CN117092344A - 一种检测金黄色葡萄球菌蛋白a的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及医学检验领域，具体公开了一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒及其应用。试剂盒包括包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板；金黄色葡萄球菌蛋白A标准品；生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段；酶标记的抗生物素蛋白；样品稀释液；显色液；洗涤液；终止液。本申请的试剂盒可用于抗体中的金黄色葡萄球菌蛋白A残留的检测以及金黄色葡萄球菌感染的检测，具有提高金黄色葡萄球菌蛋白A的检测准确性的优点。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及医学检验领域，更具体地说，它涉及一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒及其应用。
背景技术
近年来，随着基因工程技术的发展以及细胞大规模培养技术的发展。尤其抗体药物的工业化生产已经取得了长足的进步。诞生了多个重磅炸弹级的基于抗体的抗肿瘤药物及其他领域药物。在抗体药物的生产工艺中，通常包括大规模的细胞培养，抗体在细胞中的高效表达，细胞破碎以及抗体的纯化等工序。其中抗体的纯化是关键的工序，在抗体的纯化过程中，需要将裂解的细胞碎片、细胞内容物中的杂质蛋白等成分去除。在依赖于细胞培养上清的分泌型抗体生产工艺中，同样需要去除细胞碎片、培养基组分中的杂质。因此，在抗体药物的生产中，往往需要多个层析纯化的步骤。在这其中，亲和层析以其操作简便，特异性强，回收率高等优点，在药物生产尤其是抗体药物的生产中起到关键作用。
金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal Protein A)是源于金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质。1940年最先由Vevwey等发现，直到1963年Lofkvis等分离了这一蛋白，随后Grov将其命名为SPA。SPA存在于多数金黄色葡萄球菌中。
SPA可与人类和多种哺乳动物IgG的Fc段结合。这一特性被广泛用于人类和动物抗体的纯化。在目前的抗体制药工艺中，常利用SPA作为亲和层析的配基，特异性的通过亲和层析的方式纯化培养液中的抗体。通常的使用方式是，将SPA通过化学键偶联在层析载体上，这种载体可以是琼脂糖凝胶，表面修饰的聚苯乙烯树脂，以及其他的层析载体。制备而成的载体简称为SPA亲和层析载体。
基于SPA的亲和层析是抗体纯化中非常重要的技术。由于其操作步骤少，抗体得率高，所获得的的抗体纯度高，所以无论是在实验室研究中，还是在制药工业中都有广泛的使用。
在利用SPA亲和层析工艺的抗体纯化过程中，作为亲和层析配基的SPA会由于各种原因，产生脱落现象，从层析柱上脱落的SPA会进入到纯化后的抗体而影响抗体的纯度。在抗体制药工业中，SPA的脱落会影响抗体药物的质量，如果进入到人体可能会引发免疫反应等一系列症状。
因此，确定在纯化的抗体中是否有SPA的残留非常重要。SPA残留检测也成为抗体药物质量控制的重要环节。
相关技术中，利用人IgG分子的Fc段能与待检物中SPA相结合的原理，以人IgG作为捕获分子，在抗体药物的检测中，由于待检物本身便可能存在大量的IgG抗体，通常是人源化的IgG抗体，因此待检物中的SPA会首先与待检物中的IgG抗体分子的Fc部分相结合，从而无法与ELISA板上作为捕获分子的人IgG相结合，最终呈现假阴性，导致金黄色葡萄球菌蛋白A的检测准确性降低。
发明内容
为了提高金黄色葡萄球菌蛋白A的检测准确性，本申请提供一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒及其应用。
第一方面，本申请提供一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，采用如下的技术方案：
一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，包括：
包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板；
金黄色葡萄球菌蛋白A标准品；
生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段；
酶标记的抗生物素蛋白；
样品稀释液；
显色液；
洗涤液；
终止液。
通过采用上述技术方案，制备了鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体作为捕获抗体，大幅度降低了待检物金黄色葡萄球菌蛋白A与抗体的非特异性结合，检测的特异性大大提高，有效的避免了检测的非特异性；同时，利用鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段特异性的结合金黄色葡萄球菌蛋白A进行检测，切除了能够与金黄色葡萄球菌蛋白A产生结合的抗体恒定区Fc片段，增加了检测的灵敏度，因此，获得了提高金黄色葡萄球菌蛋白A的检测准确性的效果。
可选的，鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体为鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY多克隆抗体，且在pH为3-7的环境中能够保持活性。
通过采用上述技术方案，利用了耐酸的鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体作为捕获抗体，使试剂盒检测样本的范围扩大，减少了检测前的样本酸碱度调节的工作，能够满足制药工业中样本的直接检测。并且，由于样本的酸碱度调节，会因为在样本中加入酸或者碱调节pH值而改变原样本中待检物的浓度，本方案则可利用原样本直接检测，更进一步增加了检测的准确性。
可选的，包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板制备方法如下：
S1、制备鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体；
S2、微孔板包被：
在微孔板中，每孔加入200ul用碳酸缓冲液稀释的鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体，进行孵育；
碳酸缓冲液的浓度为10mM-100mM，缓冲对为Na2CO3和NaHCO3，pH为9-10；
鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的浓度为1-10μg/ml；
孵育条件为4℃过夜；
S3、微孔板洗涤、封闭、干燥。
可选的，金黄色葡萄球菌蛋白A标准品的配制方法为：将金黄色葡萄球菌蛋白A溶解在标准品缓冲液中，配制成金黄色葡萄球菌蛋白A标准品，金黄色葡萄球菌蛋白A的浓度为10ng/ml-500ng/ml，标准品缓冲液为浓度20mM-50mM、pH6.5-pH8.5的磷酸缓冲液。
可选的，生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段的制备方法如下：
S1、由金黄色葡萄球菌蛋白A免疫小鼠后筛选得到鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体；
S2、对鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体采用木瓜蛋白酶酶切法制备F(ab)2片段，然后采用亲和层析法纯化，亲和层析介质采用链球菌蛋白G，制得纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段；
S3、采用N-羟基琥珀酰亚胺对S2制得的纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段进行标记，制得生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段。
通过采用上述技术方案，在检测中引入了生物素-亲和素的信号放大系统，使检测灵敏度大幅提高。
可选的，酶为辣根过氧化物酶。
可选的，抗生物素蛋白包括链霉亲和素SA。
可选的，样品稀释液包括缓冲系统、保护性组分、表面活性剂、指示剂和防腐剂。
缓冲系统为磷酸缓冲液，摩尔浓度为10mM-200mM，pH为7-9；
保护性组分包括保护性蛋白和保护性核苷酸；保护性蛋白为血清白蛋白，终浓度为0.1％-2％(质量/体积)；保护性核苷酸为腺苷二磷酸，终浓度为0.05％-2％(质量/体积)；
表面活性剂为非离子型表面活性剂Tween-20，终浓度为0.05％-0.5％(体积/体积)；
指示剂为溴酚红，终浓度为0.0001％-0.001％(体积/体积)；
防腐剂为Proclin300，终浓度为0.01％-0.1％(体积/体积)。
可选的，显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液。
可选的，终止液为2mol/L的硫酸。
第二方面，本申请提供一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒的应用，采用如下的技术方案：
一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒的应用，该试剂盒可用于抗体中的金黄色葡萄球菌蛋白A残留的检测。
抗体包括但不限于人IgG抗体、鼠IgG抗体、羊IgG抗体、兔IgG抗体、猪IgG抗体等。
一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒的应用，该试剂盒可用于金黄色葡萄球菌感染的检测。
可选样本包括但不限于牛奶、饮料、水、即食食品等被金黄色葡萄球菌感染的样本。
通过使用了上述检测盒，不但能检测简单样本中的金黄色葡萄球菌蛋白A，而且能够在高浓度抗体背景中，检测到微量的金黄色葡萄球菌蛋白A残留。能够有效应用于抗体制药中的质量检测和控制环节。
可选的，检测方法如下：
S1、标准品准备：采用样品稀释液，将金黄色葡萄球菌蛋白A标准品配制成如下浓度：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml、7.8125pg/ml、3.90625pg/ml、1.953125pg/ml和0pg/ml；
S2、待检样品准备；
S3、检测过程：在包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板中，加入S1步骤制得的标准品，每孔加入100μl，每个浓度的标准品加入3个重复；
在其余空白板孔中加入待检样品，每孔100ul，每个待检样品加入3个重复，在37℃条件下孵育2小时，用洗涤液洗涤板孔3次，在吸水纸上拍干；
在上述板孔中加入生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段，每孔100ul，37℃条件下孵育1小时，用洗涤液洗涤板孔3次，拍干；
在板孔中加入酶标记的抗生物素蛋白，每孔100ul，37℃条件下孵育1小时；
在板孔中加入显色液，每孔100ul，37℃条件下避光孵育15分钟；
在板孔中加入终止液终止反应，每孔100ul；
在450nm波长下读取微孔板中各孔的吸光度值，并进行分析。
通过采用上述技术方案，试剂盒与该检测方法结合，能够有效地进行金黄色葡萄球菌蛋白A残留的检测。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请采用鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY抗体作为捕获抗体，鸡IgY抗体的Fc端与金黄色葡萄球菌蛋白A不存在结合现象，不受金黄色葡萄球菌蛋白A与常规的鼠源、兔源或者人源IgG非特异结合的影响。获得了大幅度增加检测特异性的效果。
2、本申请中优选采用生物素-抗生物素系统，由于生物素-抗生物素系统具有信号放大的功能，获得了增加灵敏度的效果。
3、本申请的方法，通过采用鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体的F(ab)2片段作为检测抗体。由于切除掉了鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体的恒定区Fc区，避免了该恒定区与待检样本中的金黄色葡萄球菌蛋白A非特异性结合，因此获得了进一步提高检测特异性的效果。
附图说明
图1是本申请提供的试剂盒的检测原理示意图。
附图标记说明：
①鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY抗体；
②金黄色葡萄球菌蛋白A；
③背景抗体(人IgG、鼠IgG或者其他的IgG抗体)；
④生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体F(ab)2片段；
⑤辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素SA。
具体实施方式
以下结合附图1和实施例对本申请作进一步详细说明。
予以特殊说明的是：以下实施例中未注明具体条件者按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
微孔板材质包括但不限于聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等材质，其中优选聚苯乙烯材质；微孔板包括但不限于96孔板，48孔板，384孔板等型号，其中优选96孔板。
金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)标准品包括但不限于天然的Protein A蛋白、重组表达的Protein A蛋白、经过基因修饰和改造Protein A蛋白等。
抗生物素蛋白包含但不限于亲和素、链霉亲和素等。其中优选链霉亲和素SA。
酶包含但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。其中优选辣根过氧化物酶。
显色液包括但不限于3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，邻苯二胺二盐酸盐(OPD)，其中优选3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。
原料的制备例
制备例1
包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板，制备方法如下：
S1、制备鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体：本制备例中鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体为鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY多克隆抗体，具有耐酸性，在pH为3-7的环境中能够保持活性。
(1)蛋鸡免疫
采用Sigma公司货号为P3838的天然金黄色葡萄球菌蛋白A作为免疫抗原，用弗氏完全佐剂(购自Sigma货号F5881)乳化后，免疫30日龄蛋鸡，采用胸肌多点注射免疫法，免疫抗原含量为0.5mg/kg(蛋鸡的体重)/次。
2周后，用同样的免疫抗原，用弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司，货号F5506)乳化后，按照同样的免疫程序再次加强免疫。
4周后，按照与加强免疫同样的方法进行再次加强免疫。
采取免疫鸡血清，用琼脂免疫扩散试验检测抗体效价，达到1:64后开始收集免疫蛋鸡所产的鸡蛋。
(2)鸡IgY抗体分离
提取(1)所收集鸡蛋中的卵黄放置在灭菌烧杯中，加入生理盐水稀释并充分混匀，卵黄：生理盐水的体积比为1:9，pH调至5.2，得到卵黄混合液，反复冻融3次，在8000r/min的条件下离心30分钟，得第一次上清液。
在第一次上清液中加入0.07％(质量/体积)的海藻酸钠和0.025％(质量/体积)的NaCl，在8000r/min的条件下离心30分钟，得第二次上清液，pH调至7.4，加入终浓度30％(质量/体积)的硫酸铵，在8000r/min的条件下离心30分钟，收集沉淀中的鸡IgY抗体。
(3)耐酸性鸡IgY抗体的纯化
用金黄色葡萄球菌蛋白A亲和填料装填亲和柱，制备成SPA亲和柱(市售SPA亲和填料均可，本制备例使用密理博公司ProSep Ultra Plus蛋白A亲和填料)。将SPA亲和柱用pH为7.4的10mM的磷酸缓冲液平衡，以0.5ml/min的速度，加入10个柱体积。
将步骤(2)所得到的鸡IgY抗体加入SPA亲和柱中，将SPA亲和柱用pH为7.4的10mM的磷酸缓冲液，以0.5ml/min的速度，洗涤10个柱体积，重复3次。
用100mM的柠檬酸/磷酸缓冲液洗脱亲和柱，分别在pH5，pH3.5和pH1.5的条件下各洗脱1个柱体积，收集洗脱液。将洗脱产物用100体积的pH7.4、10mM的磷酸缓冲液在4℃下透析过夜，其中pH1.5的洗脱组分就是耐酸性的特异性鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY多克隆抗体。
S2、微孔板包被：
将S1中纯化的耐酸性鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY多克隆抗体，溶解在浓度为60mM、pH9.8的碳酸缓冲液中，终浓度为10μg/ml。
本制备例采用的微孔板为聚苯乙烯材质的96孔板，在微孔板中，加入上述鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY多克隆抗体溶液，每孔200μl，然后在4℃下过夜孵育。
S3、微孔板洗涤、封闭、干燥：
将孵育完成后的微孔板用pH7.8，含0.1％Tween20的50mM的磷酸缓冲液清洗3次，拍干。
用含0.1％明胶、含0.1％Tween20的，pH7.8、50mM的磷酸缓冲液封闭。每孔300μl，37℃下封闭3小时。
将封闭完成后的微孔板用pH7.8，含0.1％Tween20的50mM的磷酸缓冲液清洗3次，拍干。
将上述微孔板在45℃下干燥10小时。
制备例2
金黄色葡萄球菌蛋白A标准品，制备方法如下：
将市售金黄色葡萄球菌蛋白A溶解在pH7.8的50mM的磷酸缓冲液中，终浓度在100ng/ml。本制备例选择Sigma公司货号为P3838的天然金黄色葡萄球菌蛋白A进行标准品的制备。
制备例3
生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段，鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体为鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A的单克隆抗体，鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段包括抗体分子轻链和抗体分子重链的可变区。
生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段的制备方法如下：
S1、制备鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体：
(1)小鼠免疫
采用Sigma公司货号为P3838的天然金黄色葡萄球菌蛋白A作为免疫原，与弗氏完全佐剂充分乳化，皮下多点注射法免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，每只100μg。同时免疫5只小鼠。
3周后，用同样剂量同规格的金黄色葡萄球菌蛋白A与弗氏不完全佐剂乳化，进行加强免疫。免疫过程与首次免疫相同。
9周后，按照与上述同样的方法进行再次加强免疫。
16周后，按照与上述同样的方法进行再次加强免疫。
最后一次免疫2周后，采小鼠尾血，用琼脂扩散法检测抗体效价，抗体效价达到1:72可判定合格。
(2)细胞融合
根据上述小鼠尾血检测结果，选择效价最高(1:128)的小鼠，用300μg的剂量同样的免疫方法再次免疫。
免疫3天后，小鼠取脾脏细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行细胞融合。
(3)杂交瘤细胞筛选
采用有限稀释法及HT选择性培养基进行杂交瘤细胞筛选。
将上述筛选后的杂交瘤细胞，通过有限稀释法进行克隆化培养。
将杂交瘤细胞分泌的抗体进行检测，根据抗体亲和力和特异性，选择与金黄色葡萄球菌蛋白A有特异性结合的亲和力最高的细胞株作为合适的杂交瘤细胞株。亲和力计算方法按照常规的竞争性ELISA方法。
在鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体的检测以及杂交瘤细胞筛选中，为了避免SPA与抗体的非特异结合引起的假阳性或假阴性，所有备筛选的单克隆抗体在筛选过程中，都加入了链球菌蛋白G封闭待筛选单克隆抗体的Fc端，加入的量为10ng/孔，其中链球菌蛋白G溶解在pH7.5、0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液中。
(4)腹水制备
对Balb/c小鼠用弗氏佐剂注射腹腔，每只注射0.5ml，处理腹腔。
将上述(3)筛选得到的杂交瘤细胞培养后，注入到上述处理后的小鼠腹腔，注射量为0.5ml/只。
15天后，断颈处死小鼠，抽取小鼠腹水。
(5)鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体纯化
上述(4)步骤制备的腹水中含有大量的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体。
利用市售离子交换树脂进行鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体纯化，本制备例终使用的是默克公司的货号为Q1754的Q-sepharose离子交换层析介质。
用Q-sepharose离子交换层析介质装填离子交换层析柱；用pH7.5的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液，10个柱体积平衡上述层析柱；将步骤(4)制备的腹水上样到上述层析柱，用pH7.5的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液，以2ml/min的流速清洗层析柱5个柱体积；用含有0.3M NaCl的pH7.5的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱层析柱，收集洗脱产物，即为纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体。
S2、制备鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段：
将木瓜蛋白酶溶解在pH8、浓度为100mM的Tris.HCl缓冲液中，缓冲液中加入四氨基乙二胺EDTA和二硫苏糖醇DTT，四氨基乙二胺EDTA的终浓度在3mM；二硫苏糖醇DTT的终浓度在0.8mM。
在步骤S1制备的纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体中，加入上述木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶溶液与抗体的摩尔浓度比例为1：20，在36℃条件下，反应5小时。
反应完成后，在上述反应液中加入40mM的碘乙酸铵终止反应，然后冰浴3小时。冰浴反应混合物在pH8、浓度为100mM的Tris.HCl缓冲液中25℃透析5小时。
上述反应液利用市售的Protein G亲和层析柱进行F(ab)2片段纯化，本制备例终使用GE公司的HiTrap Protein G亲和层析柱。
将pH8、浓度为50mM的Tris.HCl缓冲液，10个柱体积平衡Protein G亲和层析柱。
将上述透析后的产物上样到Protein G亲和层析柱中，用pH8、浓度为50mM的Tris.HCl缓冲液，3个柱体积进行清洗。收集穿透液，穿透液中的产物就是纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段。
由于Protein G与鼠的抗体Fc片段有特异性的结合能力，因此透析产物中的Fc片段杂质被结合到Protein G上。未被结合的抗体F(ab)2片段被清洗，保留在穿透液中。因此穿透液中的产物就是纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)抗体F(ab)2片段。
S3、制备生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段：
取S2制得的纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)抗体F(ab)2片段，以下简称为Anti-ProteinA F(ab)2片段。
Anti-ProteinA F(ab)2片段用50mM、pH9的碳酸氢钠缓冲液溶解，至终浓度在1.8mg/ml；将N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)用二甲基亚砜(DMSO)溶解，终浓度为3mg/ml；将上述两种溶液按比例混合，混合比例为每1mg的Anti-ProteinA F(ab)2加入140μg的N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)；上述混合后的溶液在37℃下搅拌反应5小时。
在上述反应后的混合液中加入1mM的氯化铵溶液，加入比例为每30μg的NHSB加入1μl氯化铵溶液，在37℃下搅拌反应30分钟。
将上述反应液用浓度为50mM、pH 7.6的磷酸缓冲液透析，透析条件为4℃下透析过夜。
将透析后得到的生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A的F(ab)2片段用50mM，pH值在7.6的磷酸缓冲液调整至终浓度在100ng/ml。
制备例4
酶标记的抗生物素蛋白，酶为辣根过氧化物酶，抗生物素蛋白为链霉亲和素SA。
制备方法如下：
称取辣根过氧化物酶(HRP)50mg，溶解于0.5ml的100mM的碳酸氢钠(NaHCO3)溶液中；在上述溶液中，加入等体积的10mM的过碘酸钠(NaIO4)溶液，混匀。在37℃下避光反应3小时。
在上述溶液中，加入0.75ml的100mM的Na2CO3溶液，混匀；再加入终浓度为10mg/ml的链霉亲和素(SA)，混匀；37℃下反应3小时。
在上述溶液中，加入1/20体积的4mg/ml的硼氢化钠(NaBH4)溶液，37℃下反应45分钟。
将上述反应液用浓度为50mM、pH 7.6的磷酸缓冲液透析，透析条件为4℃下透析过夜。
将透析后得到的的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素SA用50mM、pH7.6的磷酸缓冲液调整至终浓度在50ng/ml。
制备例5
样品稀释液，包括缓冲系统、保护性组分、表面活性剂、指示剂和防腐剂。
缓冲系统为磷酸缓冲液，浓度为50mM，pH为7.8；保护性组分包括保护性蛋白和保护性核苷酸；保护性蛋白包括但不限于血清白蛋白、卵清蛋白、免疫球蛋白等，终浓度为0.1％-2％(质量/体积)，本制备例中保护性蛋白为市售的牛血清白蛋白，终浓度为0.75％(质量/体积)；保护性核苷酸包括但不限于腺苷二磷酸，尿苷二磷酸，胞苷二磷酸、胸苷二磷酸等，终浓度为0.05％-2％(质量/体积)，本制备例中保护性核苷酸为腺苷二磷酸，终浓度为0.5％(质量/体积)；表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂、双离子表面活性剂等，本制备例中表面活性剂为非离子型表面活性剂Tween-20，终浓度为0.1％(体积/体积)；指示剂为溴酚红，终浓度为0.001％(体积/体积)；防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫柳汞、抗生素、Proclin300等，本制备例中防腐剂为Proclin300，终浓度为0.1％(体积/体积)。
制备方法如下：
配制pH7.8、50mM的磷酸缓冲液，在磷酸缓冲液中加入终浓度为0.75％的牛血清白蛋白，终浓度为0.5％的胸苷二磷酸，终浓度为0.1％的Tween-20，终浓度为0.1％的Proclin300，终浓度为0.001％的溴酚红。将上述缓冲液搅拌均匀，保证充分溶解，得到样品稀释液。
制备例6
显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液，制备方法如下：
底物显色A液：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，上述各原料混匀，然后蒸馏水加至500ml。
底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，TMB盐酸盐0.15g，上述各原料混匀，然后蒸馏水加至500ml。
使用前A液和B液按照体积比1:1混合即可。
制备例7
洗涤液的制备方法如下：
配制pH7.8、50mM的磷酸缓冲液，在磷酸缓冲液中加入终浓度为0.1％的Tween-20，制成洗涤液。
实施例
实施例1
一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，包括：
制备例1制得的包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板；
制备例2制得的金黄色葡萄球菌蛋白A标准品；
制备例3制得的生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段；
制备例4制得的酶标记的抗生物素蛋白；
制备例5制得的样品稀释液；
制备例6制得的显色液；
制备例7制得的洗涤液；
终止液，为2mol/L的硫酸。
对比例
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：微孔板包被的抗体不同。
一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，包括：
包被有人IgG抗体的微孔板，其中人IgG抗体购自北京索莱宝生物技术公司(货号SP001)，其制备方法如下：
用包被缓冲液(35mmol/L NaHCO3，15mmol/L Na2CO3，pH9.6)将人IgG抗体稀释至5g/ml，在96孔ELISA板中每孔加入100μl，在4℃下过夜。去除后于37℃放置30min，用本发明描述的洗涤缓冲液洗涤三次。在吸水纸上拍干。每孔加入本发明描述的封闭缓冲液200μl。在37℃放置2h，进行封闭。封闭完成后，用本发明描述的洗涤缓冲液洗涤三次，在吸水纸上拍干。
制备例2制得的金黄色葡萄球菌蛋白A标准品。
制备例3制得的生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段。
制备例4制得的酶标记的抗生物素蛋白。
制备例5制得的样品稀释液。
制备例6制得的显色液。
制备例7制得的洗涤液。
终止液，为2mol/L的硫酸。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于：将鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段替换为鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体，鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体由制备例3中S1步骤制得。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于：将鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段替换为兔抗金黄色葡萄球菌蛋白A多克隆抗体。
一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，包括：
制备例1制得的包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板；
制备例2制得的金黄色葡萄球菌蛋白A标准品；
辣根过氧化物酶标记的兔抗金黄色葡萄球菌蛋白A多克隆抗体，其中兔抗金黄色葡萄球菌蛋白A多克隆抗体购自sigma公司，货号P3775，其制备方法如下：
称取辣根过氧化物酶(HRP)50mg，溶解于0.5ml的100mM的碳酸氢钠(NaHCO3)溶液中；在上述溶液中，加入等体积的10mM的过碘酸钠(NaIO4)溶液，混匀。在37℃下避光反应3小时。
在上述溶液中，加入0.75ml的100mM的Na2CO3溶液，混匀；再加入终浓度为10mg/ml兔抗金黄色葡萄球菌蛋白A多克隆抗体，混匀；37℃下反应3小时。
在上述溶液中，加入1/20体积的4mg/ml的硼氢化钠(NaBH4)溶液，37℃下反应45分钟。
将上述反应液用浓度为50mM、pH 7.6的磷酸缓冲液PBS透析，透析条件为4℃下透析过夜。
将透析后得到的的辣根过氧化物酶标记的兔抗金黄色葡萄球菌蛋白A多克隆抗体用50mM、pH 7.6的磷酸缓冲液调整至终浓度在50ng/ml。
制备例5制得的样品稀释液。
制备例6制得的显色液。
制备例7制得的洗涤液。
终止液，为2mol/L的硫酸。
性能检测试验
检测方法
对上述实施例制得的试剂盒的性能指标进行验证，包括检测灵敏度、检测特异性、检测准确性、高IgG背景对检测的干扰等性能。
检测方法如下：
S1、标准品准备
利用样品稀释液，将金黄色葡萄球菌蛋白A标准品配制成如下浓度：
2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml、7.8125pg/ml、3.90625pg/ml、1.953125pg/ml0.9765625pg/ml和0pg/ml。
S2、待检样品准备
(1)试剂盒特异性验证样本准备：
将大肠杆菌宿主蛋白(ECP)、仓鼠CHO细胞宿主蛋白(CHO-HCP)、牛血清白蛋白(BSA)、牛免疫球蛋白IgG(牛IgG)、人免疫球蛋白IgG(人IgG)、小鼠免疫球蛋白IgG(鼠IgG)作为待检样本，检测试剂盒的特异性。将上述待检样品用样品稀释液，配制到终浓度100ng/ml。
(2)试剂盒准确性验证样本准备：
分别配制三种金黄色葡萄球菌蛋白A样本：金黄色葡萄球菌蛋白A(购置Sigma货号P6031)用样品稀释液配制，终浓度分别为30pg/ml、300pg/ml及600pg/ml。
利用各实施例或对比例制得的试剂盒检测其浓度，计算回收率。
(3)IgG抗体对试剂盒检测的干扰性验证样本准备：
纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体，(购自Sigam公司，货号P2921)用样品稀释液配制，终浓度为0.1mg/ml。
用上述含纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的样本稀释液，稀释金黄色葡萄球菌蛋白A标准品，终浓度为：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml和0pg/ml。
S3、检测过程
在包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板中，加入本检测方法中S1步骤制备的标准品，每孔加入100μl，每个浓度的标准品加入3个重复；
在另外的板孔中加入待检样品，每孔100ul，每个待检样品加入3个重复；
37℃条件下孵育2小时；
用洗涤液，洗涤板孔3次；
在板孔中加入生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段，每孔100ul，37℃条件下孵育1小时；
用洗涤液，洗涤板孔3次；
在板孔中加入酶标记的抗生物素蛋白，每孔100ul，37℃条件下孵育1小时；
将制备例6中制备的显色A液、显色B液等体积混合，在板孔中加入混合后的显色液，每孔100ul，37℃条件下避光孵育15分钟；
在板孔中加入终止液终止反应，每孔100ul；
在450nm波长下读取微孔板各孔的吸光度值，并进行分析。
检测结果
实施例1的检测结果
结果1.检测灵敏度
倍比稀释的标准品吸光度值如下表：
根据检测结果可知，实施例1制得的试剂盒检测限为1.95pg/ml，适当的线性检测范围为1000pg/ml-3.91pg/ml。最低检测限与线性范围的确定方法参照《体外诊断检验系统性能评价方法第3部分：检出限与定量限》。
结果2.特异性检测
特异性检测结果见下表，从结果可以看出下表中几种蛋白与实施例1制得的试剂盒无特异性信号，时间特异性良好。
结果3.准确性检测
本检测通过已知浓度待检物通过本试剂盒检测，根据标准曲线计算检出浓度。根据下列公式计算回收率，根据回收率评价本发明的试剂盒检测的准确性。
回收率＝检出的样本浓度/已知的样本浓度×100％。
在本实施例中，检出的样本浓度为三次检测浓度的平均值。回收率结果如下：
样本浓度(pg/ml) 检出浓度(pg/ml) 回收率(％)
30 32.67 108.9
300 304.75 101.5833333
600 579.24 96.54
从结果看出，在低浓度、中浓度和高浓度三种浓度的检测回收率都在90％-110％之间。试剂盒的检测准确性良好。
结果4.试剂盒抗体背景干扰试验结果
检测结果如下表：
从上述结果可以看出，在0.1mg/ml的鼠IgG背景下，标准品的吸光度值并无明显变化。说明本实施例的试剂盒，抗IgG干扰性能优越。
应用例
应用例1
本应用例通过在高浓度的人IgG抗体背景下，采用实施例1制得的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒在不同浓度的金黄色葡萄球菌蛋白A的检测，确定金黄色葡萄球菌蛋白A的残留检出水平。
S1、标准品准备
利用样品稀释液，将金黄色葡萄球菌蛋白A标准品配制成如下浓度：
1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml、7.8125pg/ml、3.90625pg/ml、1.953125pg/ml和0pg/ml。
S2、待检样品准备
离子交换层析方法纯化的人IgG抗体，用样品稀释液配制，终浓度为1mg/ml。
纯化方法如下：
使用默克公司的货号为Q1754的Q-sepharose离子交换层析介质。
用Q-sepharose离子交换层析介质装填离子交换层析柱；用pH7.5的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液，10个柱体积平衡上述层析柱；将人血清上样到上述层析柱，用pH7.5的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液，以2ml/min的流速清洗层析柱5个柱体积；用含有0.3M NaCl的pH7.5的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱层析柱，收集洗脱产物，即为纯化的人IgG抗体。
上述离子交换层析方法纯化的人IgG抗体，酸碱度至pH4.5.
用上述含人IgG抗体的样本稀释液，稀释金黄色葡萄球菌蛋白A标准品。终浓度为：1000pg/ml、500pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、10pg/ml和0pg/ml。同时人IgG抗体的浓度为0.5mg/ml。
S3、检测过程
在包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板中，加入S1步骤制备的标准品，每孔加入100μl，每个浓度的标准品加入3个重复；
在另外的板孔中加入待检样品，每孔100ul，每个待检样品加入3个重复；
37℃条件下孵育2小时；
用洗涤液，洗涤板孔3次；
在板孔中加入生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段，每孔100ul，37℃条件下孵育1小时；
用洗涤液，洗涤板孔3次；
在板孔中加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，每孔100ul，37℃条件下孵育1小时；
将制备例6中制备的显色A液、B液等体积混合，在板孔中加入混合后的显色液，每孔100ul，37℃条件下避光孵育15分钟；
在板孔中加入终止液终止反应，每孔100ul；
在450nm波长下读取微孔板各孔的吸光度值，并进行分析。
根据标准曲线，检测结果如下：
从上述检测结果可以看出，从1000pg/ml-50pg/ml，检测的回收率都在95％-110％之间。10pg/ml样本的检测回收率在124.4％。
试剂盒对金黄色葡萄球菌蛋白A的残留检出水平较高，能够准确检出0.5mg/ml含人IgG的，pH值在4.5的的样本中，50pg/ml的金黄色葡萄球菌蛋白A的污染，也就是能够检出0.1PPM的金黄色葡萄球菌蛋白A的污染。
应用例2
用实施例1制得的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒检测牛奶中金黄色葡萄球菌的含量。
S1、标准品准备
与应用例1中相同。
S2、待检样品准备
三份待检的牛奶样本，牛奶样本购自超市。分别标记为样本1、样本2、样本3。为了保证阳性的检出，三份样本均在室温下不同的环境中放置2天。三份样本均为开盖放置。
S3、检测过程
与应用例1中相同。
在450nm波长下读取微孔板各孔的吸光度值，并进行分析。
根据标准曲线，检测结果如下：
样本1 样本2 样本3
阴性 阴性 36.4pg/ml
从上述检测结果可以看出，本申请的试剂盒能有效的检出牛奶中的金黄色葡萄球菌污染。
应用例3
本应用例通过实施例1制得的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒在中性条件和酸性条件下分别检测金黄色葡萄球菌蛋白A的残留，进行比较。
S1、标准品准备
与应用例1中相同。
S2、待检样品准备
人IgG抗体购自北京索莱宝生物技术公司(货号SP001)，用样品稀释液配制，终浓度为5mg/ml。
将样品稀释液分为两份，分别调节pH值为pH4和pH7。分别用两份不同pH的样品稀释液，稀释金黄色葡萄球菌蛋白A标准品。终浓度为：1000pg/ml、100pg/ml和50pg/ml。同时人IgG抗体的浓度为0.5mg/ml。
最终得到两组在不同pH缓冲液环境下的不同浓度的金黄色葡萄球菌蛋白A标准品。分别为对照组A(pH4.0)和对照组B(pH7.0)。
S3、检测过程
与应用例1中相同。
在450nm波长下读取微孔板各孔的吸光度值，并进行分析。
检测结果如下：
从上述检测结果可以看出，本申请的试剂盒在酸性条件和中性条件下均能够有效的检测出金黄色葡萄球菌蛋白A的残留。
应用例4
本应用例通过实施例1制得的试剂盒和对比例1制得的试剂盒分别检测在鼠IgG抗体背景下的金黄色葡萄球菌蛋白A残留，比较其检测结果。
实施例1制得的试剂盒的检测设置成对照组A，对比例1制得的试剂盒的检测设置成对照组B。
S1、标准品准备
与应用例1中相同。
S2、待检样品准备
取鼠的IgG抗体(购自默克公司，货号NI03)，用样品稀释液稀释至5mg/ml，等分为三组。金黄色葡萄球菌蛋白A(购自Sigma公司，货号P6031)，加入到上述鼠IgG抗体溶液中，终浓度分别为30pg/ml，300pg/ml和600pg/ml。
S3、检测过程
与应用例1中相同。
检测结果如下：
上述检测结果显示，实施例1制得的试剂盒检出水平较高，但是对比例1制得的试剂盒无法检出低浓度的金黄色葡萄球菌蛋白A残留，并且高达600pg/ml的金黄色葡萄球菌蛋白A残留仍然有两孔无法检出，只有一孔得到检测信号，回收率只有38.5％，与样本中的待检物浓度差别很大。
分析其原因，对比例1制得的试剂盒，可能是因为在高浓度的鼠IgG抗体背景下，金黄色葡萄球菌蛋白A与鼠IgG抗体的Fc区域结合，而包被在微孔板上的人IgG抗体作为捕获抗体，与作为背景的鼠IgG抗体在结合金黄色葡萄球菌蛋白A时是同一个结合区域。由于金黄色葡萄球菌蛋白A已经被鼠IgG饱和，因此无法与微孔板上的人IgG结合。而作为背景的鼠IgG抗体浓度为5mg/ml，是在抗体药物中比较常见的一个浓度。在这一浓度下，金黄色葡萄球菌蛋白A已经被饱和。而实施例1制得的试剂盒，由于采用了鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY抗体，金黄色葡萄球菌蛋白A不与鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY抗体结合，则有效避免了上述问题，能够成功地在不同浓度下均能检测到金黄色葡萄球菌蛋白A残留，并且具有较高的回收率。
应用例5
本应用例通过实施例1制得的试剂盒和对比例2制得的试剂盒分别检测在鼠IgG抗体背景下的金黄色葡萄球菌蛋白A残留，比较其检测结果。
实施例1制得的试剂盒的检测设置成对照组A，对比例2制得的试剂盒的检测设置成对照组B。
S1、标准品准备
与应用例1中相同。
S2、待检样品准备
牛奶样本，购自超市，品牌略。多个牛奶样本在室温下开盖放置，用Thermofisher公司的金黄色葡萄球菌检测试剂盒(货号A44255)检测阳性后继续放置两天。作为待检样本。将上述金黄色葡萄球菌阳性的牛奶样本分为两组共20份，每组10份。
S3、检测过程
与应用例1中相同。
检测结果如下：
/>
从上述检测结果可以看出，对比例2制得的试剂盒中，采用鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体作为检测抗体，检测中的变异系数达到20％，远高于实施例1制得的试剂盒，这将在实际应用中带来巨大的检测误差。而本申请的试剂盒由于采用了鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段作为检测抗体，检测特异性较好。
应用例6
本应用例通过实施例1制得的试剂盒和对比例3制得的试剂盒分别检测在鼠IgG抗体背景下的金黄色葡萄球菌蛋白A残留，比较其检测结果。
实施例1制得的试剂盒的检测设置成对照组A，对比例3制得的试剂盒的检测设置成对照组B。
S1、标准品准备
与应用例1中相同。
S2、待检样品准备
取鼠的IgG抗体(购自默克公司，货号NI03)，用样品稀释液稀释至5mg/ml，等分为两组。金黄色葡萄球菌蛋白A(购自Sigma公司，货号P6031)，加入到上述鼠IgG抗体溶液中，终浓度分别为30pg/ml，300pg/ml和600pg/ml。
S3、检测过程
与应用例1中相同。
检测结果如下：
上述检测结果显示，实施例1制得的试剂盒能有效的检测出30pg/ml，300pg/ml和600pg/ml的金黄色葡萄球菌蛋白A的残留。对比例3制得的试剂盒，以兔抗金黄色葡萄球菌蛋白A多克隆抗体作为检测抗体，则不能有效的检测出低浓度的金黄色葡萄球菌蛋白A。在300pg/ml浓度时，也有4例未检出。并且对比例3制得的试剂盒检测时变异系数明显高于实施例1制得的试剂盒，这将在实际应用中带来巨大的检测误差。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，其特征在于，包括：
包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板；
金黄色葡萄球菌蛋白A标准品；
生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段；
酶标记的抗生物素蛋白；
样品稀释液；
显色液；
洗涤液；
终止液。
2.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，其特征在于，鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体为鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A的IgY多克隆抗体，且在pH为3-7的环境中能够保持活性。
3.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，其特征在于，包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板制备方法如下：
S1、制备鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体；
S2、微孔板包被：
在微孔板中，每孔加入200ul用碳酸缓冲液稀释的鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体，进行孵育；
碳酸缓冲液的浓度为10mM-100mM，缓冲对为Na2CO3和NaHCO3，pH为9-10；
鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的浓度为1-10μg/ml；
孵育条件为4℃过夜；
S3、微孔板洗涤、封闭、干燥。
4.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，其特征在于，金黄色葡萄球菌蛋白A标准品的配制方法为：将金黄色葡萄球菌蛋白A溶解在标准品缓冲液中，配制成金黄色葡萄球菌蛋白A标准品，金黄色葡萄球菌蛋白A的浓度为10ng/ml-500ng/ml，标准品缓冲液为浓度20mM-50mM、pH6.5-pH8.5的磷酸缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，其特征在于，生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段的制备方法如下：
S1、由金黄色葡萄球菌蛋白A免疫小鼠后筛选得到鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体；
S2、对鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体采用木瓜蛋白酶酶切法制备F(ab)2片段，然后采用亲和层析法纯化，亲和层析介质采用链球菌蛋白G，制得纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段；
S3、采用N-羟基琥珀酰亚胺对S2制得的纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段进行标记，制得生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段。
6.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒，其特征在于，样品稀释液包括缓冲系统、保护性组分、表面活性剂、指示剂和防腐剂；
缓冲系统为磷酸缓冲液，摩尔浓度为10mM-200mM，pH为7-9；
保护性组分包括保护性蛋白和保护性核苷酸；保护性蛋白为血清白蛋白，终浓度为0.1％-2％；保护性核苷酸为腺苷二磷酸，终浓度为0.05％-2％；
表面活性剂为非离子型表面活性剂Tween-20，终浓度为0.05％-0.5％；
指示剂为溴酚红，终浓度为0.0001％-0.001％；
防腐剂为Proclin300，终浓度为0.01％-0.1％。
7.一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒的应用，其特征在于，权利要求1-6中任一项所述的试剂盒，可用于抗体中的金黄色葡萄球菌蛋白A残留的检测。
8.一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒的应用，其特征在于，权利要求1-6中任一项所述的试剂盒，可用于金黄色葡萄球菌感染的检测。
9.根据权利要求7或8所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒的应用，其特征在于，检测方法如下：
S1、标准品准备：采用样品稀释液，将金黄色葡萄球菌蛋白A标准品配制成如下浓度：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml、7.8125pg/ml、3.90625pg/ml、1.953125pg/ml和0pg/ml；
S2、待检样品准备；
S3、检测过程：在包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体的微孔板中，加入S1步骤制得的标准品，每孔加入100μl，每个浓度的标准品加入3个重复；
在其余空白板孔中加入待检样品，每孔100ul，每个待检样品加入3个重复，在37℃条件下孵育2小时，用洗涤液洗涤板孔3次，在吸水纸上拍干；
在上述板孔中加入生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白A抗体F(ab)2片段，每孔100ul，37℃条件下孵育1小时，用洗涤液洗涤板孔3次，拍干；
在板孔中加入酶标记的抗生物素蛋白，每孔100ul，37℃条件下孵育1小时；
在板孔中加入显色液，每孔100ul，37℃条件下避光孵育15分钟；
在板孔中加入终止液终止反应，每孔100ul；
在450nm波长下读取微孔板中各孔的吸光度值，并进行分析。
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