガレクチン、Ｃ型レクチン、マメ科レクチン又はそれらの断片であってもよい。被験物質としての糖鎖は、単糖又は多糖であってもよく、それらがタンパク質又は脂質に結合した複合糖質であってもよい。例えば、被験物質がマンノースを含む糖鎖である場合には、該糖鎖に対する特異的結合物質としてマメ科レクチンのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を使用することができる。
　被験物質がレクチンである場合には、該レクチンに対する特異的結合物質は糖鎖であってもよい。前記糖鎖は、前記レクチンに特異的に結合する単糖、多糖、複合糖質又はそれらが他の担体と結合した融合物質であってもよい。被験物質としてのレクチンは、ガレクチン、Ｃ型レクチン又はマメ科レクチンであってもよい。例えば、被験物質がマメ科レクチンのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）である場合には、該レクチンに対する特異的結合物質としてマンノースを含む糖鎖を使用することができる。
　被験物質と被験物質に対する特異的結合物質との組み合わせが、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマーである場合には、核酸アプタマーは、例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、Ｄ群赤痢菌・ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、溶連菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パラチフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）等の細菌、ムチン１等の上皮の細胞表面に表れる腫瘍マーカー、若しくはβ－ガラクトシダーゼやトロンビン等の酵素等と結合するＤＮＡアプタマー、又は、ヒト免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質やＲｅｖタンパク質と結合するＲＮＡアプタマーであってもよく、ペプチドアプタマーは、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の腫瘍性タンパク質ＨＰＶ１６ Ｅ６と結合するペプチドアプタマーであってもよい。
　被験物質がビタミン類である場合には、該ビタミン類に対する特異的結合物質は、ビタミンＤと結合するトランスカルシフェリン及びビタミンＢ１２と結合するトランスコバラミンなどのビタミン結合タンパク質であってもよい。被験物質が抗生物質である場合には、該抗生物質に対する特異的結合物質は、ペニシリンに結合するＰＢＰ１及びＰＢＰ２などのペニシリン結合タンパクであってもよい。
　被験物質又は被験物質に結合する物質としての核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は、それらの増幅物であってもよい。
　別の態様では、本発明は、上述の懸濁液の乾燥物にも関している。本発明の乾燥物は、当技術分野で通常使用される方法によって、前記懸濁液から適宜作製することができる。本発明の乾燥物は、前記金被覆銀ナノプレートを運搬又は保管するのに好適な形態である。ある態様では、前記乾燥物は、凍結乾燥物である。本発明の乾燥物を使用する際には、上述の分散媒を適宜添加して再懸濁し、前記懸濁液を再構成することができる。
　別の態様では、本発明は、上述の懸濁液を使用して、被験物質を検出する方法にも関しており、当該方法は、前記懸濁液中の前記被験物質に対する特異的結合物質を担持している金被覆銀ナノプレートと、前記被験物質とを接触させて、これらの複合体を形成する工程、及び、前記複合体を検出する工程を含んでいる。前記被験物質に対する特異的結合物質を担持している金被覆銀ナノプレートは、本発明の方法を実施する直前に調製してもよい。換言すれば、本発明の方法は、前記被験物質に対する特異的結合物質を担持していない金被覆銀ナノプレートにそれを担持させて、前記被験物質に対する特異的結合物質を担持している金被覆銀ナノプレートの懸濁液を調製する工程をさらに含んでもよい。また、本発明の方法は、前記被験物質に対する特異的結合物質を担持している金被覆銀ナノプレートの懸濁液の乾燥物を再懸濁する工程をさらに含んでもよい。
　前記複合体は、被験物質の検出の分野で通常用いられる手段又は凝集物若しくは沈殿物を検出するのに通常用いられる手段を、特に制限なく利用することによって検出することができる。例えば、前記複合体の形成を、消光度測定、吸光度測定、粒度分布測定、粒子径測定、ラマン散乱光測定、色調変化の観察、凝集又は沈殿形成の観察、イムノクロマトグラフィー法、電気泳動、及び、フローサイトメトリーから成る群から選択される手段によって検出してもよい。
　別の態様では、本発明は、上述の懸濁液又は乾燥物を含む、被験物質を検出するためのキットにも関している。本発明のキットは、被験物質の標準品、イムノクロマト試験紙（テストストリップ）、又は、使用方法を記載した取扱説明書などをさらに含んでもよい。
　別の態様では、本発明は、コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの製造方法にも関しており、当該方法は、平均粒子径が５５ｎｍ以下の銀ナノプレート、金含有水溶性化合物、及び金イオンの錯化剤を含む被覆混合液を調製して、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に前記金層を形成する工程を含んでいる。前記金層は、前記被覆混合液を所定の時間静置することによって形成され得る。前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）は、約０．０５以上であり、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．１６以上である。ある態様では、Ｔ／Ｄは、例えば約０．５以下、約０．４以下、又は約０．３以下であってもよい。
　前記被覆混合液において、銀濃度（ＣAg）は、約０．２５ｍＭ以下であり、好ましくは約０．２０ｍＭ以下である。前記被覆混合液において、金濃度（ＣAu）は、約０．１ｍＭ以上であり、好ましくは約０．１３ｍＭ以上である。そして、前記被覆混合液において、ＣAgに対するＣAuの比率（ＣAu／ＣAg）は、約０．５０以上であり、好ましくは約１．００以上である。ある態様では、ＣAu／ＣAgは、例えば約３．５０以下又は約３．００以下であってもよい。特定の理論に拘束されるものではないが、このような条件下で前記銀ナノプレートの金被覆処理を行うと、前記銀ナノプレートからの銀の溶出による光学特性の変化が抑えられ、かつ、金層の形成中に生じ得る凝集塊の発生も抑えられるため、均一性の高い金被覆銀ナノプレートを効率よく安定に作製することができると考えられる。
　本明細書に記載の「金含有水溶性化合物」とは、金原子を構成要素として含む水溶性化合物のことをいう。前記金含有水溶性化合物は、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に金層を形成できる限り特に制限されないが、例えば、塩化金(III)酸又はそのナトリウム塩若しくはカリウム塩、シアン化金(I)カリウム、シアン化金(II)カリウム、又は、亜硫酸金(I)ナトリウムなどであってもよく、好ましくは、塩化金(III)酸又はそのナトリウム塩若しくはカリウム塩である。
　本明細書に記載の「金イオンの錯化剤」とは、金イオンと錯体を形成することができる化合物のことをいう。前記錯化剤は、前記銀ナノプレートの主平面及び端面への金層形成を妨げない限り特に制限されないが、例えば、亜硫酸塩（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、又は亜硫酸アンモニウムなど）、チオ硫酸塩（チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、又はチオ硫酸アンモニウムなど）、シアン塩（シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、又はシアン化アンモウムなど）、チオ硫酸、チオ尿素、及び、塩化物塩などからなる群から選択される少なくとも１種であってもよく、好ましくは、亜硫酸塩又はチオ硫酸塩などの銀イオンとの錯体形成能が低い化合物（特に亜硫酸ナトリウム又はチオ硫酸ナトリウムなど）である。特定の理論に拘束されるものではないが、前記錯化剤は、前記銀ナノプレートと前記金イオンの接触機会を減らし、被覆反応を穏やかに進めることによって、均一性の高い金被覆銀ナノプレートの安定な作製に寄与し得るものと考えられる。
　前記被覆混合液は、前記金層の形成を妨げない限り任意の成分を含んでいてもよい。任意成分としては、例えば、銀ナノプレートを製造する際に用いた試薬（例えば、水素化ホウ素ナトリウムやアスコルビン酸）や分散剤（例えば、分子量が５００より小さいポリエチレングリコール）などが挙げられる。
　別の態様では、本発明は、コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの懸濁液を用意する工程と、前記懸濁液と被験物質に対する特異的結合物質との混合液を調製して、前記金被覆銀ナノプレートと前記特異的結合物質とを接触させる工程とを含む、前記特異的結合物質を担持している金被覆銀ナノプレートの製造方法にも関している。前記懸濁液において、前記銀ナノプレートの平均粒子径は、約５５ｎｍ以下であり、好ましくは約５０ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、又は約３０ｎｍ以下である。ある態様では、前記銀ナノプレートの平均粒子径は、約１ｎｍ以上であってもよく、好ましくは約１０ｎｍ以上である。前記金層は、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に形成されている。前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）は、約０．０５以上であり、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．１６以上である。ある態様では、Ｔ／Ｄは、例えば約０．５以下、約０．４以下、又は約０．３以下であってもよい。前記懸濁液は可視光領域に極大吸収波長を有し、前記懸濁液の波長９００ｎｍにおける消光度（Ｅ900）に対する前記極大吸収波長における消光度（Ｅmax）の比率（Ｅmax／Ｅ900）は、約５以上、好ましくは約１０以上である。
　前記懸濁液の極大吸収波長における消光度は、約２以上、好ましくは約４以上である。ある態様では、前記懸濁液の極大吸収波長における消光度は、約１００以下、約５０以下又は約２０以下であってもよい。また、前記接触工程における前記特異的結合物質の濃度は、前記混合液全体の容量に対して約１００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは約５０μｇ／ｍＬ以下である。ある態様では、前記接触工程における前記特異的結合物質の濃度は、約０．５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは約１．０μｇ／ｍＬ以上であってもよい。
　従来の金属ナノ粒子は高濃度では凝集しやすいため、担持させる特異的結合物質が分散剤やブロッキング剤としても作用するような濃度で、両者を接触させる必要があった。他方、本発明の製造方法で使用する前記懸濁液中の金被覆銀ナノプレートは、高濃度でも安定に存在し得るため、担持させる特異的結合物質の濃度を低減させることが可能となったと考えられる。
　さらに別の態様では、本発明は、試料中の被験物質を検出するためのイムノクロマトキットにも関しており、当該イムノクロマトキットは、
　前記被験物質の捕捉用特異的結合物質が固定されているメンブレンを含むテストストリップと、
　コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有し、かつ前記被験物質の検出用特異的結合物質を担持する金被覆銀ナノプレートと、
を含んでいる。本発明のイムノクロマトキットにおいて、前記金被覆銀ナノプレートの金層の平均厚みは、従来のイムノクロマトキットに使用されていたものよりも厚く、特に端面において約１．０ｎｍ超である。金層の厚い金被覆銀ナノプレートは、酸化耐性が高いため保存安定性が高く、調製後にすぐに使用しないイムノクロマトキットの形態としても、被験物質を良好な感度で検出することができる。ある態様では、前記金被覆銀ナノプレートの金層の平均厚みは、約１．５ｎｍ～約１０．０ｎｍである。前記金層の厚さがこのような範囲であると、前記銀ナノプレートの光学特性を維持しつつ、当該銀ナノプレートの酸化をより効果的に抑制することができる。
　ある態様では、前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が、約０．０５以上、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．１６以上となるように形成されている。ある態様では、Ｔ／Ｄは、例えば約０．５以下、約０．４以下、又は約０．３以下であってもよい。また、ある態様では、前記金被覆銀ナノプレートは、可視光領域に極大吸収波長を有し、前記金被覆銀ナノプレートの波長９００ｎｍにおける消光度（Ｅ900）に対する前記極大吸収波長における消光度（Ｅmax）の比率（Ｅmax／Ｅ900）は、約５以上であってもよく、好ましくは約１０以上である。すなわち、本発明のイムノクロマトキットには、本発明の一態様として前述した金被覆銀ナノプレートの懸濁液に含まれる金被覆銀ナノプレートを好適に用いることができる。
　本発明のイムノクロマトキット中の金被覆銀ナノプレートとしては、当技術分野で通常使用されるものを特に制限されることなく採用することができ、例えば、市販品を用いてもよく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の方法に従って製造したものを用いてもよい。粒子径が小さい割に厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを製造する場合には、本発明の一態様として前述した金被覆銀ナノプレートの製造方法により製造することができる。
　ある態様では、本発明のイムノクロマトキットにおいて、前記金被覆銀ナノプレートは、乾燥状態で含まれている。前記金被覆銀ナノプレートを乾燥する方法は、特に制限されないが、例えば、前記金被覆銀ナノプレートを常温減圧下で乾燥させてもいいし、凍結乾燥によって乾燥させてもよい。本発明で用いられる金被覆銀ナノプレートは、金層が厚く酸化耐性が高いため、このような形態とすることが可能となる。
　前記捕捉用特異的結合物質とは、前記被験物質に対する特異的結合物質のうち、特に前記メンブレンに固定されているものをいい、前記検出用特異的結合物質とは、前記被験物質に対する特異的結合物質のうち、特に前記金被覆銀ナノプレートに担持されているものをいう。これらを総称して「被験物質に対する特異的結合物質」ということもある。被験物質と被験物質に対する特異的結合物質との組み合わせの具体例としては、前掲のものが挙げられる。
　ある態様では、前記試料が、複数種類の被験物質を含んでおり、
　前記メンブレン上に、前記複数種類の被験物質それぞれに対する捕捉用特異的結合物質が固定されており、
　前記金被覆銀ナノプレートが、前記複数種類の被験物質それぞれに対する検出用特異的結合物質を担持している。すなわち、本発明のイムノクロマトキットによって、複数種類の被験物質を同時に検出することが可能である。この場合、前記捕捉用特異的結合物質は、結合する被験物質の種類ごとに異なる部位に固定されていてよい。また、前記検出用特異的結合物質は、結合する被験物質の種類ごとに異なる極大吸収波長の金被覆銀ナノプレートに担持されていてもよい。このようにすると、検出する被験物質ごとに異なる場所で又は異なる色で着色が観察されるため、前記被験物質の検出が容易になる。
　特定の態様では、前記被験物質が、インフルエンザウイルス抗原及びコロナウイルス抗原からなる群から選択される少なくとも１種を含む。前記インフルエンザウイルス抗原は、特に限定されないが、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス抗原及び／又はＢ型インフルエンザウイルス抗原を含んでもよい。前記コロナウイルス抗原は、特に限定されないが、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗原及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含んでもよい。
　ある態様では、前記テストストリップが、前記金被覆銀ナノプレートを含むコンジュゲートパットを含んでいる。本明細書に記載の「コンジュゲートパッド」とは、前記金被覆銀ナノプレートが含侵している部位であり、ここへ前記試料を添加すると、前記金被覆銀ナノプレートが溶出し、前記メンブレン上での展開（流動）を開始するように構成されている。前記コンジュゲートパッドは、当技術分野で通常使用される任意の方法によって作製することができる。
　ある態様では、前記メンブレンが、イムノクロマトグラフィー試験の成否を判定するコントロール部位をさらに備えている。前記コントロール部位は、特に限定されないが、例えば、前記検出用特異的結合物質を捕捉することのできる抗体などの物質を固定したコントロールラインであってもよい。特定の態様では、本発明のイムノクロマトキットは、前記コントロール部位に特異的に結合するコントロール特異的結合物質をさらに含んでいる。前記コントロール特異的結合物質は、前記金被覆銀ナノプレートと一緒に、前記コンジュゲートパッドに含まれていてもよい。また、ブロッキング溶液又は洗浄溶液への浸漬中又はこれらの溶液の展開中や、前記試料の展開中に、前記捕捉用特異的結合物質が前記メンブレンから流出し、前記コントロール部位に到達することがあることを考慮すると、前記コントロール部位における判定を妨げないようにするためには、前記コントロール特異的結合物質は、前記検出用特異的結合物質だけでなく前記捕捉用特異的結合物質とも前記コントロール部位において競合しないものであることが好ましい。例えば、前記コントロール特異的結合物質が抗体を含み、かつ前記捕捉用特異的結合物質が抗体を含む場合には、前記コントロール特異的結合物質の抗体としては、前記捕捉用特異的結合物質の抗体とは異なる宿主動物に由来しているものを採用してもよい。
　ある態様では、本発明のイムノクロマトキットは、前記金被覆銀ナノプレート以外のナノ粒子をさらに含む。特に、前記ナノ粒子として前記金被覆銀ナノプレートとは異なる色を呈するものを採用することにより、検出部位及び／又はコントロール部位において着色できる色の選択肢を広げることができる。前記ナノ粒子としては、イムノクロマトグラフィー試験に使用することができる限り特に制限されないが、例えば、金ナノ粒子及びパラジウム被覆金ナノ粒子などであってもよい。
　本発明のイムノクロマトキットは、本発明の目的を損なわない限り、当技術分野で通常使用される任意の構成をさらに備えてもよい。例えば、前記イムノクロマトキットは、被験物質の標準品、緩衝液、又は、使用方法を記載した取扱説明書などをさらに含んでもよい。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
１．調製例１
（１）銀ナノプレートの種粒子の調製
　２．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液２００ｍＬに、０．５ｇ／Ｌのポリスチレンスルホン酸（分子量７０，０００）水溶液１０ｍＬと、１０ｍＭの水素化ほう素ナトリウム水溶液１１．５ｍＬとを撹拌しながら添加し、次いで、０．７４ｍＭの硝酸銀水溶液２００ｍＬを８６ｍＬ／分で添加した。撹拌停止後、得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に６０分間静置し、銀ナノプレート種粒子の水分散液（シード懸濁液）を作製した。
（２）銀ナノプレート水分散液の調製
　蒸留水２０００ｍＬに、１０ｍＭのアスコルビン酸水溶液４５ｍＬと、上記シード懸濁液７２ｍLを撹拌しながら添加した。次いで、７．４ｍＭの硝酸銀水溶液１２０ｍＬを２６ｍＬ／分で添加した。得られた溶液に、２５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液２０ｍＬを添加し、撹拌を停止した。得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター（２３℃）中に２０時間静置し、銀ナノプレート水分散液１（ＡｇＰＬ懸濁液１）を調製した。このＡｇＰＬ懸濁液１の銀濃度は０．４１ｍＭと計算された。そして、調製された銀ナノプレートの平均粒子径は２４．８ｎｍだった。なお、この平均粒子径は、ＡｇＰＬ懸濁液１を走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）で観察し、任意の銀ナノプレート１００個の最大長径を計測した合計１００点のデータから上下１０％を除いた８０点のデータの平均値を求めることによって算出した。
　また、上記シード懸濁液の使用量を３００ｍＬ又は２４ｍＬに変えた以外は同様の方法で、ＡｇＰＬ懸濁液２及びＡｇＰＬ懸濁液３をそれぞれ調製した。調製された銀ナノプレートの平均粒子径は、それぞれ１３．２ｎｍ（ＡｇＰＬ懸濁液２）及び４８．４ｎｍ（ＡｇＰＬ懸濁液３）であった。
（３）銀ナノプレートの金被覆処理
　蒸留水１５０ｍＬに、２４ｍＭの塩化金酸水溶液を１４ｍＬ、２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を８ｍＬ、１０ｍＭの亜硫酸ナトリウム水溶液を１０３ｍＬ混合して、成長溶液１を調製した。そして、蒸留水３１２ｍＬに、ＡｇＰＬ懸濁液１を３１２ｍＬ、５質量％のポリビニルピロリドン水溶液を６９ｍＬ、５００ｍＭのアスコルビン酸水溶液を１４ｍＬ、５００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を１４ｍＬ、１００ｍＭの亜硫酸ナトリウム水溶液を３ｍＬ、成長溶液１を２７５ｍＬ混合して室温で２４時間静置し、金被覆銀ナノプレートの水分散液１（Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１）を調製した。そして、成長溶液１を１．３３倍又は２倍に希釈して使用した以外は同様の方法で、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液２及びＡｇ＠Ａｕ懸濁液３をそれぞれ調製した。Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１～３を適宜希釈し、分光光度計　Ｖ－７７０（日本分光株式会社製）により測定した分光スペクトルを図１に示す。そして、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１～３中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を、それぞれ図２～４に示す。
　また、ＡｇＰＬ懸濁液１に代えてＡｇＰＬ懸濁液２又はＡｇＰＬ懸濁液３を使用し、かつ２．５倍又は２倍に希釈した成長溶液１をそれぞれ使用した以外はＡｇ＠Ａｕ懸濁液１と同様の方法で、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液４及びＡｇ＠Ａｕ懸濁液５をそれぞれ調製した。Ａｇ＠Ａｕ懸濁液４又は５を適宜希釈し、分光光度計　Ｖ－７７０（日本分光株式会社製）により測定した分光スペクトルを図５に示す。そして、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液４及び５中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真をそれぞれ図６及び７に示し、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液４中の金被覆銀ナノプレートのＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ観察写真を図８に示す。
　比較例として、金被覆反応時にＡｇＰＬ懸濁液１を倍量（６２４ｍＬ）使用して蒸留水を使用しなかった以外はＡｇ＠Ａｕ懸濁液１と同様の方法で、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液６を調製した。また、成長溶液１に代えて成長溶液２（蒸留水２５ｍＬに、２４ｍＭの塩化金酸水溶液を２８ｍＬ、２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を１６ｍＬ、１０ｍＭの亜硫酸ナトリウム水溶液を２０６ｍＬ混合して調製したもの）を使用した以外はＡｇ＠Ａｕ懸濁液６と同様の方法で、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液７を調製した。Ａｇ＠Ａｕ懸濁液６又は７を適宜希釈し、分光光度計　Ｖ－７７０（日本分光株式会社製）により測定した分光スペクトルを図９に示す。そして、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液６及び７中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真を、それぞれ図１０及び１１に示す。
　そして、特許文献２（国際公開第２０１５／１８２７７０号）の実施例１に記載の懸濁液Ａ１の調製方法に従って、金被覆銀ナノプレートの水分散液を調製し、炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨを７．３に調整して、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液８を調製した。Ａｇ＠Ａｕ懸濁液８を適宜希釈し、分光光度計　Ｖ－７７０（日本分光株式会社製）により測定した分光スペクトルを図１２に示す。
（４）金被覆銀ナノプレートの特性
　Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１～８を透過走査顕微鏡で観察し、各懸濁液中の金被覆銀ナノプレートの端面における金層の平均厚みを算出した。具体的には、計算の便宜のため形状が円形状の金被覆銀ナノプレートを選定して平均粒子径を測定し、金被覆前に測定していた平均粒子径との差を２で割って、端面における金層の平均厚みを算出した。表１に、金被覆操作時の混合液の銀濃度及び金濃度、コアの銀ナノプレートの平均粒子径及び端面における金層の平均厚み、並びに、金被覆銀ナノプレートの極大吸収波長及び当該極大吸収波長又は９００ｎｍにおける消光度をまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１～５は、いずれも鮮やかな色を呈しており、シャープな分光スペクトルを示した（図１及び５）。また、いずれの懸濁液においても均一な粒子が形成されていた（図２～４及び６～８）。一方、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液６及び７の呈する色は濁りが感じられ、それらの分光スペクトルにおいては、極大吸収波長より長波長側でも光の吸収が観察された（図９）。そして、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液６及び７中には、凝集して連なった粒子も多く観察された（図１０及び１１）。極大吸収波長より長波長側にも光の吸収が観察され、全体として彩度が低下したのは、このような凝集塊が影響したからだと考えられる。したがって、厚い金層を有する金被覆銀ナノ粒子を均一に作製し、彩度の高い懸濁液を作製するためには、金の錯化剤を添加して金濃度を高くするだけでは足りず、銀濃度を下げて、銀濃度及び金濃度が所定の関係を満たすように調整する必要がある。
２．酸化耐性試験例１
　Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１～８に対して、終濃度が５％となるように塩化ナトリウム水溶液をそれぞれ添加し、添加前後での色調変化を目視で観察した。また、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液３及び８について、塩化ナトリウム水溶液の添加前後の分光スペクトルを測定して比較した。結果を表２並びに図１３及び１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１～７の金被覆銀ナノプレートは厚い金層を有するため、塩化ナトリウムの添加前後で色調は変化せず、分光スペクトルも変化していなかった（表２及び図１３）。一方、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液８の金被覆銀ナノプレートは金層が薄いため、塩化ナトリウムの添加によりコアの銀ナノプレートが容易に酸化し、その形状が変化して、分光スペクトル及び色調が大きく変化してしまった（表２及び図１４）。
　実施例の金被覆銀ナノプレートの酸化耐性向上作用が、水溶性高分子（ポリビニルピロリドン）の分散安定化作用とは関係がないことを確認するため、当該金被覆銀ナノプレートを洗浄した後に、塩化ナトリウムによる酸化耐性試験を実施した。具体的には、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１～８中の金被覆銀ナノプレートを遠心分離で沈殿させ、上清を除去後、０．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液を添加し、沈殿した金被覆銀ナノプレートを再分散させた。同様の操作を二回繰り返し、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１’～８’を調製した。各Ａｇ＠Ａｕ懸濁液は極大吸収波長における消光度が２．０になるように濃度を調整した。これらの懸濁液に対して、終濃度が５％となるように塩化ナトリウム水溶液をそれぞれ添加し、添加前後での色調変化を目視で観察した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　洗浄操作を行って水溶性高分子の大部分を除去しても、酸化耐性試験の結果は変わらなかった。すなわち、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１～７においては、厚い金層のおかげで塩化ナトリウムの添加前後での懸濁液の色調は変化せず、金層の薄いＡｇ＠Ａｕ懸濁液８では、塩化ナトリウムの添加によりコアの銀ナノプレートが容易に酸化し、その形状が変化して、色調が大きく変化してしまった（表３）。
３．イムノクロマトグラフィー試験例１
　Ａｇ＠Ａｕ懸濁液３中の金被覆銀ナノプレートを遠心分離で沈殿させ、上清を除去後、０．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液を添加し、沈殿した金被覆銀ナノプレートを分散させた。同様の操作を二回繰り返し、最終的に極大吸収波長における消光度が２．０になるように、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液の濃度を調整した。この懸濁液１ｍＬを、５ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）で５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）抗体溶液０．１ｍＬと混合して、得られた混合液を室温下で６０分間静置した。ここへ８０μＭのポリエチレングリコール溶液（５ｍＭのホウ酸緩衝液中）を０．０５ｍＬ添加して、得られた懸濁液を室温下で３０分間静置した。次いで、０．５ｍＭのウシ血清アルブミン溶液（５ｍＭのホウ酸緩衝液中）を０．１００ｍＬ添加し、得られた懸濁液を室温下で６０分間静置した。これを遠心分離して前記抗体と金被覆銀ナノプレートとの複合体を沈殿させ、上澄み液を除去した。その後、前記複合体に２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（８μＭのポリエチレングリコール、０．２５ｍＭのＢＳＡ、及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を０．４０ｍＬ添加して再分散させ、極大吸収波長の消光度が１．０になるように濃度を調整して、展開液３を作製した。また、同様にして、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液４及び５から、それぞれ展開液４及び５を作製した。
　吸水パッドが一方の端に取付けられている短冊形のニトロセルロースメンブレンを備えたイムノクロマト試験紙（株式会社フォーディクス製）の中央部に、抗ｈＣＧ抗体を捕捉抗体として直線状に固定した。イムノクロマト試験紙の吸水パッドが取り付けられていない方の端を、２００ｍＩＵ／ｍＬのｈＣＧを含む又は含まない試験液（０．２５ｍＭのＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）５０μＬに浸して、これをイムノクロマト試験紙に展開した。次に、展開液３～５のいずれか６０μＬを展開した。最後に、捕捉抗体を固定していた部分の着色を、目視又は輝度解析によって評価した。輝度解析では、展開液３～５を展開した後のイムノクロマト試験紙をスキャナー（装置名：ＣａｎｏＳｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）によりスキャニングし、検出ライン（捕獲抗体を固定した部分）及び当該検出ライン以外の部分（対照領域）の最低輝度（着色すると低くなる）を、画像解析ソフトＩｍａｇｅ－Ｊ（アメリカ国立衛生研究所でＷａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェア；ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて数値化した。より具体的には、各部分の最低輝度をそれぞれ５回ずつ測定し、得られた数値の中央値を検出ライン又は対照領域の最低輝度として採用した。そして、対照領域の最低輝度から検出ラインの最低輝度を引いて、輝度差を求めた。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（目視判定の基準）
　＋＋：鮮明な着色あり
　＋　：着色あり
　－　：着色なし
　厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートに検出抗体を担持させて、イムノクロマトグラフィー法に使用することができた。粒子径の異なる銀ナノプレートをコアに採用することにより、被験物質を種々の色調で標識することができた。
４．調製例２
　上記項目１（２）に記載の方法に準じ、シード懸濁液の使用量を１００ｍＬ又は４２ｍＬに代えた以外はそれと同様にして、ＡｇＰＬ懸濁液４及びＡｇＰＬ懸濁液５をそれぞれ調製した。調製された銀ナノプレートの平均粒子径は、それぞれ２０．２ｎｍ（ＡｇＰＬ懸濁液４）及び３２．８ｎｍ（ＡｇＰＬ懸濁液５）であった。
　上記項目１（３）に記載の方法に準じ、ＡｇＰＬ懸濁液１に代えてＡｇＰＬ懸濁液４を使用し、かつ１．７倍に希釈した成長溶液１を使用した以外はＡｇ＠Ａｕ懸濁液１と同様の方法で、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９を調製した。また、ＡｇＰＬ懸濁液１に代えてＡｇＰＬ懸濁液５を使用し、かつ１．４倍に希釈した成長溶液１を使用した以外はＡｇ＠Ａｕ懸濁液１と同様の方法で、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１０を調製した。そして、ＡｇＰＬ懸濁液１に代えてＡｇＰＬ懸濁液２を使用し、かつ２．９倍に希釈した成長溶液１を使用した以外はＡｇ＠Ａｕ懸濁液１と同様の方法で、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１１を調製した。Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９～１１を適宜希釈し、分光光度計　Ｖ－７７０（日本分光株式会社製）により測定した分光スペクトルを図１５に示す。そして、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９及び１０中の金被覆銀ナノプレートのＳＴＥＭ観察写真をそれぞれ図１６及び１７に示し、当該金被覆銀ナノプレートのＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ観察写真をそれぞれ図１８及び１９に示す。
　上記項目１（４）の記載に従って、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９～１１中の金被覆銀ナノプレートの端面における金層の平均厚みを算出した。表５に、金被覆操作時の混合液の銀濃度及び金濃度、コアの銀ナノプレートの平均粒子径及び端面における金層の平均厚み、並びに、金被覆銀ナノプレートの極大吸収波長及び当該極大吸収波長又は９００ｎｍにおける消光度をまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９～１１は、いずれも鮮やかな色を呈しており、シャープな分光スペクトルを示した（図１５）。また、懸濁液９～１１のいずれの懸濁液においても均一な粒子が形成されていた（図１６～１９）。
５．酸化耐性試験例２
　Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９～１１に対して、塩化ナトリウムの終濃度が５％となるように塩化ナトリウム水溶液をそれぞれ添加し、添加前後での色調変化を目視で観察した。Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９～１１の金被覆銀ナノプレートは厚い金層を有するため、塩化ナトリウムの添加前後で色調は変化しなかった（表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　また、上記項目２に記載の方法と同様にして金被覆銀ナノプレートを洗浄し、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９’～１１’を調製した。各Ａｇ＠Ａｕ懸濁液は極大吸収波長における消光度が２．０になるように濃度を調整した。これらの懸濁液に対して、終濃度が５％となるように塩化ナトリウム水溶液をそれぞれ添加し、添加前後での色調変化を目視で観察した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　洗浄操作を行って水溶性高分子（ポリビニルピロリドン）の大部分を除去しても、厚い金層のおかげで塩化ナトリウムの添加前後での懸濁液の色調は変化せず、酸化耐性試験の結果は変わらなかった（表７）。
６．被験物質に対する特異的結合物質の担持方法の例
　Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１０中の金被覆銀ナノプレートを遠心分離で沈殿させ、上清を除去後、０．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液を添加し、沈殿した金被覆銀ナノプレートを分散させた。同様の操作を二回繰り返し、最終的に極大吸収波長における消光度が２、４、又は８になるようにクエン酸三ナトリウム水溶液を添加し、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１０（２）、１０（４）、及び１０（８）を調製した。なお、濃度が高い懸濁液は適宜希釈してから消光度を測定し、希釈倍率を乗算して原液の消光度を算出した。
　抗体の終濃度が後掲の表６に記載の濃度になるように、５０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ抗体溶液（５ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ７．５）を、１ｍＬのＡｇ＠Ａｕ懸濁液１０（２）、１０（４）、又は１０（８）に添加して、この混合液を室温で６０分間静置した。そこに８０μＭのポリエチレングリコール溶液（５ｍＭのホウ酸緩衝液中）を５０μＬ添加して、得られた懸濁液を室温で３０分間静置した。次いで、０．５ｍＭのウシ血清アルブミン溶液（５ｍＭのホウ酸緩衝液中）を１００μＬ添加し、得られた懸濁液を室温で６０分間静置した。このとき、各懸濁液の色調に変化はなく、分散状態も良好だった。他方、イムノクロマト試験の標識としてよく用いられている金ナノコロイド（球状金ナノ粒子；粒子径４０ｎｍ）の懸濁液を使用して同様の操作を行うと、極大吸収波長での消光度が２．０で抗体の終濃度が１．２５μｇ／ｍＬ又は極大吸収波長での消光度が４．０で抗体の終濃度が２．５０μｇ／ｍＬの条件では、球状金ナノ粒子が凝集してしまい、イムノクロマト試験に使用できるような状態ではなかった。なお、球状金ナノ粒子に対する抗体の担持は、通常は、極大吸収波長での消光度が１．０で抗体の終濃度が５μｇ／ｍＬの条件下で行われる。
　金被覆銀ナノプレートの各懸濁液を遠心分離し、抗ｈＣＧ抗体を担持している金被覆銀ナノプレートを沈殿させて、上清を除去した。沈殿した金被覆銀ナノプレートに、２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（８μＭのポリエチレングリコール、０．２５ｍＭのＢＳＡ、及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を０．４０ｍＬ添加して再分散させ、極大吸収波長の消光度が１．０になるように濃度を調整し、イムノクロマト試験用の展開液１０（２）－１、１０（２）－２、１０（４）－１、１０（８）－１、及び１０（８）－２を作製した。抗ｈＣＧ抗体の担持条件及び対応する展開液を表８にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　展開液１０（２）－１、１０（２）－２、１０（４）－１、１０（８）－１、及び１０（８）－２を使用した以外は上記項目３に記載したのと同様の方法で、ｈＣＧを検出するイムノクロマト試験を実施した。結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　一般に、金属ナノ粒子への抗体の担持工程においては、金属ナノ粒子の凝集が問題となり得る（表８の球状金ナノ粒子の結果参照）。金属ナノ粒子の凝集を防ぐため、その懸濁液には一定以上のタンパク質濃度が必要となるので、金属ナノ粒子の濃度を高くする場合には、それだけ抗体の濃度も高くすることが求められる。しかしながら、意外なことに、粒子径が小さく厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを用いた場合には、比表面積が増加するにもかかわらず、当該金被覆銀ナノプレートを濃くしたときに抗体濃度を下げても凝集が発生しなかった。加えて、異なる抗体濃度条件下で前記金被覆銀ナノプレートを担持工程に付しても、イムノクロマト試験で使用したときの検出感度に大きな差は無かった。したがって、粒子径が小さく厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートは、分散性が優れており、抗体担持の効率が高いと考えられる。
　以上より、銀ナノプレートを金で被覆する際に、金イオンの錯化剤を使用し、かつ、銀濃度を一定値以下にし、金濃度を一定値以上にして、両濃度が所定の関係を満たすようにそれらを調整することによって、粒子径が小さい割に厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを均一に作製できることが分かった。したがって、酸化耐性に優れた粒子径の小さい金被覆銀ナノプレートを作製することが可能となる。粒子径が小さい金被覆銀ナノプレートは可視光領域に極大吸収波長を有するため、イムノクロマトグラフィーなどの目視判定を必要とする被験物質の検出方法のマルチカラー化を図ることができる。また、粒子径が小さく厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートは、分散性が高く、被験物質に対する特異的結合物質を効率的に担持することができるため、当該特異的結合物質の使用量を節約することが可能となる。
７．調製例３
（１）金被覆銀ナノプレートの用意
　本発明のイムノクロマトキットに用いる金被覆銀ナノプレートとして、前述のＡｇ＠Ａｕ懸濁液９～１１を用意した。従来の例としては、特許文献１（特許第６４４０１６６号）の実施例に記載の金属微粒子Ａ、Ｂ及びＣの調製方法に従って、金被覆銀ナノプレートの懸濁液、すなわちＡｇ＠Ａｕ懸濁液１２（黄色調）、１３（赤色調）、及び１４（青色調）を調製した。Ａｇ＠Ａｕ懸濁液４～６を適宜希釈し、分光光度計Ｖ－７７０（日本分光株式会社製）により測定した分光スペクトルを図３に示す。また、上記（４）に記載の方法に従って測定したＡｇ＠Ａｕ懸濁液４～６中の金被覆銀ナノプレートの端面における金層の平均厚みは、それぞれ０．１４ｎｍ、０．２１ｎｍ、及び０．３１ｎｍであり、いずれも１．０ｎｍより薄かった。
（２）金被覆銀ナノプレートへの抗体の担持
　Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９中の金被覆銀ナノプレートを遠心分離で沈殿させ、上清を除去後、０．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液を添加し、沈殿した金被覆銀ナノプレートを分散させた。同様の操作を二回繰り返し、最終的に極大吸収波長における消光度が２．０になるように、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液の濃度を調整した。この懸濁液１ｍＬを、５ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）で５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）抗体（宿主動物：マウス）の溶液０．１ｍＬと混合して、得られた混合液を室温下で６０分間静置した。次いで、０．５ｍＭのウシ血清アルブミン溶液（５ｍＭのホウ酸緩衝液中）を０．１００ｍＬ添加し、得られた懸濁液を室温下で６０分間静置した。これを遠心分離して前記抗体と金被覆銀ナノプレートとの複合体を沈殿させ、上澄み液を除去した。その後、前記複合体に５０μＬの２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（０．０５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｍｗ：２０，０００）、０．２５ｍＭのＢＳＡ、及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を添加して再分散し、抗ｈＣＧ抗体を担持したＡｇ＠Ａｕの懸濁液９（抗ｈＣＧ抗体／Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９）を作製した。また、同様にして、ＡｇＡｕ懸濁液１０～１４から、抗ｈＣＧ抗体を担持したＡｇ＠Ａｕの懸濁液１０～１４（抗ｈＣＧ抗体／Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１０～１４）をそれぞれ作製した。
（３）コンジュゲートパッドの作製
　２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２；０．０５％のポリエチレングリコール（Ｍｗ：２０，０００）及び４％のスクロースを含む）９００μＬを、３００μＬの抗ｈＣＧ抗体／Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９と混合した。この混合液を、縦８ｍｍ×横３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ＧＲＡＤＥ ８９６４、ＡＨＬＳＴＲＯＭ製）の全面に、４０μＬ／ｃｍの量で均一に塗布した後、真空デシケーター（アズワン製）に入れ、減圧ポンプ（ベルト駆動型油回転真空ポンプＴＳＷ－５０Ｎ、佐藤真空株式会社製）で一晩乾燥して、抗ｈＣＧ抗体を担持したＡｇ＠Ａｕを含むコンジュゲートパッド１を作製した。また、同様にして、抗ｈＣＧ抗体／Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１０～１４から、抗ｈＣＧ抗体を担持したＡｇ＠Ａｕを含むコンジュゲートパッド２～６をそれぞれ作製した。
（４）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
　ニトロセルロース製のメンブレンの検出部位に、０．５ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ抗体（宿主動物：マウス）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液を、１μＬ／ｃｍの量で均一に直線状に塗布し、当該検出部位の上端側のコントロール部位に、０．５ｍｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ抗体（宿主動物：ラビット）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液を、１μＬ／ｃｍの量で均一に直線状に塗布して、これらの抗体をメンブレン上に固定した。このメンブレンを、５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）（０．５％のカゼイン含む）でブロッキングした。ブロッキングしたメンブレンを、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）（０．５％のスクロース、０．０１％のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む）に浸して洗浄し、乾燥させた。
　乾燥後のメンブレンを、縦４０ｍｍ×横６０ｍｍのバッキングシート（ＧＬ－５７８８８、Ｌｏｈｍａｎｎ製）の粘着テープ部に貼り付けて、当該メンブレンの下端側に２ｍｍ重なるように、抗ｈＣＧ抗体を担持したＡｇ＠Ａｕを含むコンジュゲートパッド１～６のいずれかを貼り付けた。次いで、２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を含浸させた縦１７ｍｍ×横６０ｍｍのサンプルパッド（ＧＲＡＤＥ０３１９、Ａｈｌｓｔｒｏｍ製）を、前記コンジュゲートパッドの前記メンブレンと反対側に、それと４ｍｍ重なるように貼り付けた。そして、前記メンブレンの上端側に５ｍｍ重なるように、縦２０ｍｍ×横６０ｍｍの吸水パッド（ＧＲＡＤＥ０２７０、Ａｈｌｓｔｒｏｍ製）を貼り付けた。最後に、メンブレン、コンジュゲートパッド、サンプルパッド、及び吸水パッドを備えたバッキングシートを、縦６０ｍｍ、横５ｍｍの短冊状にロールカッターでカットし、これをハウジングケース（Ｔｙｐｅ―Ｔハウジングケース、トラストメディカル製）に設置することでテストストリップ［ｈＣＧ＋Ｍ］を作製した。
８．イムノクロマトグラフィー試験例２
　上記項目７（４）で作製したテストストリップ［ｈＣＧ＋Ｍ］のサンプルパッドに、ｈＣＧを２５０ｍＩＵ／ｍＬの濃度で含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（０．２５ｍＭのＢＳＡを含む）又はｈＣＧを含まない同リン酸緩衝生理食塩水（ブランク）を１００μＬ滴下し、メンブレン上に展開させた。そして、検出部位及びコントロール部位の着色を、目視によって以下の基準で評価し、ｈＣＧを含む被験サンプルを展開したときには輝度解析も行った。
（目視判定の基準）
　＋＋：鮮明な着色あり
　＋　：着色あり
　－　：着色なし
　輝度解析では、被験サンプルを展開した後のテストストリップをスキャナー（装置名：ＣａｎｏＳｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）によりスキャニングし、検出部位、コントロール部位、及びこれら以外の部位（対照領域）の最低輝度（着色すると低くなる）を、画像解析ソフトＩｍａｇｅ－Ｊ（アメリカ国立衛生研究所でＷａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェア；ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて数値化した。より具体的には、各部分の最低輝度をそれぞれ５回ずつ測定し、得られた数値の中央値を検出部位、コントロール部位、又は対照領域の最低輝度として採用した。そして、対照領域の最低輝度から検出部位又はコントロール部位の最低輝度を引いて、輝度差を求めた。結果を表１０及び表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　金層の平均厚みが１．０ｎｍよりも大きい金被覆銀ナノプレート（Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９～１１）を使用したイムノクロマトグラフィー試験においては、ｈＣＧを含まない被験サンプルを展開したときにコントロール部位の着色だけが観察され、試験系として成立していることが確認されたが、金層の平均厚みが１．０ｎｍよりも小さい金被覆銀ナノプレート（Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１２～１４）を使用したイムノクロマトグラフィー試験においては、コントロール部位の着色が観察できず、試験系として機能していなかった（表１０）。これは、金被覆銀ナノプレートが酸化によって劣化したからであると考えられる。また、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９～１１を使用したイムノクロマトグラフィー試験において、ｈＣＧを含む被験サンプルを展開すると、検出部位においてｈＣＧを良好に検出することができた（表１１）。
９．調製例４
（１）金被覆銀ナノプレートへの抗体の担持
　抗体の溶液として、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１１に対しては５ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）で５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した抗Ｂ型インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ－Ｂ）抗体（宿主動物：マウス）、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液１０に対しては同様に希釈した抗Ａ型インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ－Ａ）抗体（宿主動物：マウス）、Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９に対しては同様に希釈した抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣｏＶ２）抗体（宿主動物：マウス）を使用したことと、２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液に０．０５ｗｔ％のＬｉｐｉｄｕｒｅ ＢＬ８０２（日油株式会社）を含むことと、ＰＥＧを含まないこと以外は上記項目７（２）と同様にして、抗Ｆｌｕ－Ｂ抗体を担持したＡｇ＠Ａｕの懸濁液（懸濁液Ａ）、抗Ｆｌｕ－Ａ抗体を担持したＡｇ＠Ａｕの懸濁液（懸濁液Ｂ）、及び抗ＣｏＶ２抗体を担持したＡｇ＠Ａｕの懸濁液（懸濁液Ｃ）をそれぞれ作製した。
（２）コントロール用抗体の調製
　特許第６７１６６３２号の実施例に記載の「懸濁液Ｅ」の調製方法に従って、表面処理パラジウム被覆金ナノロッドを含む黒色の水分散液（Ａｕ＠Ｐｄ懸濁液）を調製した。そして、懸濁液としてＡｕ＠Ｐｄ懸濁液を使用し、抗体の溶液として５ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈したラビットＩｇＧを使用したことと、２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液に０．０５ｗｔ％のＬｉｐｉｄｕｒｅ ＢＬ８０２（日油株式会社）を含むこと以外は上記項目７（２）と同様にして、ラビットＩｇＧを担持したＡｕ＠Ｐｄの懸濁液（懸濁液Ｒ）を作製した。
（３）コンジュゲートパッドの作製
　抗ｈＣＧ抗体／Ａｇ＠Ａｕ懸濁液９に代えて懸濁液Ａ～Ｃの混合液又は懸濁液Ａ～Ｃ及びＲの混合液を使用したことと、２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液に０．０５ｗｔ％のＬｉｐｉｄｕｒｅ　ＢＬ８０２（日油株式会社）を含むことと、ＰＥＧを含まないこと以外は上記項目７（３）と同様にして、コンジュゲートパッド［ＡＢＣ］及びコンジュゲートパッド［ＡＢＣ＋Ｒ］をそれぞれ作製した。なお、懸濁液Ａ～Ｃの混合液は、懸濁液Ａ～Ｃのそれぞれの極大吸収波長における吸光度の比（Ａ：Ｂ：Ｃ）が２：１：２となるように各懸濁液を混合したものであり、懸濁液Ａ～Ｃ及びＲの混合液は、懸濁液Ａ～Ｃのそれぞれの極大吸収波長における吸光度及び懸濁液Ｒの５５０ｎｍにおける吸光度の比（Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｒ）が２：１：２：０．１５となるように各懸濁液を混合したものである。
（４）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
　ニトロセルロース製のメンブレンの検出部位に、当該メンブレンの下端から上端に向かって順に０．２５ｍｇ／ｍＬの抗ＣｏＶ２抗体を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（１０％のスクロースを含む）、０．２５ｍｇ／ｍＬの抗Ｆｌｕ－Ａ抗体を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（１０％のスクロースを含む）、及び０．２５ｍｇ／ｍＬの抗Ｆｌｕ－Ｂ抗体を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（１０％のスクロースを含む）を、それぞれ直線状に塗布し、かつ当該検出部位の上端側のコントロール部位に、２．１ｍｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ抗体（宿主動物：ラビット）を塗布し、かつコンジュゲートパッドとしてコンジュゲートパッド［ＡＢＣ］を使用した以外は上記項目７（４）と同様にして、テストストリップ［ＡＢＣ＋Ｍ］を作製した。また、検出部位に塗布する抗体溶液の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに変更し、かつコントロール部位に塗布する抗体溶液を０．３ｍｇ／ｍＬの抗ラビットＩｇＧ抗体（宿主動物：ゴート）に変更して、さらにコンジュゲートパッドとしてコンジュゲートパッド［ＡＢＣ＋Ｒ］を使用した以外はテストストリップ［ＡＢＣ＋Ｍ］と同様にして、テストストリップ［ＡＢＣ＋Ｒ］を作製した。
１０．イムノクロマトグラフィー試験例３
　上記項目９（４）で作製したテストストリップ［ＡＢＣ＋Ｍ］又はテストストリップ［ＡＢＣ＋Ｒ］のサンプルパッドに、以下の被験サンプル（ａ）～（ｅ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（０．２５ｍＭのＢＳＡを含む）を１００μＬ滴下し、メンブレン上に展開させた。そして、上記項目８に記載の方法に従って、検出部位及びコントロール部位の着色を評価した。結果を表１２及び１３に示す。
　（ａ）ブランク（抗原なし）
　（ｂ）Ｆｌｕ－Ａ抗原（１．５μｇ／ｍＬ）
　（ｃ）Ｆｌｕ－Ｂ抗原（５．０μｇ／ｍＬ）
　（ｄ）ＣｏＶ２抗原（３．０μｇ／ｍＬ）
　（ｅ）Ｆｌｕ－Ａ抗原（１．５μｇ／ｍＬ）＋Ｆｌｕ－Ｂ抗原（５．０μｇ／ｍＬ）＋
　　　　ＣｏＶ２抗原（３．０μｇ／ｍＬ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　テストストリップ［ＡＢＣ＋Ｍ］及びテストストリップ［ＡＢＣ＋Ｒ］のいずれを使用した場合でも、Ｆｌｕ－Ａは青色、Ｆｌｕ－Ｂは黄色、ＣｏＶ２は赤色で検出されたが、テストストリップ［ＡＢＣ＋Ｒ］を使用したときの方が大きい輝度差で検出された。また、コントロール部位の色について、テストストリップ［ＡＢＣ＋Ｍ］においては、青色、黄色、及び赤色の金被覆銀ナノプレートが混ざった混色として黒色を呈しており、テストストリップ［ＡＢＣ＋Ｒ］においては、パラジウム被覆金ナノロッドの色調として黒色を呈していた。
　なお、テストストリップ［ＡＢＣ＋Ｍ］において、検出部位に固定する抗体の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとすると、コントロール部位の黒色が消失してしまった。これは、固定していた抗体が、ブロッキング溶液又は洗浄溶液への浸漬中又はこれらの溶液の展開中や、被験サンプルの展開中にメンブレンの上端側に流出し、コントロール部位の抗マウスＩｇＧ抗体に対して、金被覆銀ナノプレートに担持された抗体と競合的に結合したためであると考えられる。すなわち、被験物質の捕捉用特異的結合物質が、コントロール部位に結合する物質と競合する場合には、前記捕捉用特異的物質の固定量を増やして検出感度を高めようとすると、コントロールの判定ができなくなるというリスクがある。他方、テストストリップ［ＡＢＣ＋Ｒ］のように、被験物質の捕捉用特異的結合物質が、コントロール部位に結合する物質と競合しない場合には、前記捕捉用特異的物質の固定量を増やすことにより、コントロールの判定に悪影響を与えることなく検出感度を高めることが可能となる。
　以上より、厚い金層を有する金被覆銀ナノプレートを使用することにより、イムノクロマトグラフィー試験の検出感度を高めることができ、マルチカラー解析も可能になることが分かった。したがって、微量の被験物質もイムノクロマトグラフィー試験により簡便に検出することが可能となる。

Claims (29)

  1. 　コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの懸濁液であって、
    　前記銀ナノプレートの平均粒子径が、５５ｎｍ以下であり、前記金層が、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に形成されており、
    　前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が０．０５以上であり、
    　前記懸濁液が可視光領域に極大吸収波長を有し、前記懸濁液の波長９００ｎｍにおける消光度（Ｅ900）に対する前記極大吸収波長における消光度（Ｅmax）の比率（Ｅmax／Ｅ900）が５以上である、懸濁液。
  2. 　前記金層の平均厚みが、１．５ｎｍ～１０．０ｎｍである、請求項１に記載の懸濁液。
  3. 　前記コアとしての銀ナノプレートのアスペクト比が、１より大きく１０以下である、請求項１又は２に記載の懸濁液。
  4. 　前記極大吸収波長が、４００ｎｍ～６８０ｎｍに存在している、請求項１～３のいずれか１項に記載の懸濁液。
  5. 　前記極大吸収波長における消光度が２以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載の懸濁液。
  6. 　前記金被覆銀ナノプレートが、被験物質に対する特異的結合物質を担持している、請求項１～５のいずれか１項に記載の懸濁液。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の懸濁液の乾燥物。
  8. 　請求項６に記載の懸濁液を使用して、被験物質を検出する方法であって、
    　前記懸濁液中の前記金被覆銀ナノプレートと前記被験物質とを接触させて、これらの複合体を形成する工程、及び、
    　前記複合体を検出する工程を含む、方法。
  9. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の懸濁液中の前記金被覆銀ナノプレートに、前記被験物質に対する特異的結合物質を担持させて、請求項６に記載の懸濁液を調製する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の懸濁液又は請求項７に記載の乾燥物を含む、被験物質を検出するためのキット。
  11. 　コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの製造方法であって、
    　平均粒子径が５５ｎｍ以下の銀ナノプレート、金含有水溶性化合物、及び金イオンの錯化剤を含む被覆混合液を調製して、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に前記金層を形成する工程を含み、
    　前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が０．０５以上であり、
    　前記被覆混合液において、銀濃度（ＣAg）が０．２５ｍＭ以下であり、金濃度（ＣAu）が０．１ｍＭ以上であり、かつＣAgに対するＣAuの比率（ＣAu／ＣAg）が０．５０以上である、製造方法。
  12. 　前記錯化剤が、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、シアン塩、チオ硫酸、及びチオ尿素からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートの懸濁液を用意する工程と、
    　前記懸濁液と被験物質に対する特異的結合物質との混合液を調製して、前記金被覆銀ナノプレートと前記特異的結合物質とを接触させる工程と
    を含む、前記特異的結合物質を担持している金被覆銀ナノプレートの製造方法であって、
    　前記銀ナノプレートの平均粒子径が、５５ｎｍ以下であり、前記金層が、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に形成されており、
    　前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が０．０５以上であり、
    　前記懸濁液が可視光領域に極大吸収波長を有し、前記懸濁液の波長９００ｎｍにおける消光度（Ｅ900）に対する前記極大吸収波長における消光度（Ｅmax）の比率（Ｅmax／Ｅ900）が５以上であり、
    　前記懸濁液の極大吸収波長における消光度が２以上であり、前記接触工程における前記特異的結合物質の濃度が、前記混合液全体の容量に対して１００μｇ／ｍＬ以下である、製造方法。
  14. 　前記懸濁液の極大吸収波長における消光度が１００以下であり、及び／又は、
    　前記接触工程における前記特異的結合物質の濃度が、前記混合液全体の容量に対して０．５μｇ／ｍＬ以上である、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　メンブレンを含むテストストリップと、
    　コアとしての銀ナノプレートと、前記銀ナノプレートを被覆する金層とを有する金被覆銀ナノプレートと、
    を含む、試料中の被験物質を検出するためのイムノクロマトキットであって、
    　前記メンブレン上に、前記被験物質の捕捉用特異的結合物質が固定されており、
    　前記金層の平均厚みが、１．０ｎｍ超であり、前記金被覆銀ナノプレートが、前記被験物質の検出用特異的結合物質を担持している、イムノクロマトキット。
  16. 　前記金層の平均厚みが、１．５ｎｍ～１０．０ｎｍである、請求項１５に記載のイムノクロマトキット。
  17. 　前記金被覆銀ナノプレートが、乾燥状態で含まれている、請求項１５又は１６に記載のイムノクロマトキット。
  18. 　前記テストストリップが、前記金被覆銀ナノプレートを含むコンジュゲートパットを含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  19. 　前記金層が、前記銀ナノプレートの主平面及び端面に形成されており、
    　前記銀ナノプレートの平均粒子径（Ｄ）に対する前記端面での前記金層の平均厚み（Ｔ）の比率（Ｔ／Ｄ）が０．０５以上である、請求項１５～１８のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  20. 　前記コアとしての銀ナノプレートの平均粒子径が、５５ｎｍ以下である、請求項１５～１９のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  21. 　前記金被覆銀ナノプレートが、可視光領域に極大吸収波長を有し、前記金被覆銀ナノプレートの波長９００ｎｍにおける消光度（Ｅ900）に対する前記極大吸収波長における消光度（Ｅmax）の比率（Ｅmax／Ｅ900）が５以上である、請求項１５～２０のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  22. 　前記捕捉用特異的結合物質及び／又は前記検出用特異的結合物質が、抗体を含む、請求項１５～２１のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  23. 　前記試料が、複数種類の被験物質を含んでおり、
    　前記メンブレン上に、前記複数種類の被験物質それぞれに対する捕捉用特異的結合物質が固定されており、
    　前記金被覆銀ナノプレートが、前記複数種類の被験物質それぞれに対する検出用特異的結合物質を担持している、請求項１５～２２のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  24. 　前記捕捉用特異的結合物質が、結合する被験物質の種類ごとに異なる部位に固定されている、請求項２３に記載のイムノクロマトキット。
  25. 　前記検出用特異的結合物質が、結合する被験物質の種類ごとに異なる極大吸収波長の金被覆銀ナノプレートに担持されている、請求項２３又は２４に記載のイムノクロマトキット。
  26. 　前記メンブレンが、イムノクロマトグラフィー試験の成否を判定するコントロール部位をさらに備えている、請求項１５～２５のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  27. 　前記コントロール部位に特異的に結合するコントロール特異的結合物質をさらに含み、
    　前記コントロール特異的結合物質が抗体を含み、かつ前記捕捉用特異的結合物質が抗体を含む場合に、前記コントロール特異的結合物質の抗体は、前記捕捉用特異的結合物質の抗体とは異なる宿主動物に由来している、請求項２６に記載のイムノクロマトキット。
  28. 　前記金被覆銀ナノプレート以外のナノ粒子をさらに含む、請求項１５～２７のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  29. 　前記被験物質が、インフルエンザウイルス抗原及びコロナウイルス抗原からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１５～２８のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
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