CN107344970B - 一种重组融合蛋白v12‑cd137l的制备方法及应用 - Google Patents

一种重组融合蛋白v12‑cd137l的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，特别是用于重组蛋白促进淋巴细胞体外培养的一种重组融合蛋白V12‑CD137L的制备方法及应用。本发明为人工设计一种重组融合蛋白V12‑CD137L，该蛋白由艾滋病病毒gp120中的V1V2区与CD137L的功能区结合而成，兼具靶向定位淋巴细胞的功能和CD137L蛋白功能；V12‑CD137L通过大肠杆菌表达，层析柱分离、纯化，最终得到高纯度、高活性的重组蛋白。该重组蛋白可以有效提高淋巴细胞在体外的增殖，分化水平，同时还可以增强机体的细胞免疫水平，并通过大肠杆菌表达，大大提高了制备效率，有利于工业化生产。

Description

一种重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是用于重组蛋白促进淋巴细胞体外培养的一种重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法及应用。
背景技术
CD137L蛋白属肿瘤坏死因子超家族成员(TNFSF9)，其一级结构有254个氨基酸残基,其中0-25位氨基酸残基为胞质区,26-48位氨基酸残基为连接段,是疏水区域，可形成跨膜区,其余部分为胞外段的功能区，CD137L主要表达于活化的T细胞和B细胞，为淋巴细胞协同刺激因子，与其受体4-1BB结合，可启动双向信号转导：正向信号可刺激T细胞活化和增殖；反向信号可刺激B细胞增殖。因此，CD137L可以有效促进淋巴细胞的活化、增殖、分化，进而增强体内淋巴细胞免疫应答。许多研究表明，CD137L可以作为肿瘤相关抗原（TAA）的免疫增强剂。
为了大量获得CD137L，重组蛋白表达系统（原核/真核）是一种有效、可行的技术手段。但是，天然的4-1BBL蛋白在体内以三聚体的形式存在，呈三叶螺旋桨结构，而通过表达系统表达获得的蛋白，受蛋白结构以及与细胞表面分子的亲和力等因素的影响，往往使得表达的CD137L蛋白生物活性较低、甚至不具有生物活性，从而给CD137L蛋白的人工制备带来了极大的挑战。因此，研究一种有效方法来提高CD137L的生物学功能，具有极大的医学意义和应用价值。通过改造CD137L蛋白结构，提高其与淋巴细胞的亲和力，有可能提高CD137L体外表达重组蛋白的生物活性。
发明内容
本发明的目的是通过基因工程技术人工设计一种重组融合蛋白V12-CD137L，并提供其制备方法及应用。该重组蛋白可以有效提高淋巴细胞在体外的增殖，分化水平，同时还可以增强机体的细胞免疫水平，并通过大肠杆菌表达，提高制备效率，有利于工业化生产。
本发明是将艾滋病病毒gp120蛋白中的与淋巴细胞具有亲和功能的V1V2区与CD137L的功能区结合，形成一种新的重组融合蛋白,命名为V12-CD137L，V12-CD137L蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其中第1-76位为艾滋病病毒 gp120中的V1V2区，第77-283位为CD137L的功能区。V12-CD137L重组融合蛋白可以将CD137L蛋白的功能区靶向定位到淋巴细胞上，有效提高CD137L的生物活性，促进淋巴细胞的体外增殖，增强细胞免疫水平。
本发明为人工设计一种重组融合蛋白V12-CD137L，该蛋白由艾滋病病毒gp120中的V1V2区与CD137L的功能区结合而成，兼具靶向定位淋巴细胞的功能和CD137L蛋白功能。V12-CD137L通过大肠杆菌表达，层析柱分离、纯化，最终得到高纯度、高活性的重组蛋白。该重组蛋白促进淋巴细胞在体外培养的增殖水平，且效果优于单纯的CD137L重组蛋白，同时该重组融合蛋白还能增强体内的细胞免疫水平。
本发明所述重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法为：以SEQ ID NO.1所述氨基酸序列为模板，设计经过密码子优化的能够表达V12-CD137L蛋白的基因序列并在基因的5’端引入组氨酸标签序列，最终得到表达基因SEQ ID NO.2，所得SEQ ID NO.2基因序列插入表达系统中，通过表达得到重组的V12-CD137L融合蛋白。
本发明涉及一种重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法及应用，所述重组融合蛋白V12-CD137L是由艾滋病病毒gp120蛋白中的与淋巴细胞具有亲和功能的V1V2区与CD137L的功能区结合而成，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，表达重组融合蛋白V12-CD137L的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；SEQ ID NO.2基因序列通过以下步骤得到V12-CD137L重组融合蛋白；
本发明所述重组融合蛋白V12-CD137L具体步骤如下：
(1) 人工合成SEQ ID NO.2基因，将融合基因插入大肠杆菌表达系统，获得表达V12-CD137L重组蛋白的重组大肠杆菌；
(2) 将步骤(1)所得重组大肠杆菌进行37℃培养，20-25℃诱导其表达重组蛋白V12-CD137L，获得诱导后的重组大肠杆菌；
(3) 将步骤(2)所得诱导后的重组大肠杆菌进行细胞破碎，通过离心获得重组大肠杆菌破碎上清液；
(4) 将步骤(3)所得重组大肠杆菌破碎上清液通过层析柱进行分离纯化，得到V12-CD137L重组蛋白纯化液；
(5) 将步骤(4)所得V12-CD137L重组蛋白纯化液置于透析袋中，用透析液进行透析，获得稳定的V12-CD137L重组蛋白。
本发明所述SEQ ID NO.1氨基酸序列为：
MCTDLNTNNTTNTTELSIIVVWEQRGKGEMRNCSFNITTSIRDKVQREYALFYKLDVEPIDDNKNTTNNTKYRLINCLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
所述SEQ ID NO.2基因序列为：
Atgcatcaccatcatcaccactgtactgacctgaacaccaacaatactactaacaccactgaactgagcattattgttgtatgggagcagcgtggtaagggtgaaatgcgcaattgtagcttcaacattaccacctccattcgcgataaagtacagcgtgaatacgctctgttctacaaactggatgttgaaccaattgacgataacaagaacaccaccaacaacaccaaatatcgtctgattaactgtctggcgtgtccgtgggcagtgtccggtgctcgcgcttctccgggtagcgcagcatctccacgtctgcgtgaaggcccagaactgtctccggacgatccggcaggcctgctggatctgcgtcagggcatgttcgcgcaactggtggcacagaacgttctgctgattgatggcccactgtcctggtacagcgatccgggtctggcaggtgtttctctgactggtggcctgtcttacaaagaggacactaaggagctggtagtggcgaaagctggtgtatactacgtattcttccaactggagctgcgtcgtgtggttgctggcgaaggctctggtagcgtgtccctggcgctgcatctgcaaccgctgcgtagcgcagcgggtgcagcggctctggcgctgaccgtggatctgccaccggcatctagcgaggcacgtaacagcgctttcggtttccagggtcgtctgctgcacctgtctgccggtcagcgtctgggcgttcacctgcacaccgaggcacgtgcacgtcacgcttggcaactgactcagggtgcaactgtactgggcctgttccgtgtaactccggagattccggcaggtctgccgtctccgcgttccgaataactcgag
本发明所述氨基酸序列SEQ ID NO.1中，第1-76位为艾滋病病毒gp120中的V1V2区，第77-283位为CD137L的功能区，所得重组融合蛋白兼具靶向定位淋巴细胞的功能和CD137L蛋白功能。
本发明所述透析液配方为：甘氨酸1-3克，二硫苏糖醇0.1-0.3克，吐温200.5-1克加水溶解定容至1升，调节pH值至7.0-9.0。
本发明所述的V12-CD137L重组融合蛋白能促进淋巴细胞在体外培养的增殖水平，且效果优于单纯的CD137L重组蛋白。
本发明所述V12-CD137L重组融合蛋白能有效促进体内的细胞免疫水平。
本发明有益效果为：提供了一种改良的具有活化、促进淋巴细胞功能的
CD137L重组蛋白——V12-CD137L。该蛋白在CD137L蛋白的功能区的N端加上艾滋病病毒gp120蛋白中的V1V2区，使得CD137L蛋白可以靶向定位到淋巴细胞上，从而提高CD137L蛋白的生物活性。该重组蛋白可通过大肠杆菌表达，大大提高
了制备效率，有利于工业化生产。通过本发明所述方法制备的V12-CD137L重组蛋白能有效提高淋巴细胞在体外培养的增殖、分化水平，同时还可以增强机体的细胞免疫水平。
附图说明
图1.为V12-CD137L重组蛋白的表达纯化电泳图谱
M：蛋白分子量Marker；
1：诱导表达前；
2：诱导表达后；
3：诱导后破菌液；
4：破菌液上清；
5：柱层析上样；
6：柱层析流穿；
7：柱层析洗脱。
图2.为V12-CD137L重组蛋白纯化样品分析
M：蛋白分子量Marker；
1、2：纯化的V12-CD137L重组蛋白样品
图3. V12-CD137L蛋白对小鼠淋巴细胞培养的体外增殖作用
A：V12-CD137L蛋白5ug/ml处理淋巴细胞
B：V12-CD137L蛋白1ug/ml处理淋巴细胞
C: 单独CD137L蛋白重组5ug/ml处理淋巴细胞
D: 单独CD137L蛋白重组1ug/ml处理淋巴细胞
E: 透析缓冲液处理淋巴细胞
F：细胞空白组
图4. V12-CD137L蛋白对艾滋病病毒gp120蛋白小鼠体内免疫的增强作用（酶联斑点免疫法）
A: 单独的V12-CD137L蛋白免疫
B: 单独的艾滋病病毒gp120蛋白免疫
C: V12-CD137L蛋白和艾滋病病毒gp120蛋白共同免疫。
具体实施方式
以下实施例用来解释说明本发明，但不是限制本发明，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范
围。
实施例1 V12-CD137L重组蛋白的制备
(1)以SEQ ID NO.1所述氨基酸序列为模板，利用密码子兼并原则以及大肠杆菌对密码子的使用频率，设计出表达V12-CD137L重组蛋白的核苷酸序列，并在该核苷酸序列5’端引入组氨酸标签catcaccatcatcaccac，最终设计获得SEQ ID NO.2基因序列。通过人工基因合成技术合成SEQ ID NO.2基因序列，并通过NdeⅠ和XbaⅠ两个酶切位点将SEQ ID NO.2基因插入pET28a大肠杆菌表达质粒，得到重组质粒SEQ ID NO.2-pET28a。
(2)取含有大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞50微升的1.5毫升离心管一个，管置于冰上放置5分钟，加入10纳克SEQ ID NO.2-pET28a重组质粒，轻轻混匀，并于冰上孵育30分钟；将离心管置于42℃水浴锅中放置90秒，迅速取出置于冰上放置 5分钟；向离心管中加入900微升LB液体培养基，37℃震荡培养45分钟，取培养产物200微升涂布于直径10厘米的LB固体培养基平皿中，37℃培养过夜。最终得到表达SEQ ID NO.2基因序列的重组大肠杆菌单克隆菌落。
(3)挑取重组大肠杆菌单克隆菌落，置于100毫升LB液体培养基中，37℃培养过夜活化；将活化后的菌液按1：100的比例接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃下培养菌体OD600至0.6，然后加诱导剂（IPTG）至1毫摩尔/毫升进行诱导，诱导温度为20℃，连续诱导18小时，诱导前、诱导后样品取样进行电泳分析（见图1所示）。
(4) 8000转/分钟离心15分钟收集诱导表达后的菌落，弃上清，所得沉淀用破菌缓冲液以1：10的质量体积比（g/v）重悬，并用超音仪超声破菌，超声后菌液用离心机10000 转/分钟离心30分钟收集沉淀。
(5)将破菌离心后沉淀用平衡液溶解，15000 转/分钟离心30分钟收集上清。所得上清液用1毫升柱体积的镍离子亲和层析柱进行层析纯化，层析条件如下：先用10毫升破菌缓冲液平衡层析柱，然后取10毫升破菌离心上清液以1毫升/分钟的流速上样至层析柱中，再用10毫升破菌缓冲液平衡层析柱，最后用洗脱液洗脱得到V12-CD137L重组蛋白纯化液（图1所示）。
(6) 将所得V12-CD137L重组蛋白纯化液进行还原性蛋白电泳，结果显示（见图2所示）所得V12-CD137L重组蛋白单体分子量为32千道尔顿（kD）左右。
(7) 将所得V12-CD137L重组蛋白纯化液置于8000道尔顿透析袋中，用透析液进行透析，获得透析后的V12-CD137L重组蛋白。
(8) 透析后的V12-CD137L重组蛋白用细菌内毒素去除试剂去除内毒素，并用0.22微米过滤器过滤除菌，即得所需的V12-CD137L重组蛋白。
所用溶液如下：
LB液体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，加水溶解定容至1升。
LB固体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，琼脂粉15克，加水定容至1升。
破菌缓冲液：三羟甲基氨基甲烷2.4克,氯化钠29.22克，加水溶解定容至1升，调节pH值至8.0。
平衡液：甘氨酸1.5克,氯化钠29.22克，尿素480g，咪唑3.4克，加水溶解定容至1升，调节pH值至9.0。
洗脱液：甘氨酸1.5克,氯化钠29.22克，尿素480g，咪唑34克，加水溶解定容至1升，调节pH值至9.0。
透析液：甘氨酸1.5克，二硫苏糖醇0.15克，吐温20 0.6克加水溶解定容至1升，调节pH值至8.0。
实施例2 V12-CD137L蛋白对小鼠淋巴细胞的体外增殖作用
（1）取Babl/c小鼠处死，在无菌条件下取脾脏轻轻碾压，获得脾脏细胞悬液。
（2）所得脾脏细胞悬液用红细胞裂解液作用5分钟，1000转/分钟离心弃上清，再用无血清RPMI-1640培养基洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于一定量的血清RPMI-1640培养基中，获得小鼠脾淋巴细胞悬液。
（3）将小鼠脾淋巴细胞悬液稀释至5×106个细胞/毫升，接种于96孔细胞培养板中，每孔100微升。
（4）同时CD137L重组蛋白和所得V12-CD137L蛋白细胞培养液分别稀释成系列浓度5毫克/毫升、1毫克/毫升，分别取各个浓度的蛋白1微升加至步骤（3）所述的含有淋巴细胞的孔板中，每个浓度的蛋白做三个细胞复孔，以蛋白的透析缓冲液作为阴性对照，以不做任何处理的细胞作为空白组。
（5）将用V12-CD137L蛋白刺激的淋巴细胞在细胞培养箱中培养24小时。
（6）在每个细胞培养孔中加入10微升CCK-8细胞增殖检测试剂，细胞培养箱中继续培养3小时，取出细胞培养板，在酶标仪中用以630纳米为参比波长读取各孔的OD450（450纳米波长下的吸光度值），结果见图3所示。
（7）加入V12-CD137L蛋白的淋巴细胞其OD450要明显高于加入单纯CD137L重组蛋白，说明加入V12-CD137L蛋白的淋巴细胞其体外增殖水平要明显高于单独CD137L重组蛋白。
实施例3 酶联斑点免疫法检测V12-CD137L蛋白对艾滋病病毒gp120蛋白的体内免疫增强作用
（1）实验动物每组设三只Babl/c小鼠，分为三个组： V12-CD137L蛋白组、艾滋病病毒gp120蛋白组以及艾滋病病毒gp120蛋白和V12-CD137L蛋白共同免疫组。其中，艾滋病病毒gp120蛋白组接种量为10微克，V12-CD137L蛋白接种量为5微克，每只小鼠间隔两天加强免疫，共接种三次。
（2）在初次免疫第7天处死小鼠，在无菌条件下取脾脏轻轻碾压，获得脾脏细胞悬液。
（3）所得脾脏细胞悬液用红细胞裂解液作用5分钟，1000转/分钟离心弃上清，再用无血清RPMI-1640培养基洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于一定量的血清RPMI-1640培养基中，获得小鼠脾淋巴细胞悬液。
（4）将小鼠脾淋巴细胞悬液稀释至1×106个细胞/毫升，按照酶联斑点免疫检测说明书进行操作。
（5）结果显示：V12-CD137L蛋白自身不会引起小鼠产生特异性γ干扰素表达水平，但是V12-CD137L蛋白与艾滋病病毒gp120蛋白联合免疫可以有效提高小鼠特异性γ干扰素的表达水平（见图4所示）。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省医学科学院
<120> 一种V12-CD137L重组蛋白及其制备和应用
<130> 一种V12-CD137L重组蛋白及其制备和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Cys Thr Asp Leu Asn Thr Asn Asn Thr Thr Asn Thr Thr Glu Leu
1 5 10 15
Ser Ile Ile Val Val Trp Glu Gln Arg Gly Lys Gly Glu Met Arg Asn
20 25 30
Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr Ser Ile Arg Asp Lys Val Gln Arg Glu
35 40 45
Tyr Ala Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Val Glu Pro Ile Asp Asp Asn Lys
50 55 60
Asn Thr Thr Asn Asn Thr Lys Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Leu Ala Cys
65 70 75 80
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
100 105 110
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
115 120 125
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
130 135 140
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
145 150 155 160
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
180 185 190
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
195 200 205
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
210 215 220
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
225 230 235 240
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
245 250 255
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
260 265 270
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
275 280
<210> 2
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcatcacc atcatcacca ctgtactgac ctgaacacca acaatactac taacaccact 60
gaactgagca ttattgttgt atgggagcag cgtggtaagg gtgaaatgcg caattgtagc 120
ttcaacatta ccacctccat tcgcgataaa gtacagcgtg aatacgctct gttctacaaa 180
ctggatgttg aaccaattga cgataacaag aacaccacca acaacaccaa atatcgtctg 240
attaactgtc tggcgtgtcc gtgggcagtg tccggtgctc gcgcttctcc gggtagcgca 300
gcatctccac gtctgcgtga aggcccagaa ctgtctccgg acgatccggc aggcctgctg 360
gatctgcgtc agggcatgtt cgcgcaactg gtggcacaga acgttctgct gattgatggc 420
ccactgtcct ggtacagcga tccgggtctg gcaggtgttt ctctgactgg tggcctgtct 480
tacaaagagg acactaagga gctggtagtg gcgaaagctg gtgtatacta cgtattcttc 540
caactggagc tgcgtcgtgt ggttgctggc gaaggctctg gtagcgtgtc cctggcgctg 600
catctgcaac cgctgcgtag cgcagcgggt gcagcggctc tggcgctgac cgtggatctg 660
ccaccggcat ctagcgaggc acgtaacagc gctttcggtt tccagggtcg tctgctgcac 720
ctgtctgccg gtcagcgtct gggcgttcac ctgcacaccg aggcacgtgc acgtcacgct 780
tggcaactga ctcagggtgc aactgtactg ggcctgttcc gtgtaactcc ggagattccg 840
gcaggtctgc cgtctccgcg ttccgaataa ctcgag 876

Claims (5)

1.一种重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法，其特征在于所述的重组融合蛋白V12-CD137L是由艾滋病病毒gp120蛋白中的与淋巴细胞具有亲和功能的V1V2区与CD137L的功能区结合而成，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，表达重组融合蛋白V12-CD137L的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；SEQ ID NO.2基因序列通过以下步骤得到V12-CD137L重组融合蛋白：
(1) 人工合成SEQ ID NO.2基因，将融合基因插入大肠杆菌表达系统，获得表达V12-CD137L重组蛋白的重组大肠杆菌；
(2) 将步骤(1)所得重组大肠杆菌进行37℃培养，20-25℃诱导其表达重组蛋白V12-CD137L，获得诱导后的重组大肠杆菌；
(3) 将步骤(2)所得诱导后的重组大肠杆菌进行细胞破碎，通过离心获得重组大肠杆菌破碎上清液；
(4) 将步骤(3)所得重组大肠杆菌破碎上清液通过层析柱进行分离纯化，得到V12-CD137L重组蛋白纯化液；
(5) 将步骤(4)所得V12-CD137L重组蛋白纯化液置于透析袋中，用透析液进行透析，获得稳定的V12-CD137L重组融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法，其特征在于所述氨基酸序列SEQ ID NO.1中，第1-76位为艾滋病病毒gp120中的V1V2区，第77-283位为CD137L的功能区，所得重组融合蛋白兼具靶向定位淋巴细胞的功能和CD137L蛋白功能。
3.根据权利要求1所述的一种重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法，其特征在于所述透析液配方为：甘氨酸1-3克，二硫苏糖醇0.1-0.3克，吐温20 0.5-1克加水溶解定容至1升，调节pH值至7.0-9.0。
4.根据权利要求1所述的一种重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法，其特征在于所得V12-CD137L重组融合蛋白能促进淋巴细胞的体外培养的增殖水平，且效果优于单纯的CD137L重组蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种细胞免疫蛋白V12-CD137L的制备方法，其特征在于所得V12-CD137L重组融合蛋白能增强体内的细胞免疫水平。
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