CN101921818A

CN101921818A - 一种生产重组蛋白a的方法

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Publication number: CN101921818A
Application number: CN 201010227290
Authority: CN
Inventors: 贾凌云; 林雪; 侯率; 张嘉玉; 任军; 谢键
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-07-15
Also published as: CN101921818B

Abstract

本发明涉及一种生产重组蛋白A的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了利用一种基因工程菌进行高密度发酵表达重组蛋白A的工艺条件，以及利用以IgG的Fc片段为亲和配基的亲和层析一步法高纯度分离纯化重组蛋白A的方法。应用以上方法生产重组蛋白A，高密度发酵的重组菌体培养密度达到OD_600nm＝80-100，菌体干重40-50g/L，蛋白A表达量占菌体总蛋白的30-50％，每升菌液生产的蛋白A量最高达3g，SDS-PAGE及HPLC检测蛋白A纯度达95％以上。该方法具有生产量大，成本低，产品质量高等优点，为重组蛋白A的制备提供了一条切实可行的途径。

Description

一种生产重组蛋白A的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及到一种基因工程菌的高密度发酵和蛋白质的分离纯化方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus Protein A，SPA)是某些种类的金黄色葡萄球菌的细胞壁结合蛋白，该蛋白是由丹麦科学家Klaus Jensen于上个世纪五十年代研究金黄色葡萄球菌细胞壁结构时发现的。其基本结构由以下三部分构成，即信号肽，抗体结合功能区和细胞壁结合区。蛋白A的抗体结合功能区包含E、D、A、B、C五个同源单结构域，每个单结构域都能与免疫球蛋白G(IgG)单独作用。该蛋白对IgG的结合主要是基于对IgG的Fc区特异性的结合能力。正是因为蛋白A与人类和其他哺乳动物的多种免疫球蛋白具有特异性结合能力，因此被广泛用作免疫学试剂(与多种报告分子偶联后用于组织化学、Western、EL ISA等的抗体检测)；与固相载体相连，用于抗体的分离纯化；临床上用于治疗抗体相关性疾病的血液净化吸附剂等。

由于蛋白A的用途广泛，因此有很大的市场需求量。蛋白A在研究之初是从金黄色葡萄球菌中直接提取的天然蛋白，该种获取蛋白A的方法存在着很多弊端。首先，蛋白A只占金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白的6.7％，并且该蛋白为细胞壁结合蛋白，通过胞壁肽聚糖以共价键与细胞壁结合，分离纯化过程需要通过酶解消化使蛋白A与细胞壁分离，造成了蛋白A提取的复杂性增高；其次，金黄色葡萄球菌为致病菌，大规模生产危险性较大，而且蛋白A广泛用于抗体类药物的制备和血液净化，如果分离纯化过程中产生病原菌物质的残留，则会在人体内产生严重的免疫反应。因此近年来，人们开始转向采用基因工程的方法来生产重组蛋白A，寻求大规模生产蛋白A安全有效的方法。

迄今，与蛋白A相关的专利主要涉及到基因工程菌的构建方法及重组蛋白A的分离纯化。在蛋白A基因工程菌的构建中，涉及表达蛋白A的基因序列、所用载体和宿主细胞。美国Repligen公司于1982年申请了关于重组蛋白A的专利(US 5151350)，采用金黄色葡萄球菌蛋白A的原序列，将其构建到载体pAc 37中，表达宿主采用的是E.coli MS371。其后，该公司又申报了名为“Nucleic acids encoding recombinant protein A”的专利(US 7691608)，涉及到带有一部分细胞壁结合域(X)和全部功能区的重组蛋白A的基因工程菌的构建。目前国内申报重组蛋白A制备的专利有6项，主要特点是：均采用了蛋白A单结构域反复串联的方式进行蛋白A功能基因的构建和表达，主要采用三个(CN 1432578A，CN 1524957A，CN 101050464A)、四个(CN101298476A)、五个(CN 101298475A)、六个(CN101337986A)单结构域串联的方式进行蛋白A的功能基因构建。

重组蛋白A分离纯化方法是获得重组蛋白A产品的关键环节，目前报道的分离纯化方法主要有：(a)一步法。即通过一步凝胶筛分(CN 1432578A，CN 1524957A等)或一步镍离子螯合层析(CN 101050464A)获得目标产物；(b)多步法。包括采用亲和层析——阴离子交换层析两步法(US 5075423A)和热处理——离子交换层析——乙醇沉淀三步法(US 5314993A)。

一步法虽然简单易行，但凝胶筛分存在处理量小(一般仅为凝胶填料体积的1％-2％)且速度慢、产品纯度不高等缺陷；镍离子螯合层析纯化的前提是在重组蛋白A的基因构建中加入6-8个组氨酸标签，在一步镍离子螯合层析分离后，若不加入特定的酶来切除组氨酸标签，该标签的存在有可能会带来非特异性吸附或影响蛋白A的活性。

在多步法中，热处理可一次将蛋白A的纯度提高到70％以上，是一种简单有效的蛋白A初分离方法，但该法存在的主要问题是蛋白A的活性损失较大，该步的回收率一般只能达到75％，再经过离子交换层析、乙醇沉淀两步分离，最后的蛋白A回收仅在50％左右。与该分离纯化方法相比，亲和层析——阴离子交换层析两步法在提高活性回收率上有明显的优势，亲和层析一步操作即可使蛋白A纯度达到95％以上，活性回收率达到90％以上，阴离子交换层析仅是为了去除其中脱落的IgG等痕量杂蛋白。亲和层析虽然纯化效率高，但由于采用的配基是大分子的IgG，造成亲和层析柱对重组蛋白A的动态载量较低(2-5mg/mL)，且IgG分子存在着不稳定的铰链区，在酸性洗脱条件下，易发生配基脱落等问题，使得以IgG为配基的层析柱使用寿命缩短，生产成本增高。

上述已公开的专利，或侧重基因序列和蛋白序列的保护，或单纯提出一种蛋白A的分离纯化方法，均未涉及重组蛋白A规模化生产技术和生产方法。特别是针对重组蛋白A的高密度发酵技术，做为规模化生产的关键环节，更是未见报道。高密度发酵的目的是提高单位空间内的细胞数量和目标产物的浓度，以提高生产强度，降低成本。目前，利用基因工程菌的高密度发酵生产重组蛋白已成为研究的热点。例如，姜伟等(CN 101139570A)利用YTL培养基生产HPV L1蛋白，发酵过程中控制发酵参数为：温度25-37℃，pH6.5-7.5，转速400-600rpm，通入的空气/氧气＝1∶1-1∶10.，OD_600nm＝2-4时开始补料，流加速度是25-400ml/h，诱导剂选用浓度为10-30g/L的乳糖。黄阳滨等(CN 101139623A)利用改良M9-4培养基生产重组人卵巢癌抗独特型微抗体，控制操作条件为：温度37℃，pH6.8-7.2，溶解氧＞50％，OD_600nm＝1-2时用1mM的IPTG诱导，诱导时间为3h，通过以上优化的发酵工艺，每升菌液可表达700mg以上的重组蛋白。而林枫等(CN 1687443A)利用温度诱导的表达系统生产重组人心肽(rhANP)，控制发酵条件为：细胞增殖阶段的温度28-32℃，pH6.9-7.1，诱导表达阶段的温度为41-43℃，pH7.1-7.3，通气量0.5-1.5VVM，维持发酵液中的甘油浓度在1.0-3.0g/L，所产生的重组蛋白以包涵体的形式存在。由此可见，由于目标蛋白的种类，所选用的质粒载体和宿主菌存在差异，基因工程菌的高密度发酵条件有很大不同。而针对生产某一种重组蛋白的表达系统而言，优化的高密度发酵方法需要经过大量的实验摸索获得。

本发明中所采用的表达重组蛋白A的基因工程菌是将蛋白A抗体结合功能区基因序列与pET表达载体相连，并转化感受态E.coli BL21(DE3)而获得。针对蛋白A市场需求量大、缺乏低成本、高质量的规模化生产技术的现状，我们提出一种新的规模化生产重组蛋白A的方法，包括基因工程菌株的高密度培养工艺及重组蛋白A的分离纯化方法。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供了一种产量大，纯度高，成本低的重组蛋白A大规模生产方法，包括利用基因工程菌高密度发酵生产重组蛋白A的方法。

本发明的技术方案是：

1、基因工程菌的高密度发酵

考察发酵过程中各种因素对菌体生长和重组蛋白A表达的影响，包括：培养基组分，接菌量，培养温度，pH，可溶性氧含量，补料方式，诱导方式等。本发明中采用补料分批发酵的培养方式，通过指数流加的补料策略实现了基因工程菌株的高密度发酵。培养基中的碳源可以选用葡萄糖或甘油，当基本培养基中的碳源消耗超过95％时，开始采用指数流加的方式进行补料，使菌体的比生长速率维持在0.05-0.2/小时，指数流加的速率采用已知的指数流加方程计算。本发明中，重组蛋白A的表达由T7启动子控制，T7启动子可由诱导剂激活。本发明中的诱导剂可以选用IPTG或乳糖。IPTG的加入方式为：当菌体OD_600nm达到50-70时一次性加入，终浓度为0.2-1mM；乳糖的加入方式为：当菌体OD_600nm达到40-60时开始流加，维持发酵液中乳糖浓度在0.2-1g/L；诱导过程持续6-10小时。

2、重组蛋白A的分离纯化

为克服以IgG为配基的亲和层析填料动态吸附载量较低，配基易脱落，使用寿命短的缺点，本发明中利用以IgG的Fc片段为配基的亲和层析填料分离纯化重组蛋白A。

以IgG的Fc片段为配基的亲和层析填料合成方法如下：采用木瓜蛋白酶酶解IgG，使其分解为Fc片段和Fab片段，通过以蛋白A为配基的亲和层析柱分离纯化Fc片段；采用高碘酸钠氧化Fc片段糖侧链，利用反应后得到的醛基实现Fc片段的定向固定化；采用琼脂糖凝胶为基质，以羰基二咪唑活化，通过双功能团间隔臂分子将氧化后的Fc片段固定，合成了特异性结合重组蛋白A的亲和层析填料。

本发明中的重组蛋白A几乎都为可溶性表达，将菌体溶于裂解液中破碎，离心获取上清液，便可直接进行亲和纯化。获得的重组蛋白A纯度利用SDS-PAGE和HPLC检测。

利用环氧接臂的方式，将上述纯化的重组蛋白A偶联到Sepharose CL 6B上。具体方法如专利CN 1367181A所述，偶联的蛋白A配基密度为5-15mg/mL胶。考察以重组蛋白A为配基的吸附材料在血清体系中的抗体吸附效果。

本发明的有益效果如下：1、考察了各个影响因素对基因工程菌株高密度发酵和重组蛋白A表达的影响，建立了重组蛋白A表达菌株的高密度发酵工艺。利用以上工艺进行发酵，菌体培养密度达到OD_600nm＝80-100，菌体干重40-50g/L，蛋白A表达量占菌体总蛋白的30-50％。2、分离纯化重组蛋白A利用了以IgG的Fc片段为配基的亲和层析填料，吸附量可达10-20mg/mL，即保持了亲和层析纯化产品纯度高的优势，又克服了以IgG为配基的亲和填料吸附量低(2-5mg/mL胶)，配基不稳定，操作过程中容易发生变性、脱落，造成重复利用效果差等问题。以上重组蛋白A的生产工艺易于放大，产量高(每升菌液生产的蛋白A量最高达3g)，生产成本低，产品纯度高(＞95％)，性能稳定，与抗体的结合活性高，可用于工业规模的蛋白A生产。

附图说明

附图1为高密度发酵过程中的全菌体SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中泳道1为低分子量蛋白marker，泳道2为诱导前，泳道3-5分别为诱导后3小时、6小时和8小时。

附图2为菌体的SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中泳道1为低分子量蛋白marker，泳道2为诱导后的全菌，泳道3为诱导后菌体破碎后的上清。

附图3为纯化后SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中泳道1为低分子量蛋白marker，泳道2为纯化后的重组蛋白A。

具体实施方式

以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。

实施例1：

1、基因工程菌的摇瓶培养

将上述表达蛋白A的基因工程菌接种于20mL LB液体培养基中，于恒温摇床中37℃，200rpm培养过夜。按1％接种量将活化后的菌种接种于100mL LB液体培养基中。37℃，200rpm培养3-4小时，待菌体OD_600nm达到0.5-1时加入IPTG至0.2mM或加入乳糖至1g/L，再继续培养5-7小时。SDS-PAGE检测，确认有重组蛋白A表达。

2、重组蛋白A的高密度发酵表达

(1)发酵培养基的配置

将葡萄糖(或甘油)、蛋白胨、酵母提取物、无机盐、微量元素分别灭菌后，配置成终浓度如下的基本培养基：10-20g/L蛋白胨，5-10g/L酵母提取物，20-50mM Na₂HPO₄，20-50mM KH₂PO₄，20-50mM NH₄Cl，2-5mMMgSO₄，微量元素成分如下：FeSO₄，MnCl₂，ZnSO₄，NiCl₂，CaCl₂，浓度均为1-10μM，发酵用消泡剂加入适量(约0.1mL/L)，碳源为葡萄糖(或甘油)，其浓度为10-20g/L；补料培养基组成为：200-500g/L葡萄糖(或甘油)；50-100g/L酵母提取物。

(2)种子活化

将以上基因工程在含有氨苄青霉素的固体LB培养基上活化，即37℃条件下于固体LB平板上划线培养24小时，然后挑单菌落到20mL LB液体培养基上，在37℃，200rpm摇瓶培养10-12小时。

(3)利用IPTG作为诱导剂的高密度发酵

采用5L的发酵罐，基本培养基的装液量为2L。将活化后的种子按0.5-5％的量接种于发酵罐中，设置发酵参数：发酵过程在温度33-37℃和pH 7-7.4的条件下进行，pH控制采用浓盐酸和氨水自动流加调节。控制搅拌速度和通气量，保持水溶性氧＞20％。当基本培养基中的碳源消耗了95％以上时，开始按照指数流加的方式进行补料，使发酵罐中菌体的比生长速率维持在0.05-0.2/小时。当菌体OD_600nm达到50-70时，加入IPTG至终浓度0.2-1.0mM，继续培养6-10小时，发酵过程结束。

(4)利用乳糖作为诱导剂的高密度发酵

采用5L的发酵罐，基本培养基的装液量为2L。将活化后的种子按0.5-5％的量接种于发酵罐中。设置发酵参数：发酵培养在温度33-37℃和pH 7-7.4的条件下进行，pH控制采用浓盐酸和氨水自动流加调节。控制搅拌速度和通气量，保持水溶性氧＞20％。当基本培养基中的碳源消耗了95％以上时，开始按照指数流加的方式进行补料，使发酵罐中菌体的比生长速率维持在0.05-0.2/小时。当菌体OD_600nm达到40-60时，开始流加乳糖，并保持发酵液中乳糖浓度在0.2-1g/L，继续培养6-10小时，发酵过程结束。

应用以上高密度发酵技术，菌体培养密度达到OD_600nm＝80-100，菌体干重40-50g/L，蛋白A表达量占菌体总蛋白的30-50％。

3、以IgG的Fc片段为配基亲和层析填料的合成

(1)木瓜蛋白酶酶解IgG

以10mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液溶解木瓜蛋白酶，过滤。加入激活剂半胱氨酸和螯合剂EDTA，使其终浓度分别达到0.02mol/L和0.01mol/L，加入IgG使其浓度为0.5-10mg/ml，调节pH值于6-7之间。40℃水浴反应3-6小时。最后加入终止剂碘乙酰胺至0.03mol/L。

(2)利用蛋白A亲和层析柱纯化Fc片段

取以蛋白A为配基的亲和层析填料装柱，用平衡缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4)平衡柱子，检测280nm吸光度，直到基线平衡为止。将上述所得的酶解液缓慢过柱，接着用平衡缓冲液洗柱，直到吸光度回到基线并稳定为止，再改用双蒸水冲洗，以洗去因疏水作用而非特异吸附的杂蛋白，最后使用洗脱缓冲液(100mM柠檬酸缓冲液，pH 2.3)洗脱，收集洗脱峰，并立中和至中性。

(3)Fc片段的定向固定化

Fc片段的氧化反应：将述洗脱液进行透析除盐并浓缩，转入铝箔纸包裹的锥形瓶中，加入高碘酸钠至终浓度为2-10mg/ml，轻微摇晃，室温避光反应20-40min后快速透析除去高碘酸钠以终止反应。

羰基二咪唑(CDI)法活化琼脂糖凝胶：取5ml Sepharose CL-4B凝胶，用蒸馏水反复冲洗，以去除其中的防腐剂等。称取0.5g羰基二咪唑(CDI)溶解于10ml丙酮中。将洗净的凝胶加入上述CDI丙酮溶液中，30℃、150rpm，恒温摇床反应1小时。反应后的凝胶用丙酮冲洗3-4次。

间隔臂的连接：10ml无水丙酮中加入2ml的乙二胺，1，6-己二胺或DADPA，再加入已经活化的凝胶，30℃、150rpm，恒温摇床反应2h。用蒸馏水冲洗反应后的凝胶3-4次。

Fc片段的固定：取上述反应后的凝胶，加入等体积的150mM pH 8.2的硼酸缓冲液，加入氧化后的Fc片段，30℃、150rpm，恒温摇床反应3小时。反应后的凝胶用蒸馏水冲洗3-4次，放入乙醇胺溶液中30℃，150rpm恒温摇床中封闭过夜。最后加入硼氢化钠还原至凝胶变为白色，还原后的凝胶用蒸馏水冲洗3-4次，放入含有0.02％的叠氮钠溶液中，4℃保存待用。

4、重组蛋白A的分离纯化

(1)将上述发酵液4000rpm离心15min，去掉上清培养基，将菌体溶于5倍体积的Tris-NaCl裂解液(25-50mM Tris，50-200mM NaCl，pH 8.0)中超声破碎。将破碎后的菌液10000rpm离心20min，获取上清液。

(2)取以IgG的Fc片段为配基的亲和填料装柱，用平衡缓冲液(10-100mM磷酸盐缓冲液，含0.4-1.0M NaCl，pH 7.4)平衡，检测210nm吸光度，直到基线平衡为止。将上述处理后的蛋白上清液缓慢过柱，接着用平衡缓冲液洗柱，直到210nm吸光度回到基线并稳定为止，再用洗脱缓冲液(50-200mM柠檬酸缓冲液，pH 2.3)洗脱蛋白，收集洗脱峰。

按照上述方法最终获得的重组蛋白A利用SDS-PAGE和HPLC检测产物纯度达95％以上。

5、以重组蛋白A为配基的吸附剂，对人血清中抗体的吸附效果评价

利用环氧接臂的方式，将上述纯化的重组蛋白A偶联到Sepharose CL 6B上。具体方法如专利CN 1367181A所述，偶联密度为5-10mg/mL。评价方法为血清动态上柱，血清上样量为胶∶血＝1∶5(v/v)。以Sepharose CL 6B作为空白对照，抗体浓度采用免疫生化分析仪：SIEMENS：BN ProSpec(德国)测定，总蛋白浓度采用生化分析仪：HITACHI 7600-020(日本)测定。分别检测血清原液和流穿液中的抗体浓度，用差量法计算各种抗体和总蛋白吸附量，结果如表1所示。

表1以重组蛋白A为配基的吸附剂对人血清中抗体的吸附效果

检测指标	IgG	IgM	IgA	总蛋白
					吸附量(mg/mL胶)	27.75	0.98	0.73	30.12

Claims

1.一种生产重组蛋白A的方法，包括表达蛋白A基因工程菌的高密度发酵及重组蛋白A的分离纯化方法；其特征在于如下步骤：

第一步，基因工程菌的高密度发酵；

本发明中所使用的基因工程菌，是将蛋白A完整的IgG结合功能区基因连接入pET表达载体中，再将上述重组质粒转入感受态E.coli BL21(DE3)中；

采用补料分批发酵的培养方式，利用指数流加的补料方法实现表达重组蛋白A基因工程菌株的高密度发酵；发酵培养基中的碳源选用葡萄糖或甘油，诱导重组蛋白A表达的诱导剂选用IPTG或乳糖；

第二步，重组蛋白A的分离纯化；

利用以IgG的Fc片段为配基的亲和层析填料分离纯化重组蛋白A；

(1)IgG的Fc片段的获取：采用木瓜蛋白酶酶解IgG，使其分解为Fc片段和Fab片段，通过以重组蛋白A为配基的亲和层析柱分离纯化Fc片段；

(2)以IgG的Fc片段为配基的亲和层析填料的合成：采用高碘酸钠氧化Fc片段糖侧链，利用反应后得到的醛基实现Fc片段的定向固定化；采用琼脂糖凝胶为基质，以羰基二咪唑活化，通过双功能团间隔臂分子将氧化后的Fc片段固定，合成了特异性结合重组蛋白A的亲和层析填料；

(3)利用以上合成的亲和层析填料分离纯化重组蛋白A。

2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白A的生产方法，其特征还在于，所述的基因工程菌的高密度发酵条件如下：

基因工程菌株的高密度发酵的基本培养基组成为：10-20g/L蛋白胨，5-10g/L酵母提取物，20-50mM Na₂HPO₄，20-50mM KH₂PO₄，20-50mM NH₄Cl，2-5mM MgSO₄；微量元素成分如下：FeSO₄、MnCl₂、ZnSO₄、NiCl₂、CaCl₂，浓度均为1-10μM；发酵用消泡剂加入适量(约0.1mL/L)，碳源为葡萄糖或甘油，其浓度为10-20g/L；

补料培养基组成为：200-500g/L葡萄糖或甘油，50-100g/L酵母提取物；

采用补料分批发酵，在基本培养基的碳源消耗了95％以上时，采用指数流加的补料方式保证菌体的比生长速率维持在0.05-0.2/小时；

补料分批发酵的操作条件为：接种量为0.5-5％(v/v)，发酵过程中的pH采用氨水和浓盐酸自动补加的方式控制在7-7.5，发酵温度33-37℃，通过搅拌速率和通气量控制溶解氧＞20％；

重组蛋白A的诱导表达采用IPTG或乳糖为诱导剂，IPTG的加入方式为：当菌体OD_600nm达到50-70时一次性加入，终浓度为0.2-1mM；乳糖的加入方式为：当菌体OD_600nm达到40-60时开始流加，维持发酵液中乳糖浓度在0.2-1g/L。