CN107340398A - 基于上转发光法的抗缪勒氏管激素定量测定试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂及其方法,采用上转发光法的UCP颗粒作为生物标记物,特异性的标记有抗AMH抗体,应用本发明可快速、简便、定量而且准确的测定样品中AMH的含量,为女性卵巢储备功能的评价提供检测依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂及试剂盒的制备方法,属生物技术和医疗器械的产品技术领域,主要用于对女性卵巢储备功能进行评价。
背景技术
抗缪勒氏管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH)1947年首先发现,是转化生长因子β超家族的成员之一,由两个相同的70KD亚基通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白,相对分子为140KD;人类AMH编码基因位于19号染色体短臂,大小2.4-2.8kb,含有5个外显子。
AMH是评价卵巢储备功能的良好指标,且不受月经周期影响,随时可检测,血液中AMH含量可为多囊卵巢综合症(PCOS)的诊断提供新的参考指标;对卵巢早衰,卵巢颗粒细胞瘤,儿童性别发育异常的诊断有重要的意义;血液中AMH含量在辅助生殖技术(ART)前能准确地预测卵巢反应,并制定个体化刺激方案,一定程度提高妊娠率,降低并发症风险;可预测绝经年龄;此外,AMH在性腺器官发育过程中起着重要作用,是男女性腺功能的重要标记物之一。在欧美国家,血液AMH浓度水平已成为评估女性的卵巢功能的主要常规指标,常用的检测方法为酶联免疫法和电化学发光法;国内主要AMH检测主要是引入进口的电化学法发光法、酶联免疫法和胶体金法;电化学法发光法主要是Roche的AMH电化学发光法检测系统,酶联免疫法和胶体金法主要如专利“人抗苗勒激素的酶联免疫检测试剂,CN 104865391B”和“人抗苗勒氏管激素胶体金免疫层析检测试剂盒及方法,CN 105527447 A”分别公开的内容,但电化学发光法为非开放系统,价格昂贵,且需要专门培训仪器使用人员,维修及检测成本均高,不适于大范围推广使用;酶联免疫法耗时长、灵敏度低、背景值高、易造成假阳性和假阴性结果;胶体金法检测速度快,适合POCT快速检测,但灵敏度低、背景值高、易造成假阳性和假阴性结果,定量检测依靠色度或灰度比对,多为半定量检测,对检测结果不能准确定量。
经我们前期研究证实,稀土纳米上转发光颗粒(UCP颗粒)的新型标记物具有独特光学特性:高灵敏度,零背景干扰,高稳定性,高安全性等特点,使UCP颗粒作为生物标记物有着极为广泛的应用前景,在POCT快速领域具有独特的优势和很高的应用价值。
因此,研制一种基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂及试剂盒,并应用于AMH的临床POCT快速检测领域,具有重要临床应用价值。
发明内容
本发明提供一种基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂及其试剂盒的制备和应用方法,该试剂盒具有准确定量、零背景干扰,检测结果稳定,检测快速的特点。
具体地,本发明提供一种基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂,其特征在于AMH定量检测试剂包括:样品垫、试剂垫、疏水性保护膜、分析膜、吸水垫、粘性低衬、数据存储装置和固定卡壳,其中疏水性保护膜能使加入的样品全部有效的通过试剂垫,并与试剂垫中的抗AMH抗体标记的UCP颗粒充分反应,提高灵敏度,数据存储装置存储有检测试剂的基本信息和定量检测的数据参数模型,可通过适配的上转发光免疫分析仪直接读取试剂信息和定量检测的数据参数模型,代替使用外部标准品检测,并绘制标准曲线,进行精确定量,并能有效降低不同批次试剂信息的录入错误率。
在一个优选的实施方案中,试剂垫中含有抗AMH抗体标记的UCP颗粒,分析膜中含有抗AMH抗体包被的检测线T线和羊抗鼠IgG包被的质控线C线;标记用的抗AMH抗体和包被用的抗AMH抗体具有不同的抗原表位,可特异性的血液样本中的抗缪勒氏管激素形成夹心复合物。
在一个更优选的实施方案中,所述免疫层析试纸条的分析膜为硝酸纤维素膜,分析膜上的检测线T线位于样品垫的一端,质控线C线位于吸水垫的一端。
在一个优选的实施方案中,样品垫、试剂垫、疏水性保护膜、分析膜、吸水垫、粘性低衬共同组成AMH定量检测试剂条,其中样品垫、试剂垫、分析膜和吸水垫均在粘性低衬依次排列,其中样品垫和试剂垫部分重叠,试剂垫和分析膜部分重叠,分析膜和吸水垫部分重叠,疏水性保护膜位于试剂垫的上方,前段与样品垫部分重叠,尾端与分析膜前端部分重叠,疏水性保护膜能使加入的样品全部有效的通过试剂垫,并与试剂垫中的抗AMH抗体标记的UCP颗粒充分反应,提高灵敏度。
在一个优选的实施方案中,数据存储装置是数据芯片,或数据条形码,或具有相同功能的其他数据存储装置,其中所述数据芯片位于所述固定卡壳的内部,所述数据条形码位于所述固定卡壳的外部。
在一个优选的实施方案中,AMH定量检测试剂条、数据存储装置和固定卡壳共同组成AMH定量检测试剂,其中固定卡壳上包括加样孔、结果判读窗口和终点指示窗口,加样孔对应于AMH定量检测试剂条上的样品垫,结果判读窗口对应于分析膜上的检测带和质控带,终点指示窗口对应于吸水垫上的终点指示带。
本发明还提供一种基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂盒,主要包括上述AMH定量检测试剂。
本发明克服了以往抗缪勒氏管激素检测试剂的非开放系统,价格昂贵,不能精确定量等缺点,提供一种基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂盒,可对AMH进行快速、准确、定量的检测并能应用于临床POCT快速检测的普及。
附图说明
图1为本发明某一实施方案(方案1)的基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂条的剖面结构示意图。
图2为本发明某一实施方案(方案1)的基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂的剖面结构示意图。
图3为本发明某一实施方案(方案2)的基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂的剖面结构示意图。
图4为AMH线性检测结果分析图。
图5为本发明AMH-UPT试剂盒和罗氏AMH电化学发光试剂的性能对比结果。
附图标记说明
1为样品垫、2为试剂垫、3为抗AMH抗体-UCP结合物、4为疏水性保护膜、5分析膜、6为粘性低衬、7为检测带T线、8为质控带C线、9为吸水垫、10为数据存储装置、11和12为固定卡壳、13为加样孔、14为结果判读窗口、15为终点指示窗口、16参数条形码。
具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是,本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的具体改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1:AMH上转发光试剂盒生产的工艺如下:
(1)包被:将AMH单抗(来自厦门大学)稀释到1.5mg/ml,作为T线包被液,将羊抗鼠IgG(购买自北京索莱宝生物科技有限公司)稀释到2mg/ml,作为C线包被液;通过喷膜机,将T线包被液和C线包被液包被到硝酸纤维素膜上;晾干,获得单克隆抗体包被膜条,即分析膜。
(2)UCP标记单抗:本试剂盒中的UCP标记单克隆抗体主要是用以下步骤获得,详情如下:
a)称取10mg UCP颗粒置于锥形瓶中;
b)加入10ml pH=7.2的0.20M PB溶液;
c)UCP颗粒悬浊液中加入0.5mg抗AMH抗体,再加入无水戊二醛至终浓度0.1%,搅拌过夜;
d)12000rpm,4℃,离心15min,弃上清;
e)UCP沉淀物中加入10ml pH=7.2 0.20M PB,吹打混匀;
f)12000rpm,4℃,离心15min,弃上清;
g)UCP标记沉淀物收集待用;
(3)冻干试剂垫的制备:
a)将50mg UCP颗粒制备的UCP标记沉淀物重悬,混匀,12000rpm,4℃,离心30min,弃上清;
b)加入45ml的冻干液(pH=7.2 0.20M PB,含2%BSA,3%蔗糖);
d)将UCP标记物悬浊液按5cm2/ml加于玻璃纤维上;
e)真空冻干11h,即得冻干的试剂垫;
(4)裁剪试剂垫:将冻干的试剂垫裁剪成1cm宽的长条。
(5)组装试纸条;依次将分析膜、吸水垫、试剂垫和样品垫贴到粘性低衬上,并将疏水性保护膜贴在样品垫、分析膜和试剂垫的上方,黏贴方式为样品垫、试剂垫、分析膜和吸水垫均在粘性低衬依次排列,其中样品垫和试剂垫部分重叠,试剂垫和分析膜部分重叠,分析膜和吸水垫部分重叠,疏水性保护膜位于试剂垫的上方,前段与样品垫部分重叠,尾端与分析膜前端部分重叠,然后切成4.0mm宽的纸条,即为AMH定量检测试剂条。
(6)装塑料卡;将4.0mm宽的试纸条装到塑料卡底壳中,并在尾端装入已经录入试剂参数的数据芯片,盖上塑料卡上壳,压紧,即为AMH定量检测试剂,将AMH定量检测试剂装入铝箔袋,并加入干燥剂密封保存。
(7)样品稀释液配制;样品稀释液成分为pH=7.2的0.20M PB,1%Tween20。
实施例2:AMH上转发光定量检测试剂盒的组成成份:
1、AMH-UPT快速检测试纸条(40人份)
2、样品稀释液(1瓶,45ml)
3、样品管(40个)
4、使用说明书(1份)
实施例3:AMH-UPT免疫层析试纸条的原理
该试纸条的原理:AMH-UPT快速检测试纸条采用双抗体夹心免疫层析方法定量检测样品中AMH。分析膜上测试区(T)预包被抗AMH单抗,质控区(C)预包被羊抗鼠IgG,试剂垫上有UCP颗粒标记的另一株抗AMH单抗。反应时样品中AMH与两株抗体反应结合,在T区形成抗AMH抗体-AMH抗原-UCP标记的抗AMH抗体复合物,UCP颗粒在红外光激发下发射可见光,发射光的强度与样品中AMH的浓度成正比。无论样品中是否存在AMH,在C区都会形成羊抗鼠-UCP标记的抗AMH抗体复合物。
实施例4:本发明的AMH-UPT试剂盒的检测步骤
采用本发明提供的检测AMH-UPT的上转发光法检测试剂盒进行AMH含量检测的步骤为:
a.在测试前先完整阅读使用说明书,
b.将待测样品从储存环境中取出,编号并且平衡至室温(20℃-30℃)。
c.取100μl血清放入试管中,滴入稀释液150μl,混匀。
d.将试纸条置于干净平整的平面上,取100μl稀释后的样品加至UPT免疫层析试纸的加样孔,同时开始计时。
d.放置15min后,利用适配的上转发光免疫分析仪对AMH定量检测试剂进行检测分析。
e.上转发光免疫分析仪显示测量结果,Y值为AMH的浓度,系统默认单位为ng/ml。
实施例5:检测指标:
1)检测灵敏度:
取AMH阴性的血清样品20份,用AMH-UPT定量检测试剂检测并计算平均值和标准差,以平均值+2倍标准差对应的浓度为AMH定量检测试剂的检测灵敏度,详情如表1所述。
检测结果表明:AMH定量检测试剂的检测灵敏度为0.283ng/ml。
表1灵敏度检测数据
2)精密度:
随机抽取20人份试纸条,用同一份1.0ng/ml AMH低值阳性样品按说明书操作步骤进行重复测定,计录每次测定结果,并计算分析,如表2所述。
检测结果表明:AMH的平均值、标准偏差(SD)和变异系数CV分别为:1.015ng/ml、0.094ng/ml和9.29%,满足变异系数(CV)不高于15%的要求,精密度良好。
表2精密性检测数据
3)线性区间:
根据取浓度为50ng/ml的AMH纯品,依次稀释成浓度分别为25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml的稀释样品,稀释样品的测定结果详见表3和图4。
检测结果表明:由于0.25ng/ml的样品浓度低于试剂检测灵敏度0.283mg/ml,50ng/ml的样品浓度检测结果仅为36.237ng/ml,绝对偏差较大,均分析剔除,因此本试剂盒的检测线性区间为0.5-25ng/ml,线性范围灵敏度为0.5ng/ml,R2=0.9894。
表3 AMH定量检测试剂线性区间检测结果(单位:ng/ml)
标准浓度 | 50 | 25 | 10 | 5 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.25 |
检测浓度 | 36.237 | 23.273 | 11.477 | 4.327 | 2.871 | 0.904 | 0.467 | 0.152 |
4)准确性:
以本发明AMH-UPT试剂盒和罗氏AMH电化学发光试剂的性能对比,随机抽取AMH临床样本20例,分别采用本发明AMH-UPT试剂盒和罗氏AMH电化学发光法进行检测,并统计分析,结果详见表4和图5。
检测结果表明:两种方法符合率较好,准确性高,线性相关性R2=0.9801。
表4两种AMH检测结果的比较(单位:ng/ml)
编号 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | 7# | 8# | 9# | 10# |
罗氏 | 11.33 | 2.095 | 4.265 | 13.035 | 7.738 | 0.7 | 5.465 | 4.215 | 0.35 | 8.766 |
热景 | 10.1 | 1.535 | 3.788 | 12.79 | 6.388 | 0.948 | 5.995 | 4.978 | 0.29 | 7.883 |
编号 | 11# | 12# | 13# | 14# | 15# | 16# | 17# | 18# | 19# | 20# |
罗氏 | 0.925 | 3.23 | 6.955 | 1.583 | 6.258 | 0.94 | 2.708 | 6.318 | 5.688 | 13.65 |
热景 | 0.74 | 3.443 | 6.18 | 0.94 | 5.218 | 0.645 | 3.235 | 5.83 | 5.885 | 12.855 |
Claims (7)
1.一种基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂,其特征在于所述定量检测试剂包括:样品垫、试剂垫、疏水性保护膜、分析膜、吸水垫、粘性低衬、数据存储装置和固定卡壳,其中所述疏水性保护膜能使加入的样品通过所述试剂垫,并与所述试剂垫中的抗AMH抗体标记的UCP颗粒充分反应,所述数据存储装置存储有检测试剂的基本信息和定量检测的数据参数模型,可通过适配的上转发光免疫分析仪直接读取试剂信息和定量检测的数据参数模型,代替使用外部标准品检测和绘制标准曲线,进行精确定量分析。
2.根据权利要求1所述的定量检测试剂,其中所述试剂垫中含有抗AMH抗体标记的UCP颗粒,分析膜中含有抗AMH抗体包被的检测线T线和羊抗鼠IgG包被的质控线C线;标记用的抗AMH抗体和包被用的抗AMH抗体具有不同的抗原表位,可特异性地与样本中的抗缪勒氏管激素形成夹心复合物。
3.根据权利要求2所述的定量检测试剂,其中所述免疫层析试纸条的分析膜为硝酸纤维素膜,分析膜上的检测线T线位于样品垫的一端,质控线C线位于吸水垫的一端。
4.根据权利要求1所述的定量检测试剂,其中所述样品垫、所述试剂垫、所述疏水性保护膜、所述分析膜、所述吸水垫、所述粘性低衬共同组成AMH定量检测试剂条,其中所述样品垫、所述试剂垫、所述分析膜和所述吸水垫在所述粘性低衬依次排列,其中所述样品垫和所述试剂垫部分重叠,所述试剂垫和所述分析膜部分重叠,所述分析膜和所述吸水垫部分重叠,所述疏水性保护膜位于所述试剂垫的上方,前段与所述样品垫部分重叠,尾端与所述分析膜前端部分重叠。
5.根据权利要求1所述的定量检测试剂,其中所述数据存储装置是数据芯片或数据条形码,其中所述数据芯片位于所述固定卡壳的内部,所述数据条形码位于所述固定卡壳的外部。
6.根据权利要求1所述的定量检测试剂,其中所述固定卡壳上包括加样孔、结果判读窗口和终点指示窗口,其中所述加样孔对应于AMH定量检测试剂条上的样品垫,所述结果判读窗口对应于所述分析膜上的检测带和质控带,所述终点指示窗口对应于所述吸水垫上的终点指示带。
7.根据权利要求1所述的定量检测试剂,其中所述定量检测试剂的线性范围为0.5-25ng/ml,检测灵敏度为0.283ng/ml。
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