KR20190121466A - 항체 배향성이 향상된 카르복실화 양자점-항체 복합체 - Google Patents
항체 배향성이 향상된 카르복실화 양자점-항체 복합체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 카르복실화 양자점과 항체 중합 시 유발되는 응집, 무작위 항체분자 배열 등을 개선하고 이를 측면유동 면역분석 기법에 적용한 항체 배향성이 향상된 카르복실화 양자점-항체 복합체를 제공한다.
Description
본 발명은 카르복실화 양자점-항체 복합체에 관한 것으로서, 더 상세하게는 재현성이 낮은 무작위 항체-양자점 중합법을 개선하여 항체 배향성이 향상된 카르복실화 양자점-항체 복합체에 관한 것이다.
생명과학 분야에서 형광 신호 발생체로 주로 사용되는 형광 염료(fluorescent dye)에 비해 양자점(quantum dot; QD)은 높은 양자 수득률(quantum yield)로 인해 새로운 형광 표지자로 주목을 받아오고 있다. 최근 소개되는 형광 기반의 현장진단(point-of-care testing; POCT) 진단 기법들은 대부분 형광 염료를 기반으로 하고 있는데 이는 QD의 표면 개질(surface modification) 및 중합법에 대한 기술 수립이 상대적으로 낮은 것에 기인한다고 사료된다. 이러한 POCT 진단 기법 중 가장 실용적이라고 알려진 측면유동 면역크로마토그래피(lateral-flow immunochromatography; LF-ICA)는 주로 골드 나노입자(gold nanoparticle, colloidal gold)를 사용해 왔으나 분석민감도(sensitivity) 및 정량분석의 어려움으로 인하여, 최근 효소(enzyme) 및 형광 분석으로 LF-ICA 기술개발이 이루어지고 있다. 예를 들어 국내의 LF-ICA 관련 업체들 중 바디텍메드가 i-chroma라는 형광탐지 키트를 출시하고 있고, 휴마시스, 나노엔텍 및 SD 바이오센서 등도 형광 정량 키트 제작을 위해 제품 개발을 하고 있다. 하지만 이들 업체들은 QD이 아닌 전통적인 형광염료를 사용하고 있어 경쟁력 확보를 위해 QD을 이용한 형광탐지 키트의 개발이 필수적이라 할 수 있다. 이와 관련하여 ThermoFisher Scientific 사에서 amine-, carboxyl- 기능기로 표면을 개질해서 제품을 출시하고 있고 amine- 기능기는 EDC, NHS 반응, carboxyl- 기능기는 EDC 반응으로 단백질을 중합하는 방법을 프로토콜로 제시하고 있다(https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q21301MP).
그러나 상기 선행기술인, EDC는 그 방법이 간편하긴 하지만 무작위(random)로 amine(NH2)-carboxyl(COOH)결합을 유도하므로 단백질에 일반적으로 다량으로 분포하는 amine, carboxyl로 인하여 복합체의 비균일성(non-uniformity) 및 응집(aggregation)과 같은 현상이 발생하고 이에 따라 단백질의 손실, 재현성 확보의 어려움을 유발하여 전체적인 시스템의 비효율성을 야기할 수 있어 상용화 측면에서 반드시 개선이 이루어져야 한다. 특히 항체의 경우는 일반적으로 100 μg당 30∼50만원의 고가의 생체물질이므로 경제적인 측면에서도 상당히 비효율적이다.
본 발명은 카르복실화 양자점과 복합체 제조 시 무작위로 고정화되는 항체분자의 배향성을 향상시켜 높은 균일성과 낮은 비특이 흡착의 특성을 지닌 항체 배향성이 향상된 카르복실화 양자점-항체 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 항체가 양자점과 연결된 항체-양자점 복합체에 있어서, 상기 항체 분자는 두 중쇄의 힌지(hinge) 부분의 이황화결합(disulfide bonds)이 환원제에 의해 티올기(thiol functional groups)로 변환된 후, 표면에 LC-SMCC{succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amido- caproate)} 링커가 결합된 카르복실화(carboxylated) 양자점(quantum dot)과 상기 링커를 통해 결합되며, 이 때 상기 항체 분자의 3차원 구조가 유지되고 항체 배향성이 향상된 항체-양자점 복합체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 항체-양자점 복합체가 인쇄 또는 코팅된 기재를 포함하는 면역 형광탐지키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항체 분자의 두 중쇄의 힌지 부분(hinge region)을 환원제로 환원시키는 환원단계; 상기 환원된 항체 분자의 카르복실화 양자점(quantum dot)을 LC-SMCC 링커를 이용하여 연결하는 양자점 연결단계; 결합되지 않은 양자점 및 항체 분자를 제거하는 미반응 물질 제거단계를 포함하는, 상기 항체 분자의 3차원 구조가 유지되고 배향성이 향상된 항체-양자점 복합체의 제조방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 카르복실화 양자점-항체 복합체는 카르복실화 양자점과 복합체 제조 시 무작위로 고정화되는 항체분자의 배향성을 향상시켜 높은 균일성과 낮은 비특이 흡착의 특성을 지닌 복합체 제작을 통해 형광측정 시 민감도 향상 고감도의 분석민감도를 달성할 수 있어 신속 진단 분야로의 파급효과가 크다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 형광 복합체를 이용한 측면유동 면역크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 항체-QD 중합법의 제조과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 3은 본 발명의 항체-QD 복합체에 비오틴화(biotinylation) 제조과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 4는 본 발명의 스트렙트아비딘(streptavidin)-QD 중합법의 제조과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 5는 종래 EDC 기반의 중합법을 통한 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 항체 분자의 모식도와 적용 가능한 화학 작용기를 나타내는 그림이다.
도 7은 본 발명의 부위-특이적 표지(site-specific labeling)를 위한 항체 분자 힌지 부분(hinge region)의 이황화결합 부위와 maleimide 작용기 결합 부위를 나타내는 그림(a) 및 환원 후 SDS-PAGE 분석 결과이다(b).
도 8은 동적광산란(dynamic light scattering) 장비를 사용하여 종래 방식의 EDC 기반의 복합체와 본 발명의 항체-QD 복합체의 크기 분포를 분석한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 항체-QD 복합체의 항체분자 정량화를 ELISA 분석을 통해 분석한 그래프이다.
도 10은 Maleimide-DTT 기반 항체-QD 복합체를 이용한 LF-ICA 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 Avidin-biotin 반응 기반의 신호 증폭 개념을 나타내는 그림이다.
도 12는 본 발명의 항체-QD 복합체 상 biotinylation 여부을 ELISA를 이용하여 분석한 그래프이다.
도 13은 SA-QD 중합체의 SA의 중합여부를 ELISA를 이용하여 분석한 그래프이다.
도 14는 이중 복합체(dual conjugates)를 이용하여 신호 증폭 여부를 측면유동 면역크로마토그래피로 확인한 사진이다.
도 2는 본 발명의 항체-QD 중합법의 제조과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 3은 본 발명의 항체-QD 복합체에 비오틴화(biotinylation) 제조과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 4는 본 발명의 스트렙트아비딘(streptavidin)-QD 중합법의 제조과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 5는 종래 EDC 기반의 중합법을 통한 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 항체 분자의 모식도와 적용 가능한 화학 작용기를 나타내는 그림이다.
도 7은 본 발명의 부위-특이적 표지(site-specific labeling)를 위한 항체 분자 힌지 부분(hinge region)의 이황화결합 부위와 maleimide 작용기 결합 부위를 나타내는 그림(a) 및 환원 후 SDS-PAGE 분석 결과이다(b).
도 8은 동적광산란(dynamic light scattering) 장비를 사용하여 종래 방식의 EDC 기반의 복합체와 본 발명의 항체-QD 복합체의 크기 분포를 분석한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 항체-QD 복합체의 항체분자 정량화를 ELISA 분석을 통해 분석한 그래프이다.
도 10은 Maleimide-DTT 기반 항체-QD 복합체를 이용한 LF-ICA 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 Avidin-biotin 반응 기반의 신호 증폭 개념을 나타내는 그림이다.
도 12는 본 발명의 항체-QD 복합체 상 biotinylation 여부을 ELISA를 이용하여 분석한 그래프이다.
도 13은 SA-QD 중합체의 SA의 중합여부를 ELISA를 이용하여 분석한 그래프이다.
도 14는 이중 복합체(dual conjugates)를 이용하여 신호 증폭 여부를 측면유동 면역크로마토그래피로 확인한 사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "면역크로마토그래피(immunochromatography)"은는 기공(pore)이 있는 멤브레인(membrane)을 이용하여 항원-항체가 결합하는 면역반응을 통해 질병을 진단하는 검사기법으로 면역측량법의 샌드위치법을 기반으로한 항원의 검출방법이다. 특이항체를 국소적으로 고정화한 여(과)지 또는 막여과기 등에 금 콜로이드 또는 색소 등으로 표지한 특이항체와 항원을 고정화하고 있는 특이항체에 한정하여 좁은 정색(呈色)밴드를 나타내고 정색의 정도에 따라 항원유무, 양 등을 판정한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "카르복실화(carboxylated)"는 이산화탄소를 고정해서 카르복실기로 하는 반응이고 탈탄소반응의 역반응이다. 카르복실라제(carboxylase)에 의해서 촉매된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "양자점(quantum dot)"은 특정 원자가 수백~수천개 모인 입자들로써, 여기서 입자란 양자(quantum)를 나노미터(nm) 단위로 합성시킨 반도체 결정을 말한다. 양자점에 자외선을 쪼이면 같은 성분의 입자라도 입자의 크기에 따라 다양한 색을 나타낸다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 항체가 양자점과 연결된 항체-양자점 복합체에 있어서, 상기 항체 분자는 두 중쇄의 힌지(hinge) 부분의 이황화결합(disulfide bonds)이 환원제에 의해 티올기(thiol functional groups)로 변환된 후, 표면에 LC-SMCC{succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amido- caproate)} 링커가 결합된 카르복실화(carboxylated) 양자점(quantum dot)과 상기 링커를 통해 결합되며, 이 때 상기 항체 분자의 3차원 구조가 유지되고 항체 배향성이 향상된 항체-양자점 복합체가 제공된다.
상기 항체-양자점 복합체에 있어서, 상기 카르복실화 양자점은 비오틴이 추가적으로 표지된 것일 수 있고 스트렙타비딘이 코팅된 양자점 첨가시 자가 조립(self association)에 의해 신호가 증폭될 수 있으며 상기 환원제는 디티오트레이톨(dithiothreitol)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 항체-양자점 복합체가 인쇄 또는 코팅된 기재를 포함하는 면역 형광탐지키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항체 분자의 두 중쇄의 힌지 부분(hinge region)을 환원제로 환원시키는 환원단계; 상기 환원된 항체 분자의 카르복실화 양자점(quantum dot)을 LC-SMCC 링커를 이용하여 연결하는 양자점 연결단계; 결합되지 않은 양자점 및 항체 분자를 제거하는 미반응 물질 제거단계를 포함하는, 상기 항체 분자의 3차원 구조가 유지되고 배향성이 향상된 항체-양자점 복합체의 제조방법이 제공된다.
상기 항체-양자점 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 환원제는 디티오트레이톨(dithiothreitol)일 수 있다.
일반적으로 시중에 출시되는 QD은 표면 개질을 위한 화학 작용기가 다양하지 않은 실정이므로, 주로 EDC 반응을 통한 항체 중합법을 제시한 경우가 대부분이다. EDC 기반의 랜덤 중합과 부위 특이적(site-specific) 중합법은 근본적으로 homobifunctional과 heterobifunctional cross-linking 중합에서 야기될 수 있는 현상들을 QD에서도 그대로 보여주는데, 랜덤 방식은 간편하고 비교적 짧은 시간에 중합을 구현할 수 있지만 중합 조건에 따라 균일화를 이룰 수가 없는 것이 단점이라 할 수 있다. 반면 제한적인 항체의 작용기를 이용하여 수행된 중합법은 분자간의 입체 장해(steric hindrance) 현상을 감소시켜 응집체(aggregation) 형성을 최소화할 수 있는데, 좀 더 정의된 (defined) 중합법 수립을 위해서는 고려가 되어야 할 사항이라고 사료된다. 최근 FRET과 같은 현상을 이용하여 QD의 유용성을 극대화 하고자 하는 연구가 진행되고 있으나 연구적인 측면에서 이루어지고 있으며 상업적인 측면에서의 QD 이용은 제한적으로 진행되고 있는 것으로 사료된다. QD을 본격적으로 LF-ICA에 적용한 것은 대략 2010년 이후이나 일반적인 conjugation 방법(EDC를 이용한 amine-carboxyl 커플링)으로 항체-QD 중합을 수행하였으며 논문의 경우에도 단순하게 항체-QD 복합체로 LF-ICA를 실시하였다(Zhaohui Li et al., Analytical Chemistry, 82 (16), pp 7008-7014, 2010) 및 (Anna N. Berlina et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, Volume 405, Issue 14, pp 4997-5000, 2013).
형광 POCT 제품 중에 많이 알려진 Alere Triage 제품의 경우에도 QD이 아닌 비드(Bead)를 사용하여 형광 염료를 충진시켜 사용하고 있어 현재 QD의 체외진단(In vitro diagnostics; IVD) 적용에 대한 기술적 난제들을 해결하고 QD이 가진 물리화학적 특성을 극대화 시킨다면 향후 체외진단 시장을 선도할 수 있는 기반을 구축할 수 있을 것이라 사료된다. 이에 본 발명자는 재현성이 낮은 종래 무작위 항체-양자점 중합법을 개선하고자 예의 노력한 결과 카르복실화 양자점과 항체 중합 시 유발되는 응집, 무작위 항체분자 배열 등을 개선하고 이를 측면유동 면역분석 기법에 적용하여 고감도 형광분석 시스템을 구축하였다. 본 발명의 중합법을 이용하여 제조된 항체-QD 복합체는 응집현상 최소화, 복합체의 균일도 향상, 신호 증폭, 적은 양의 항체사용으로 인한 경제적 효과, 항체분자의 배향성 증가를 기대할 수 있다.
상기 제시한 항체-QD 복합체는 새로운 conjugation 방법을 통해 상기 문제점을 개선하고자 하였으며, 이와 더불어 분석 민감도 향상을 위한 신호증폭 기법도 추가적으로 수행하였다. 우선 새로운 중합법은 maleimide - thiol 반응에 기반한 것으로 QD에 말레인이미드(maleimide) 작용기를 부여하고 항체의 힌지(hinge) 부위에 존재하는 이황화결합(disulfide bonds)의 환원을 통해 이루어진다. 이는 EDC 기반의 랜덤(random) 방식에 비해 부위 특이적으로 구현이 가능하며, 균일성(uniformity) 및 재현성 향상을 구현할 수 있다. 신호 증폭의 경우에는 두 개의 QD에 비오틴(biotin)과 스트렙타아비딘(streptavidin)을 각각 중합시켜 LF-ICA 분석 시 증폭 효과를 유도하는 것인데, 형광 신호는 QD의 절대량에 비례하므로 분석물질(target analyte) 당 최대의 QD이 참여할 수 있도록 하였다. 이와 같은 접근 방법을 통해 좀 더 향상된 형광신호 탐지가 LF-ICA 기법을 통해 구현이 될 수 있다(도 1).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: Maleimide-thiol 기반 항체-QD 복합체 제조
본 발명자들은 말레인이미드-티올 기반의 복합체를 제조하기 위해 먼저, 카르복실화 양자점(quantum dot, QD)(제우스, Zeus, )에 LC-SMCC{succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)} (Thermo Scientific, catalog #: 22362) 결합을 통한 말레인이미드 기능기 도출과 디티오트레이톨(dithiothreitol)(Thermo Scientific, catalog #: 20290)을 이용한 항체의 힌지 부위의 이황화결합(disulfide bond)의 환원 공정을 수행하였다.
구체적으로 회전교반기(orbital shaker)를 이용하여 QD과 EDC를 1:1000 비율로 2시간동안 반응 시킨 후 Zeba 스핀 컬럼(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 free EDC를 제거하였다. 그 후 회전교반기에서 0.5% casein/PBS와 1시간 동안 반응시켜 casein 코팅을 한 후, 원심분리(15000 RPM, 30분, 총 3회)를 통해 유리 casein을 제거하였으며, 상기 casein 코팅된 QD에 LC-SMCC cross-linker를 1:100 비율로 1시간동안 반응시켜 상기 LC-SMCC cross-linker로 casein 코팅된 QD를 활성화시킨 후, Zeba 스핀 컬럼(MWCO 40K, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 유리 LC-SMCC를 제거하였다. 아울러, 항체 2.5 nmole에 DTT가 최종 10 mM이 되도록 혼합하여 1시간 동안 반응시킴으로써 항체의 중쇄 사이의 힌지 부위를 환원시켰으며 Zeba 스핀 컬럼(MWCO 40K)를 이용하여 유리 DTT를 제거하였다. 그런 다음, 상기 LC-SMCC 크로스링커로 활성화시킨 QD과 환원된 항체를 혼합하여 2시간동안 반응시켰고 원심분리(15,000 RPM, 15 분, 총 3회)를 통해 유리 항체를 제거함으로써, 항체-QD 복합체를 제조하였다(도 2).
실시예 2: 항체-QD 복합체 상 비오틴화(biotinyation)
본 발명자들은 신호증폭을 위해 상기 실시에 2에서 제조한 항체-QD 복합체에 추가적으로 비오틴화(biotinylation) 공정을 수행하였다. 먼저, 원심분리(15000 RPM, 15분, 3회)를 통해 casein과 Tween20 제거하였고 QD 대비 30배의 sulfo-NHS-LC-LC-biotin를 첨가하여 상온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 상기 항체-QD 복합체를 바이오틴화한 후, Zeba spin(MWCO 40K)를 이용하여 유리 sulfo-NHS-LC-LC-biotin을 제거하였다(도 3).
실시예 3: Streptavidin - QD 복합체 제조
본 발명자들은 비오틴(Biotin)이 표지된 QD 복합체의 자가 결합(self-association)을 통한 신호증폭을 위해 양자점(QD)에 스트렙타아비딘(streptavidin, SA) 분자를 코팅한 스트렙타비딘-QD 복합체를 제조하였다. 구체적으로 회전교반기를 이용하여 QD과 EDC를 1:1000 비율로 2시간 동안 반응시키고 Zeba 스핀 컬럼(MWCO 7K)을 이용하여 유리 EDC를 제거하였다. 그 후, 회전교반기에서 0.5% casein/PBS와 1시간 동안 반응시킨 후 원심분리(15,000 RPM, 30 분, 총 3회)를 통해 유리 casein을 제거하였다. 이어서 회전교반기에서 LC-SMCC 가교제를 1:100 비율로 1시간 동안 반응시켰고 Zeba 스핀 컬럼(MWCO 40K)를 이용하여 유리 LC-SMCC를 제거함으로써 말레이미드 활성화 QD를 제조하였다. 이어 스트렙타비딘에 LC-SPDP 가교제를 몰비율 20배로 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. LC-SPDP 가교제로 활성화된 스트렙타비딘에 DTT를 최종 10 mM이 되도록 첨가한 후, 1시간 동안 반응시키고 Zeba 스핀 컬럼(MWCO 7K)을 이용하여 유리 DTT 및 유리 LC-SPDP를 제거한 후 회전교반기에서 상기 말레이미드 활성화 QD와 상기 LC-SPDP 활성화된 스트렙타비딘을 상온 2시간 또는 4℃에서 밤새도록 반응시킨 후 원심분리(15,000 RPM, 30 분, 총 2회)를 통해 유리 스트렙타디빈을 제거하였다(도 4).
실시예 4: EDC 기반의 복합법에 의한 분석
종래 EDC 기반의 복합체화의 분석 모델 물질은 C-reactive protein(CRP), 반응 완충액은 0.5% casein/10 mM PBS(pH 7.4) 및 0.1% Tween20을 이용하였고 이미지 분석을 위해 핸드헬드(handheld) 타입의 UV lamp(파장 365 nm)를 사용하여 형광 반응을 관찰하였다. 그 결과, EDC 기반의 복합법을 통한 LF-ICA는 대략적으로 10 ng/mL 수준에서 육안으로 확인 가능한 LOD(limit of detection)를 나타내었다. 보통 골드 나노입자를 이용하여 CRP 분석 시 1 ng/mL의 LOD를 보이는 것에 비해 EDC 기반의 복합법을 이용한 분석에서는 낮은 감도를 보이는 것은 상기 복합법의 비효율성과 육안 관찰로 인한 한계성 등에 기인할 수 있다. 또한 시료가 흡수되는 현상에도 영향을 미치는데 LF-ICA 분석의 시료 흡수 속도에 비해 현저하게 느린 현상을 관찰하였다. 이는 큰 사이즈의 복합체 응집체(aggregate)가 형성 되어 시료 흡수 시 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane) 패드 경계면에서 정체 현상을 유발하기 때문이라고 사료된다(도 5).
실시예 5: Site-specific labeling을 위한 항체 절편
본 발명자들은 새로운 복합법 모색을 위해 항체 분자의 모식도를 참고하여 다양한 화학 작용기가 분포하고 있는 것을 확인하였고 많이 알려진 amine, carboxyl 이외에도 탄수화물 산화(carbohydrate oxidation)를 통한 알데히드기(aldehyde), 히드록시기(hydroxyl, -OH), 이미다졸(imidazole)과 같은 작용기가 있어 다양한 복합체 형성 전략 구사가 근본적으로 가능함을 확인하였다(도 6). 상술한 방법 중 항체의 힌지 부분(hinge region)에 주로 분포되어 있는 이황화 결합(disulfide bond)을 이용하여 부위-특이적 표지(site-specific labeling)를 시도하고자 하였다. 이를 위해 해당 부분에 대한 DTT와 같은 환원제(reducing agent)를 이용한 절단을 시도하였고 상기 결과를 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 기법으로 분석하였다.
그 결과, DTT에 의해 환원된 항체 분자는 두 개의 중쇄(heavy chain)와 두 개의 경쇄(light chain)로 분리된 것을 확인하였고 QD과 복합체 형성시 상기 영역의 티올과 결합을 유도함으로써 무작위 형태가 아닌 균일한 형태로 항체 복합체 형성을 구현하여 복합체 간의 응집(aggregation) 현상을 최소화 시켜줄 수 있어 안정적인 분석 시스템을 구축하였다(도 7).
실시예 6: DLS 분석을 통한 복합체의 특성화
본 발명자들은 나노입자의 크기 균일성을 분석하기 위하여 나노입자의 크기 를 분석하는 장비인 동적광산란(dynamic light scattering, DLS) 장비를 사용하여 종래 방식의 EDC 기반의 복합체와 본 발명의 항체-QD 복합체의 크기 분포를 분석하였다.
그 결과, QD의 경우 대부분 직경 10 nm 부위에 분포하고 있음을 확인하였고 106 ~ 170 nm에 분포하는 것은 QD 일부가 보관 시 클러스터(cluster)를 형성한 것으로 판단되어 실제 복합체 형성 시에는 초음파처리(sonication) 과정을 우선 수행 후 복합체 형성을 시행하는 것이 바람직하다고 판단하였다. 또한, EDC 기반의 복합법에서는 실제 DLS 결과에서도 상당히 다양한 크기 분포를 관찰하였고 1 μm를 상회하는 응집체도 관찰하였다. 이는 항체 분자의 크기를 대략적으로 15 nm ~ 20 nm로 가정할 때 상당히 많은 수의 항체-QD의 응집체가 랜덤하게 형성되었음을 알 수 있다. 아울러 본 발명의 말레이미드-DTT 기반의 복합법을 이용하여 제조된 항체-QD 복합체의 DLS 결과에서는 앞선 EDC 기반의 복합 결과와는 현저히 다른 크기 분포를 관찰하였는데 대부분이 25 nm ~ 83 nm에 분포가 되어있고 일부의 복합체가 100 ~ 200 nm에 형성됨을 확인하였다. 이는 QD 한 개에 항체분자 한 개 또는 두 개 정도가 결합한 이상적인 복합체 형태가 구현이 된 것이고, 일부는 소규모의 응집체 형태가 형성된 것으로 사료된다(도 8).
실시예 7: ELISA 분석을 통한 복합체의 특성화
본 발명자들은 본 발명에 의해 제조된 항체-QD 복합체에 항체 분자가 얼마나 결합되는지 확인하기 위하여 ELISA 기반의 항체 정량법을 수행하였다.
구체적으로, anti-CRP 단일 항체와 동일한 항체를 이용하여 검량선(calibration curve)을 작성하였고 이를 기반으로 기하학적인 모사를 통해 정량화를 구현하였다. 항체 정량을 위해 S자 곡선(sigmoidal curve)을 로짓 변환(logit transformation)을 적용하여 선형화 하였고 이를 통해 도출된 항체량과 사용된 QD과 항체의 기하학적인 모사를 이용하여 QD 한 개당 이론적인 항체 개수와 실제 정량화된 항체 량과의 비교를 예측하였고 실제 QD 한 개당 항체 한 분자가 결합되었다는 결론을 도출하였다. 상기와 같은 정량법은 오차를 수반할 수 있지만 항체 정량을 수행할 수 있는 대안 분석법이 없는 현실에서는 복합체의 품질관리(quality control)를 수행하는데 필수적인 분석 절차라 할 수 있다(도 9).
실시예 8: Maleimide-DTT 기반 복합체를 이용한 LF-ICA 분석
본 발명자들은 종래 EDC 기반의 중합법을 이용한 복합체 및 본 발명의 maleimide-DTT 기반의 복합체를 이용하여 LF-ICA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 테스트와 콘트롤을 위해 anti-CRP 항체와 anti-mouse IgG가 각각 고정화된 면역스트립을 maleimide-DTT 기반의 복합체와 CRP가 농도별 (0, 0.1, 1, 10 ng/mL)로 희석된 곳에 담그면 모세관 현상에 의해 항원-복합체가 면역스트립을 따라 이동하게 된다.
그 결과, 시료 흡수 속도가 기존 EDC 기반 복합체에 비해 상대적으로 신속하게 진행되는 것을 관찰하였다. 이는 상기 DLS 결과에서도 확인할 수 있었듯이 복합체의 크기가 비교적 균일하고 응집체와 같이 시료 흐름에 영향을 미칠 수 있는 요소가 없기 때문이라 사료된다. 또한 분석 민감도 측면에서는 LOD가 대략 1 ng/mL에서 형성되어 EDC 복합체를 이용한 분석 결과에 비해 약 10배의 신호가 증가한 것을 관찰하였다(도 10). 상기와 같은 결과는 복합체의 크기가 크고 결합된 항체 분자가 많은 EDC 기반의 복합체의 경우에 항원의 고갈(depletion) 현상이 유발될 수 있으나 본 발명의 복합체는 크기가 비교적 균일하게 구성되어 이와 같은 현상을 최소화할 수 있다.
실시예 9: Avidin-biotin 기법을 통한 신호증폭 구현
본 발명자들은 새로운 중합법 제시를 통해 분석민감도 향상 및 LF-ICA 분석 공정을 개선하였으나 육안 분석을 통해 나타난 LOD 결과는 골드 나노입자 기반의 정성 분석 결과와 큰 차이를 나타내지 않았다. 실제 QD 형광신호에 최적화된 리더기를 사용한다면 육안과는 다르게 더욱 민감한 신호 결과를 도출할 수 있지만 현 수준(UV lamp를 이용하여 육안으로 관찰)에서 구현할 수 있는 증폭법을 우선 고안하여 수행하였다.
먼저 아비딘-비오틴(Avidin-biotin)은 상호 친화도(affinity)가 1015 L/mol로써 항원-항체에 비해 십만배 이상의 결합력을 가지고 있어 신호 증폭에 많이 응용되고 있지만 LF-ICA와 같이 순차적 반응이 구현되기 어려운 분석 시스템에서는 적용하기가 용이하지는 않다. 신호 증폭의 기본 개념은 기본적으로 하나의 항원에 대해 신호 발생체의 절대량을 늘리는 것으로, 여기서는 QD의 양을 증대시키기 위하여 이중(dual) QD 복합체를 제조하였다. 이를 위해서는 항체-QD에 비오틴(biotin) 작용기를 부여하고, 다른 QD에는 SA 분자를 중합시켰다. 항체-QD에는 항체 이외에도 카제인(casein) 단백질이 존재하므로 아민-반응성 NHS 작용기가 포함된 비오틴을 결합시켜서 제조하였다. SA-QD의 경우에는 항체-QD 중합과 유사하지만 SA에는 표면에 노출된 이황화결합(disulfide bond)이 없으므로 티올(thiol)기를 부여하기 위하여 SPDP 가교제를 사용하고 DTT 반응을 통해 티올기를 형성하였다(도 11).
그 후, 비오틴화(biotinylation) 여부를 확인하기 위하여 항-마우스 IgG를 고정 항체로 SA-HRP를 탐지 및 신호 발생체로 하여 ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과, 복합체의 신호가 희석비에 따라 비례하여 증가함을 알 수 있는데 이는 비오틴이 항체-QD 복합체에 잘 결합이 되어 있다는 것을 의미한다(도 12). 또한 SA-QD 복합체의 경우에도 SA의 중합여부 확인을 위해 비오틴화-우태아 혈청(BSA)을 고정, biotin-HRP를 탐지 및 신호 발생체로 하여 ELISA 분석을 수행한 결과 SA의 중합이 되었음을 확인하였다(도 13).
아울러, 상기 이중 복합체를 이용하여 LF-ICA에서 성능을 평가하였다. 구체적으로 타겟 항원 농도는 0.1 ng/mL로 기존 보다 10배 더 희석하였고, 복합체 적용 방식에 따라 I ~ IV로 구분하였다. I의 경우는 대조군(control)으로 SA-QD 복합체 없이 항체-QD로만 반응을 수행하였다. Ⅱ와 Ⅲ의 경우는 SA-QD 복합체를 동일하게 적용하였으나 Ⅱ의 경우는 샘플과 혼합하여 한 번에 구현을 하였고 Ⅲ의 경우에는 순차적으로 반응을 시켰으며 IV의 경우에는 복합체 공급 방식이 수직이 아닌 수평 방향에서 이루어졌다. 그 결과 이중 복합체를 이용한 신호 증폭법이 효과가 있음을 확인하였고 기존의 방법으로는 0.1 ng/mL 구현이 어려웠으나 상기 증폭법 도입을 통해 0.1 ng/mL 의 LOD 달성을 가능함을 확인하였다. 특히 Ⅱ와 Ⅳ 조건에서 그 효과가 더 강하게 나타났다(도 14).
결론적으로 본 발명의 카르복실화 양자점-항체 복합체는 재현성이 낮은 랜덤 항체-양자점 중합법을 개선하여 카르복실화 양자점과 복합체 제조 시 무작위로 고정화되는 항체분자의 배향성을 향상시켜 높은 균일성과 낮은 비특이 흡착의 특성을 지닌 복합체 제작을 통해 형광측정 시 민감도가 향상되어 형광 면역분석 전 분야에 적용 가능하고 향후 증폭 기법의 최적화 및 추가 기법 도입을 통해 더 낮은 분석 민감도를 구현할 수 있을 것으로 사료되며 리더기 등 분석 장비와의 결합 시 추가적인 분석 민감도 향상 및 정량적인 분석까지 구현할 수 있을 것이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (7)
- 항체가 양자점과 연결된 항체-양자점 복합체에 있어서, 상기 항체 분자는 두 중쇄의 힌지(hinge) 부분의 이황화결합(disulfide bonds)이 환원제에 의해 티올기(thiol functional groups)로 변환된 후, 표면에 LC-SMCC{succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amido-caproate)} 링커가 결합된 카르복실화(carboxylated) 양자점(quantum dot)과 상기 링커를 통해 결합되며, 이 때 상기 항체 분자의 3차원 구조가 유지되고 항체 배향성이 향상된 항체-양자점 복합체.
- 제1항에 있어서,
상기 카르복실화 양자점은 비오틴이 추가적으로 표지된 것인, 항체-양자점 복합체. - 제2항에 있어서,
스트렙타비딘이 코팅된 양자점 첨가시 자가 조립(self association)에 의해 신호가 증폭되는, 항체-양자점 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 환원제는 디티오트레이톨(dithiothreitol)인, 항체-양자점 복합체. - 제1항의 항체-양자점 복합체가 인쇄 또는 코팅된 기재를 포함하는 면역 형광탐지키트.
- 항체 분자의 두 중쇄의 힌지 부분(hinge region)을 환원제로 환원시키는 환원단계;
환원된 항체 분자와 카르복실화 양자점(quantum dot)을 LC-SMCC 링커를 이용하여 연결하는 양자점 연결단계;
결합되지 않은 양자점 및 항체 분자를 제거하는 미반응 물질 제거단계를 포함하는, 제1항의 항체 분자의 3차원 구조가 유지되고 배향성이 향상된 항체-양자점 복합체의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 환원제는 디티오트레이톨(dithiothreitol)인, 제조방법.
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|---|
| Qdot Biotin Conjugates User Manual. Invitrogen(2006).* * |
| Sensors. 2009, 9:9332-9354.* * |
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