CN103184229A - 重组蛋白a/g基因及其表达产物的制备、应用 - Google Patents

Abstract

一种重组融合蛋白的制备及应用。本发明属于生物工程技术领域。本发明是将金黄色葡萄球菌蛋白A和链球菌蛋白G的IgG结合域基因进行串联，插入热诱导型大肠杆菌载体pBV220，构建了含有该基因的大肠杆菌重组表达载体及其转化的大肠杆菌DH5α重组菌株和利用此菌株生产重组蛋白A/G的方法。此菌株所产生的可溶性重组蛋白A/G达到细菌可溶性蛋白总量的40％以上，经镍离子螯合层析纯化和阴离子交换层析纯化可将重组蛋白A/G的纯度达到95％以上，该蛋白具有表达量高、成本低、易纯化等优点。用这种重组蛋白为配基制备的亲和填料兼具有蛋白A和蛋白G与IgG结合的特点，可以和更多种属哺乳动物的IgG很好地结合，可广泛用于不同种属哺乳动物IgG的纯化。

Description

重组蛋白A/G基因及其表达产物的制备、应用

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组蛋白A/G基因，以及含有这种重组基因的载体、转化的菌株和重组蛋白A基因表达的产物，及其纯化方法和亲和填料的制备和用途。

背景技术：

葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中含有一种物质，在双向扩散试验中，能与正常人血清形成沉淀。1959年Jensen也发现了类似现象，将其命名为A抗原。1963年Lofkvist等人分离了A物质，证明它是一种蛋白质，且与糖有不同；1960年Grov命名其为葡萄球菌蛋白A，简称SPA(Protein A)。编码SPA的基因于1983年被克隆并在大肠杆菌中表达。Uhlen等在1984年阐明了蛋白A的全基因序列和相应的氨基酸序列。对蛋白A的结构和功能研究发现，SPA包括A、B、C、D、E等5个同源结构域，每个结构域都有与大多数哺乳动物IgG的Fc区独立结合的能力。2003年，L.Yang等应用表面张力探针证明每个蛋白A分子可结合两个IgG分子。

链球菌蛋白G(Streptococcal Protein G，SPG)是一种从链球菌细胞壁和培养上清中分离的蛋白质。1973年，Kronvall报道了链球菌A、C和G群许多菌株的细胞壁及培养上清中含有能与IgG Fc片段结合的蛋白质，其特性与金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus A protein，SPA)明显不同。1984年，Bjorck等将其统称为链球菌蛋白G(SPG)。

SPG与SPA虽然都能结合IgG，但分子结构研究表明，它们是完全不同的分子。除C端有小段氨基酸相同外，两者的基因序列和蛋白结构并无相同之处。进一步的研究发现，在G蛋白的C端有3处氨基酸序列相同的结构与IgG结合有关。此外，通过计算蛋白G与IgG反应的平衡常数并与SPA比较，结果蛋白G对多数IgG的亲和常熟较SPA高，表明蛋白G的结合力比SPA强。

对蛋白G与IgG结合谱的研究发现，蛋白G对不同种属的IgG结合力与SPA有明显不同，详见表1。

表1.免疫球蛋白与Protein A和Protein G的结合力

注：

W＝weak binding

S＝strong binding

NB＝no binding

目前已有关于将蛋白A和蛋白G串联表达的报道(chimeric receptorcontaining one IgG bingding domain of both protein A and protein G)，但我们按照大肠杆菌对密码子的偏爱，优化重组蛋白A/G的基因序列，以有利于其在大肠杆菌中的高效表达；同时，本发明去除A/G中与IgG结合无关的蛋白序列，将蛋白A的B结构域与蛋白G的IgG结合功能区序列进行串联表达，使这种新型重组蛋白A可结合更多种属哺乳动物的免疫球蛋白IgG。此外，我们在重组蛋白的N端设计由6个组氨酸组成的his标签，以便于通过亲和层析的方法快速高效获得蛋白纯品。

发明内容：

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种新的重组蛋白A/G的基因序列，以克服现有技术的不足。

本发明需要解决的技术问题之二是提供该重组蛋白A/G的氨基酸序列，以克服现有技术的不足。

本发明需要解决的技术问题之三是提供含有该重组蛋白A/G基因的载体。

本发明需要解决的技术问题之四是提供被含有重组蛋白A/G基因的表达载体转化宿主细胞。

本发明需要解决的技术问题之五是提供该重组蛋白A/G的制备方法。

本发明需要解决的技术问题之六是提供该重组蛋白A/G的用途。

本发明需要解决的技术问题之七是提供一种由该重组蛋白A/G和层析介质载体组成的亲和层析介质。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的重组蛋白A/G基因是以1个人工合成的重组蛋白A基因B结构域和蛋白G的IgG结合功能区(基因序列根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行了优化)串联而成，重组蛋白A和蛋白G间以AccI酶切位点相连，其中重组蛋白A/G基因N端引入与表达载体pBV220一致的EcoRI酶切位点及6个His标签，C端加入终止密码子TAA及与表达载体一致的BamHI酶切位点。该基因由420个核苷酸组成，编码139个氨基酸。该基因序列及编码的氨基酸序列见序列表SEQ No.1和SEQ No.2。

本发明还构建了含有上述重组蛋白A/G基因的重组表达载体，构建方法是将构建的重组蛋白A/G基因用EcoRI和BamHI双酶切后连接到同样酶切的pBV220载体上，构建含串联重组蛋白A/G基因的表达载体。

本发明还提供了利用上述含大肠杆菌重组表达载体的大肠杆菌生产重组蛋白A/G的方法，该方法是将菌株进行发酵，高效表达重组蛋白A/G，再离心菌液收集菌体，超声破碎，取离心上清进行层析分离纯化，获得重组蛋白A/G产品。

本发明生产的重组蛋白A/G为可溶性表达，且具有表达量高(占细菌可溶性蛋白总量的40％以上)、表达时间短(仅数小时)、易于纯化、成本低等优点，有利于基因工程重组蛋白A/G的产业化生产。

本发明的重组蛋白A/G基因的表达产物重组蛋白A/G用于与琼脂糖凝胶等层析介质载体偶联制备亲和层析填料用于抗体(药物)的分离纯化。

本发明生产的重组蛋白A/G具有IgG结合范围广、活性强、纯度及产量高等优点。

本发明生产的重组蛋白A/G亲和填料具有IgG载量高、结合特异性强等优点。

附图说明

图1是本发明构建的重组表达载体pBV220-A/G的PCR鉴定结果。其中泳道1是DNA Marker DL2000，泳道2-3是PCR鉴定的克隆子。

图2重组蛋白A/G表达的SDS-PAGE鉴定电泳图。其中泳道1是低分子蛋白marker(分子量由低到高分别为14.4、20.1、31、43、66.2、97.4kDa)；泳道2-3是经诱导的DH5a/pBV220-A/G菌体超声破菌后的离心上清。

图3重组蛋白A/G纯化的SDS-PAGE鉴定电泳图。泳道1是低分子蛋白marker(分子量由低到高分别为14.4、20.1、31、43、66.2、97.4kDa)；泳道2是经镍螯合亲和层析和阴离子交换层析纯化的重组蛋白A。

图4是重组蛋白A/G琼脂糖凝胶6B分离马血清中的IgG的分离纯化色谱图。

图5是重组蛋白A/G琼脂糖凝胶6B分离猪血清中的IgG的分离纯化色谱图。

图6是纯化IgG的SDS-PAGE电泳鉴定图，其中泳道1：低分子量marker；泳道2：马血清纯化IgG；泳道3：猪血清纯化IgG。

具体实施方式

实施例1重组蛋白A/G基因的合成

为促进金黄色葡萄球菌蛋白A基因在大肠杆菌中的表达，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，优化蛋白A及蛋白G的IgG结合结构域基因中某些碱基序列(有多种优化方案，序列表SEQ No.1为其中一种优化后序列)，通过化学合成的方法，设计合成重组蛋白A/G基因序列，其序列长度为434bp，两端分别是EcoRI和BamHI酶切位点，用于与表达载体的连接。此外，还包括起始密码子ATG，终止密码子TAA及5’端6×His标签序列。

实施例2有重组蛋白A/G的pBV220-A/G表达载体的构建

将原核表达V220载体及重组蛋白A/G基因分别以EcoRI和BamHI酶切，连接，构建重组表达载体pBV220-A/G。

实施例3pBV220-A/G表达载体转化大肠杆菌

pBV220-A/G用CaCl₂法转化E.coli DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经PCR及测序鉴定获得含有pBV220-A/G的克隆子。结果如说明书附图图1示。

实施例4用工程菌E.coli DH5α/pBV220-A/G生产重组蛋白A

1)菌种的培养发酵

按1∶50将大肠杆菌工程菌E.coli DH5α/pBV220-A/G接种于新鲜LB培养基中，30℃培养过夜；次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1∶20接种至发酵培养基中，30℃培养至OD600达到0.5-0.8时，升温至42℃诱导，诱导4h后离心收菌。蛋白表达鉴定结果如说明书附图图2所示。

2)表达产物的纯化

取发酵诱导菌用PBS洗涤3次，溶解，超声破碎，4℃离心，收集上清，用0.45μm滤器过滤，适当稀释后，用金属螯合镍琼脂糖凝胶亲和层析柱进行纯化，收集洗脱峰，再将洗脱液进行阴离子交换层析纯化，其纯度可达95％以上。结果如说明书附图图3示。

实施例5重组蛋白A/G琼脂糖凝胶6B的制备

1)凝胶的活化

5g凝胶、5ml环氧氯丙烷和7.5ml 0.8M NaOH(含15mg NaBH4)、2ml二氧六环混合，40℃作用6h(160转/分)。

反应结束，用蒸馏水冲洗。

2)活化胶与蛋白A偶联

取活化胶2g与20mg proA-6D(蛋白A溶于0.5M Na2CO3-NaHCO3buffer，2ml)混合，在20℃作用21-24h(160转/分)。

充分洗胶(0.5M Na2CO3 buffer)。

3)反应停止，回收未反应的蛋白A，用碳酸钠缓冲液(含0.2M乙醇胺)3ml封闭未反应活性基团，20度封闭过夜(160转/分)。

4.用0.1M醋酸钠缓冲液(pH4.0)和0.1M Tris缓冲液(pH8.0)交替洗涤3次。5.用蒸馏水充分洗涤后置于20％乙醇中4℃保存。

实施例6重组蛋白A/G琼脂糖凝胶6B从马血清(IgG易与蛋白A结合，不易与蛋白G结合)和猪血清(IgG不易与蛋白A结合，易与蛋白G结合)中分离纯化IgG

1)重组蛋白A/G琼脂糖凝胶6B装柱1ml。

2)用缓冲液A洗5～10个柱床体积平衡柱子，流速为1ml/min。

3)将兔血清用缓冲液A稀释10倍，0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min。

4)用缓冲液A再洗5～10个柱床体积，流速为1ml/min。

5)用缓冲液B洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，立即用中和缓冲液中和到中性。

5)用纯水洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃保存。

6)将分离纯化的IgG样品进行SDS-PAGE电泳分析。

缓冲液组成：

缓冲液A：20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4。配制：0.2M NaH2PO4 19ml，0.2MNa2HPO4 81ml，NaCl 9g加水至1000ml。

缓冲液B：20mM柠檬酸缓冲液，pH4.0。配制：柠檬酸2.1g加水950ml，用5M NaOH调至pH4.0，加水至1000ml。

结果：

分离纯化色谱图见图4和图5；其中图4是马血清IgG纯化色谱图，图5是猪血清IgG纯化色谱图。峰1为流穿峰，峰2为洗脱峰。

SDS-PAGE电泳分析结果见图6，泳道1为低分子量蛋白marker，泳道2为马血清纯化IgG，泳道3为猪血清纯化IgG，其上下两条带分别是IgG的重链和轻链。实验结果表明，用本发明的重组蛋白A/G琼脂糖凝胶6B亲和层析介质经一步纯化就可以得到纯度大于95％的IgG，用BCA法测洗脱马和猪IgG量分别为15mg和12mg，这表明重组蛋白A/G琼脂糖凝胶6B对马和猪IgG均能很好地结合。

Claims (6)

1.一种重组融合蛋白A/G的基因表达序列，其特征是：

1)其序列根据宿主菌大肠杆菌密码子的特点进行了优化；

2)包含1个重组蛋白A的B结构域和1个重组蛋白G的IgG结合功能区；

3)N端包含his标签序列。

2.根据权利要求1，所述的重组蛋白A/G基因序列为SEQ No1。

3.根据权利要求1，所述的重组蛋白A/G的氨基酸序列为SEQ No2。

4.根据权利要求1，所述的重组蛋白A/G基因表达载体为原核表达载体，其特征为所述表达载体优先为pBV220。

5.一种重组蛋白A/G亲和填料，其特征是以琼脂糖凝胶为基质，采用环氧活化基质，将所述的重组蛋白A/G配基以共价键的方式固定在载体表面，从而合成了蛋白A/G亲和填料。

6.根据权利要求5，所述的重组蛋白A/G亲和填料可以用于多种不同种属哺乳动物IgG抗体的分离纯化。

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