CN105063142A - 一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从免疫球蛋白G的木瓜蛋白酶解液中纯化Fc片段的方法，属于Fc片段纯化方法技术领域。本发明主要解决现有蛋白A亲和层析存在介质成本昂贵，寿命周期较短，蛋白质类型的配基易脱落，污染待纯化抗体，洗脱条件较苛刻，容易对抗体造成伤害等问题。本发明一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G？Fc片段的方法，包括以下步骤：(1)采用MEP？HyperCel混合模式层析填料处理人血浆，(2)木瓜蛋白酶水解IgG，(3)采用混合模式层析填料MEP？HyperCel处理IgG的木瓜蛋白酶解液。本发明具有配基稳定、再生容易、可多次重复使用、洗脱条件温和、不易引起产物结构变异、无需后续操作等优点。

Description

一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法
技术领域
本发明涉及一种从免疫球蛋白G的木瓜蛋白酶解液中纯化Fc片段的方法，属于Fc片段纯化方法技术领域。
背景技术
免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是具有抗体活性的血清蛋白，又称为抗体。是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分子。人血清Ig分为G、M、A、D、E。IgG是血清中主要的抗体成分，占血清总Ig的75％。IgG在机体免疫防护中起着主要的作用，大多数抗菌、抗病毒、抗毒素抗体都属于免疫球蛋白G类抗体。其指标对于诊断某些疾病具有意义。IgG分子量约为150KD，可以由木瓜蛋白酶酶解为分子量为45KD的Fab片段(antigen-bindingfragment)和55KD的Fc片段(fragmentcrystalline)。Fc片段相对于IgG抗体分子的Fab部分，在序列结构上具有高度的保守性，因此由Fc片段免疫获得的抗体相对于IgG全分子免疫获得的抗体具有更高的专一性。
目前蛋白质纯化采取的技术手段主要有亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、盐析沉淀等。IgG及其Fc片段的分离纯化目前主要以ProteinA、ProteinG此两种亲和层析介质为主。ProteinA是来源于金黄色葡萄球菌的蛋白，其对IgG分子的Fc片段有很强的亲和力和特异性，在生理PH下两者紧密结合，pH降低至3～4时，两者又可解离。然而，实际应用中ProteinA亲和层析存在介质成本昂贵，且寿命周期较短；蛋白质类型的配基易脱落，污染待纯化抗体；洗脱条件较苛刻，容易对抗体造成伤害等缺点。
发明内容
本发明主要针对现有蛋白A亲和层析存在介质成本昂贵，寿命周期较短，蛋白质类型的配基易脱落，污染待纯化抗体，洗脱条件较苛刻，容易对抗体造成伤害等问题，提供一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白GFc片段的方法。
本发明为解决上述问题而采取的技术方案为：
一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白GFc片段的方法，包括以下步骤：
(1)采用MEPHyperCel混合模式层析填料处理人血浆
采用MEPHyperCel混合模式层析填料处理人血浆，获得免疫球蛋白IgG，首先使用平衡液A平衡装有MEPHyperCel层析填料的层析柱，平衡至层析柱流出液pH值与平衡液A相同，再取人血浆低速离心后除去悬浮物，用平衡液A稀释至3倍体积后，直接上样于平衡后的层析柱，上样后用平衡液A冲洗层析填料中未结合的成分,然后使用洗脱液A进行洗脱，并收集洗脱组分，洗脱完毕后采用0.1mol/L氢氧化钠对层析柱进行在位清洗，之后再使用平衡液A平衡层析柱，其中所述平衡液A为三羟基氨基甲烷-盐酸或磷酸盐缓冲液，pH值为7～8，浓度不大于0.2mol/L，所述洗脱液A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液，pH值为4.0～5.0；
(2)木瓜蛋白酶水解IgG
更换缓冲液：将洗脱组分置于超滤管中，加入体积等体积的酶解缓冲液进行超滤浓缩，重复5次，收集最后一次超滤组分，完成更换IgG缓冲液，；其中酶解缓冲液组成为：25mmol/LNaH2PO4-50mmol/LNaCl，pH值为7.2，
木瓜蛋白酶水解IgG：在木瓜蛋白酶溶液中，分别加入四乙酸乙二胺和巯基乙醇，使溶液中四乙酸乙二胺和巯基乙醇的终浓度分别为4mmol/L和20mmol/L，并维持15分钟使木瓜蛋白酶充分活化，然后将活化的木瓜蛋白酶加入最后一次超滤组分缓冲液中进行酶切反应，结束后加入过氧化氢终止反应，制成IgG的木瓜蛋白酶解液，过氧化氢在反映体系中的终浓度介于0.8～1％，木瓜蛋白酶与IgG的质量比≥1:20，酶切反应时间大于等于8小时；
(3)采用混合模式层析填料MEPHyperCel处理IgG的木瓜蛋白酶解液
将IgG的木瓜蛋白酶解液离心，除去悬浮物，上样于经平衡的MEPHyperCel层析柱，上样完成后采用平衡液B冲洗，再用洗脱液B洗脱，洗脱组分即为纯化的IgGFc片段，洗脱结束后用0.1mol/L氢氧化钠溶液清洗层析柱料，所述平衡液B的组成为：25mmol/LTris-HCl-50mmol/LNaClpH为7.0±0.4；洗脱液B的组成为：100mmol/L三羟基氨基甲烷-醋酸-50mmol/LNaCl，pH为4.5±0.1。
本发明的原理是利用MEPHyperCel层析填料配基4-巯基乙基吡啶(MEP)与抗体保守区域含有大量色氨酸、苯丙氨酸等残基的Fc片段特异性结合，当流动相的PH降低到4.0～4.55时，吡啶基团解离并带有正电荷，此时吸附的蛋白质也带正电荷，两者产生静电排斥而得到解离，从而得到纯化的Fc片段。由于MEPHyperCel层析填料的配基为化学无机小分子，并通过共价键与层析填料基质相连接，不易脱落，并可采用较高浓度得氢氧化钠溶液进行在线清洗，说明书使用寿命为proteinA层析介质的5倍以上，化学无机小分子配基的脱落也不会影响Fc片段的免疫原性，采用MEPHyperCel层析填料时的抗体洗脱条件介于4.0-4.5之间，相对于proteinA层析填料采用的pH3.0-3.5条件较温和，不易对抗体造成较大损伤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将混合模式吸附层析用于IgGFc片段的分离纯化。用MEPHyperCel混合模式吸附层析直接处理IgG的木瓜蛋白酶解液，充分利用填料配基对IgGFc片段的特异性结合，实现较高PH条件的洗脱，在保持抗体片段活性的同时节省了后续流程，方法新颖方便，具备良好的经济性。本发明的优点在于：(1)配基稳定，再生容易，可多次重复使用；(2)洗脱条件温和，不易引起产物结构变异；(3)无需后续操作。洗脱后无需调节pH值及更换缓冲液；(4)化学配基价格相对较低，较为经济。
附图说明
图1是MEPHyperCel层析填料工作原理示意图；
图2是实施例1各步样品SDS-PAGE电泳检测图。
具体实施方式
实施例1
如图1和图2所示，一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白GFc片段的方法，包括以下步骤：
(1)采用MEPHyperCel混合模式层析填料处理人血浆
装填有MEPHyperCel填料的层析柱，高度13.5cm，直径2.1cm，首先使用平衡液A平衡MEPHyperCel层析柱，平衡至层析柱流出液pH值与平衡液A相同，再取人血浆低速离心后除去悬浮物，取3mL离心后的人血浆，用平衡液A稀释至3倍体积后，直接上样于平衡后的层析柱，上样后用平衡液A冲洗层析填料中未结合的成分,然后使用洗脱液A进行洗脱，并收集洗脱组分，洗脱完毕后采用0.1mol/L氢氧化钠对层析柱进行在位清洗，之后再使用平衡液A平衡层析柱，其中所述平衡液A为三羟基氨基甲烷-盐酸即Tris-HCl，pH值为7.2，浓度为25mmol/L，低速离心条件为3000g，10min，所述洗脱液A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液，pH值为4.0，该步骤中所有过程的流速均为2.5mL/min，；
(2)木瓜蛋白酶水解IgG
更换缓冲液：将洗脱组分置于50mL超滤管中，2800g离心15分钟，加入等体积酶解缓冲液2800g离心15分钟，重复5次，收集最后一次超滤组分，完成更换IgG缓冲液；其中酶解缓冲液组成为：25mmol/LNaH2PO4-50mmol/LNaCl，pH值为7.2，
木瓜蛋白酶水解IgG：在木瓜蛋白酶溶液中，分别加入四乙酸乙二胺和巯基乙醇，使溶液中四乙酸乙二胺和巯基乙醇的终浓度分别为4mmol/L和20mmol/L，并维持15分钟使木瓜蛋白酶充分活化，然后将活化的木瓜蛋白酶加入最后一次超滤组分中室温反应8小时，结束后加入过氧化氢终止反应，制成IgG的木瓜蛋白酶解液，过氧化氢在反映体系中的终浓度介于0.8％，木瓜蛋白酶与最后一次超滤组分的质量比≥1:20；
(3)采用混合模式层析填料MEPHyperCel处理IgG的木瓜蛋白酶解液
装填有MEPHyperCel填料的层析柱，高度13.5cm，直径2.1cm，使用平衡液B平衡层析柱，平衡至层析柱流出液pH值与平衡液相同，将IgG的木瓜蛋白酶解液离心，除去悬浮物，上样于经平衡的MEPHyperCel层析柱，上样完成后采用平衡液B冲洗，再用洗脱液B洗脱，洗脱组分即为纯化的IgGFc片段，洗脱结束后用0.1mol/L氢氧化钠溶液清洗层析柱料，所述平衡液B的组成为：25mmol/LTris-HCl-50mmol/LNaClpH为7.2；洗脱液B的组成为：100mmol/LTris-醋酸-50mmol/LNaCl，pH为4.5。
本实施例步骤平衡液A为还可以为磷酸盐缓冲液，pH值为7～8，浓度不大于0.2mol/L。

Claims (1)

1.一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白GFc片段的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)采用MEPHyperCel混合模式层析填料处理人血浆
采用MEPHyperCel混合模式层析填料处理人血浆，获得免疫球蛋白IgG，首先使用平衡液A平衡装有MEPHyperCel层析填料的层析柱，平衡至层析柱流出液pH值与平衡液A相同，再取人血浆低速离心后除去悬浮物，用平衡液A稀释至3倍体积后，直接上样于平衡后的层析柱，上样后用平衡液A冲洗层析填料中未结合的成分,然后使用洗脱液A进行洗脱，并收集洗脱组分，洗脱完毕后采用0.1mol/L氢氧化钠对层析柱进行在位清洗，之后再使用平衡液A平衡层析柱，其中所述平衡液A为三羟基氨基甲烷-盐酸或磷酸盐缓冲液，pH值为7～8，浓度不大于0.2mol/L，所述洗脱液A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液，pH值为4.0～5.0；
(2)木瓜蛋白酶水解IgG
更换缓冲液：将洗脱组分置于超滤管中，加入体积等体积的酶解缓冲液进行超滤浓缩，重复5次，收集最后一次超滤组分，完成更换IgG缓冲液，；其中酶解缓冲液组成为：25mmol/LNaH2PO4-50mmol/LNaCl，pH值为7.2，
木瓜蛋白酶水解IgG：在木瓜蛋白酶溶液中，分别加入四乙酸乙二胺和巯基乙醇，使溶液中四乙酸乙二胺和巯基乙醇的终浓度分别为4mmol/L和20mmol/L，并维持15分钟使木瓜蛋白酶充分活化，然后将活化的木瓜蛋白酶加入最后一次超滤组分缓冲液中进行酶切反应，结束后加入过氧化氢终止反应，制成IgG的木瓜蛋白酶解液，过氧化氢在反映体系中的终浓度介于0.8～1％，木瓜蛋白酶与IgG的质量比≥1:20，酶切反应时间大于等于8小时；
(3)采用混合模式层析填料MEPHyperCel处理IgG的木瓜蛋白酶解液
将IgG的木瓜蛋白酶解液离心，除去悬浮物，上样于经平衡的MEPHyperCel层析柱，上样完成后采用平衡液B冲洗，再用洗脱液B洗脱，洗脱组分即为纯化的IgGFc片段，洗脱结束后用0.1mol/L氢氧化钠溶液清洗层析柱料，所述平衡液B的组成为：25mmol/LTris-HCl-50mmol/LNaClpH为7.0±0.4；洗脱液B的组成为：100mmol/L三羟基氨基甲烷-醋酸-50mmol/LNaCl，pH为4.5±0.1。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107033236A (zh) * 2017-05-05 2017-08-11 浙江大学 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921818A (zh) * 2010-07-15 2010-12-22 大连理工大学 一种生产重组蛋白a的方法
CN101921320A (zh) * 2010-07-15 2010-12-22 大连理工大学 一种重组蛋白a的分离纯化方法
CN102250241A (zh) * 2011-07-01 2011-11-23 浙江大学 一种分离牛初乳中IgG的方法
CN103505908A (zh) * 2013-09-12 2014-01-15 天津大学 一种利用混合模式层析介质连续分离纯化抗体的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921818A (zh) * 2010-07-15 2010-12-22 大连理工大学 一种生产重组蛋白a的方法
CN101921320A (zh) * 2010-07-15 2010-12-22 大连理工大学 一种重组蛋白a的分离纯化方法
CN102250241A (zh) * 2011-07-01 2011-11-23 浙江大学 一种分离牛初乳中IgG的方法
CN103505908A (zh) * 2013-09-12 2014-01-15 天津大学 一种利用混合模式层析介质连续分离纯化抗体的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
唐思远: "人免疫球蛋白G的Fab和Fc片段制备及层析分离研究", 《中国硕士学位论文 工程科技I辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107033236A (zh) * 2017-05-05 2017-08-11 浙江大学 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法

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