CN102698717A - 一种蛋白a吸附介质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白A吸附介质。本发明所述的蛋白A吸附介质是由固相载体材料和通过化学偶联固定在载体上的配体构成，所述配体是具有如序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的重组蛋白A。本发明所述的蛋白A吸附介质可耐受121.5℃、20分钟热压灭菌，解决了蛋白A免疫吸附柱产品不能进行产品最终灭菌的问题。

Description

一种蛋白A吸附介质

技术领域

本发明属于基因工程技术及抗体吸附技术领域，涉及一种蛋白A吸附介质。

背景技术

蛋白A来源于金黄色葡萄球菌的细胞壁，全称为金黄色葡萄球菌蛋白A，简称蛋白A或SPA。天然蛋白A的基因编码序列由1464个碱基组成，共编码488个氨基酸，分子量约42kd，包含E、D、A、B、C和X（从氨基端至羧基端）共六个结构域。众所周知，由于蛋白A能选择性吸附人或哺乳动物的抗体（主要为IgG、也包括部分的IgA和IgM），因而被广泛应用于抗体纯化、医学诊断及临床治疗等多个领域。

在临床治疗方面，以蛋白A为配体的蛋白A吸附介质被用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病，以及用于降低肾移植患者的抗体水平等，并取得了较好的疗效。目前在国外市场上应用的蛋白A免疫吸附柱产品（将蛋白A吸附介质填装于柱体中制成）主要有Prosorba和Immunosorba两种，均为Fresenius Medical Care公司生产。由于蛋白A免疫吸附柱在临床治疗过程中属于体内应用（属于三类医疗器械），对人体具有潜在危险，因而必须对其安全性、有效性进行严格控制。但由于蛋白A吸附介质在热压灭菌后会部分或完全失去抗体吸附性能，目前的蛋白A免疫吸附柱产品均未进行最终灭菌，这无疑增加了产品的安全性风险，并导致必须对产品生产过程进行更为严格的控制（即无菌生产工艺），使工艺流程更为复杂。事实上，目前尚未有能够耐受热压灭菌的蛋白A吸附介质的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可耐受热压灭菌的蛋白A吸附介质，以解决蛋白A免疫吸附柱产品不能进行产品最终灭菌的问题。

本发明所述的蛋白A吸附介质是一种可耐受121.5℃、20分钟热压灭菌的蛋白A吸附介质，它是由固相载体材料和通过化学偶联固定在载体上的配体构成，所述配体是具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的重组蛋白A，并且由以下步骤制备：

a、将固相载体材料按质量比1：1.5与0.2M高碘酸钠溶液混匀，15-25℃振摇反应4小时，用水洗涤干净，抽干得到填料；

b、于步骤a所得的填料中加入含具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的重组蛋白A的硼酸盐缓冲液，使每克填料对应的重组蛋白A质量不低于10mg，15-25℃振摇反应8小时，用水洗涤干净，抽干得到合成填料；

c、于步骤b所得的合成填料中按质量比1：1.5加入含1%硼氢化钠的PBS溶液，15-25℃振摇反应4小时，用水洗涤干净后即得。

根据本发明所述蛋白A吸附介质的进一步特征，所述固相载体材料是琼脂糖凝胶微球。

附图说明

图1是重组蛋白A制备过程中各样品的SDS-PAGE电泳图，泳道1是超声破碎细胞并离心后获得的沉淀；泳道2是超声破碎细胞并离心后获得的上清；泳道3是低分子量蛋白标准，自上而下依次为97kd、66kd、44kd、29kd、20kd和14kd；泳道4为钴离子螯合亲和层析纯化的穿流峰；泳道5为最终获得的重组蛋白A；泳道6和7为钴离子螯合亲和层析纯化的洗脱液；泳道8为经诱导表达后的细菌总蛋白。

图2是编号为①的蛋白A吸附介质在热压灭菌前后的血浆吸附试验的洗脱液的SDS-PAGE电泳图，泳道1是热压灭菌前的吸附介质的洗脱液；泳道2、3、4分别是热压灭菌后的吸附介质在循环1、2、3的洗脱液；泳道5是低分子量蛋白标准，自上而下依次为97kd、66kd、44kd、29kd、20kd和14kd。

图3是编号①~④的蛋白A吸附介质在热压灭菌前后的抗体吸附量。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。

一、重组蛋白A的制备

通过以下方法获得重组蛋白A的基因编码序列：

1、直接合成全序列（SEQ ID NO.2）；

2、合成构成重组蛋白A的重复单元的编码序列（SEQ ID NO.3），在该序列两端分别有一个AccI的酶切位点，由于AccI的识别序列是非回文序列，因此含重复单元编码序列的DNA片段经该酶酶切后，可保证首尾相连地连接起来，获得含若干个重复单元编码序列的DNA片段（Nilsson B， et al. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A. Protein Engineering， vol.1，1987，p107-113），再从中挑选出具有全序列（SEQ ID NO.2）的重组蛋白A的基因编码序列。

在获得重组蛋白A编码序列的同时，在该序列两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，通过酶切连接反应将其连接入适合于大肠杆菌宿主细胞的表达质粒，并将所获得的包含重组蛋白A编码序列的表达质粒转入大肠杆菌细胞，经细菌培养、蛋白表达和纯化后获得重组蛋白A。

上述合适的限制性内切酶的酶切位点包括NdeI、XhoI等，只要能将重组蛋白A编码序列连接入相应表达质粒均可。

上述适合于大肠杆菌宿主细胞的表达质粒包括本领域常见的pQE系列（Qiagen公司生产）、pET系列（Novagen公司生产）等，只要该质粒能稳定存在于大肠杆菌宿主细胞，并一定条件下（如添加诱导剂）可表达其包含的外源基因。

上述大肠杆菌菌株包括BL21(DE3)、JM109、DH5α、Origami等，只要该菌株能表达其所包含的存在于表达质粒上的外源基因。

上述在大肠杆菌中表达外源基因的方法为本领域常规方法，详见《分子克隆实验指南》（第三版，大肠杆菌中外源基因的表达部分）。

上述蛋白纯化方法包括金属离子螯合层析、亲和层析、离子交换层析、分子筛层析等的一种或几种，只要该方法能获取纯度高于80%的重组蛋白A。

实施例：重组蛋白A的制备

直接合成包含重组蛋白A的重复单元编码序列的DNA片段（SEQ ID NO.3），经NdeI和XhoI酶切后，将上述DNA片段连接入载体本领域公知的载体pUC18，用AccI酶切该载体，将所得小片段进行首尾连接，再与载体片段连接，可得含若干个重复单元编码序列的重组质粒，经酶切鉴定筛选出含本发明所述的重组蛋白A编码序列（SEQ ID NO.2）的重组质粒，通过NdeI和XhoI酶切将重组蛋白A编码序列转移至本领域公知的原核表达质粒pET22b，得到重组表达质粒。将该重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，获得的重组表达菌株分别接种于10个三角瓶，每瓶含1L 灭菌LB培养基，于37℃振摇培养至OD600=1.2，加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至终浓度为0.5mM，继续振摇4小时后，10000g离心10min收集细菌，湿重约90克；混匀于500mlPBS缓冲液，超声破碎细胞后10000g离心10min收集上清组分，经钴离子螯合亲和层析纯化，用180mM咪唑的PBS缓冲液冲洗并收集洗脱液1560ml，加入-20℃预冷的无水乙醇至乙醇浓度为75%，静置1小时以上，10000g离心10min，弃上清并将沉淀重溶于100ml硼酸盐缓冲液（pH8-9），获得重组蛋白A，其浓度以紫外法测定：重组蛋白A（mg/ml）=A275/0.2139，经测定浓度为12.5mg/ml。

二、蛋白A吸附介质的制备

将重组蛋白A与固相载体偶联，以获得相应的吸附介质。

所述固相载体可以选自琼脂糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖或聚乙烯醇等天然或合成高分子材料，应具有良好的亲水性且本身基本不吸附蛋白质。

所述重组蛋白A与固相载体偶联的方法包括以下步骤：

①载体的活化，常见的活化试剂包括环氧乙烷、环氧氯丙烷、溴化氰、高碘酸钠等；

②蛋白质通过其氨基和/或巯基与活化基团反应以实现偶联。在蛋白配体与载体之间可以加入间隔臂以有利于蛋白配体的偶联反应和抗体吸附。

实施例：蛋白A吸附介质的制备

将40克琼脂糖凝胶Sepharose 6FF按质量体积比1：1.5与60ml 0.2M高碘酸钠溶液混匀，室温（15-25℃）下200rpm振摇反应4小时，用水多次洗涤干净后分为4等份，每份8-10克，加入浓度为10mg/ml的重组蛋白A，使每g填料对应的重组蛋白A质量依次为10mg、15mg、20mg、25mg，室温（15-25℃）下200rpm振摇反应8小时，再用水多次洗涤干净后，按质量体积比1：1.5加入含1%硼氢化钠的PBS溶液，室温（15-25℃）下200rpm振摇反应4小时，用水多次洗涤干净后得蛋白A吸附介质，分别编号为①②③④。

三、吸附介质的抗体吸附量测试

将一定量吸附介质填装于层析柱中，先用pH6-8的缓冲液平衡，以人血浆流经吸附介质，再用缓冲液冲洗介质至无蛋白成分流出，用pH2-3的洗脱液冲洗介质，收集洗脱液，以紫外吸收法测定洗脱液中IgG的浓度，进而计算吸附介质的抗体吸附量，单位是mgIgG/ml介质。

四、吸附介质的热稳定性测试

将蛋白A吸附介质浸泡于生理盐水，经121.5℃，20min灭菌后，放置恢复至常温，按前述方法测定热压灭菌前后吸附介质的抗体吸附量。

上述蛋白A吸附介质经热压灭菌后，抗体吸附量与热压灭菌前相比没有明显变化，且仍能进行反复吸附-洗脱循环，吸附介质对抗体吸附的选择性也没有变化。因此，上述蛋白A吸附介质可耐受热压灭菌。

实施例：吸附介质的热稳定性测试

将蛋白A吸附介质抽干后，称取约4g浸泡于生理盐水，经121.5℃，20min灭菌后，恢复至常温备用。

分别将未经热压灭菌（灭菌前）和经热压灭菌（灭菌后）的吸附介质充分抽干后，准确称取2.8克（即4.2ml），填装于层析柱中，以10ml PBS平衡后，用20ml人血浆流经吸附介质，继续用PBS冲洗至无蛋白成分流出，用pH2-3的柠檬酸缓冲液冲洗介质至抗体完全洗脱，收集洗脱液，即为一次吸附-洗脱循环。测定洗脱液在278nm处的吸收值A₂₇₈，以A₂₇₈/1.38为IgG浓度（单位是mg/mL），进而计算吸附介质的抗体吸附量。对灭菌后的吸附介质进行3次吸附-洗脱循环，并测定每次循环的抗体吸附量。具体结果如表1所示，可以看出，经热压灭菌后，以重组蛋白A为配体的吸附介质的抗体吸附量与热压灭菌前相比没有明显变化，且仍能进行反复吸附-洗脱循环；另外，洗脱液的SDS-PAGE电泳结果（图2）表明经热压灭菌后的吸附介质对抗体吸附的选择性也没有变化，仍以IgG为主。因此，上述蛋白A吸附介质能够耐受121.5℃，20min热压灭菌。

Claims (2)

1.一种可耐受121.5℃、20分钟热压灭菌的蛋白A吸附介质，其特征在于：所述蛋白A吸附介质是由固相载体材料和通过化学偶联固定在载体上的配体构成，所述配体是具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的重组蛋白A，并且由以下步骤制备：

a、将固相载体材料按质量比1：1.5与0.2M高碘酸钠溶液混匀，15-25℃振摇反应4小时，用水洗涤干净，抽干得到填料；

b、于步骤a所得的填料中加入含具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的重组蛋白A的硼酸盐缓冲液，使每克填料对应的重组蛋白A质量不低于10mg，15-25℃振摇反应8小时，用水洗涤干净，抽干得到合成填料；

c、于步骤b所得的合成填料中按质量比1：1.5加入含1%硼氢化钠的PBS溶液，15-25℃振摇反应4小时，用水洗涤干净后即得。

2.根据权利要求1所述蛋白A吸附介质，其特征在于：所述固相载体材料是琼脂糖凝胶微球。

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