CN105541962B - 基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于7‑羟基香豆素的定点荧光标记方法，通过合成M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰‑tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上；通过采用“饱和突变”的方法，构建了能够在原核和真核生物细胞中表达的M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰‑tRNA合成酶突变库Lib‑CouKRS；通过合成用于定点荧光标记的7‑羟基香豆素赖氨酸，进行筛选和验证。本发明基于7‑羟基香豆素的定点荧光标记方法达到了基于7‑羟基香豆素在真核生物(哺乳动物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。

Description

基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法。

背景技术

蛋白质荧光标记是一种用于研究蛋白质结构和功能的重要手段。目前已有的荧光标记技术大致包括以下几种：(1)基于荧光蛋白(如绿色荧光蛋白Green FluorescentProtein GFP)融合表达进行蛋白质标记方法；(2)基于催化荧光基团(如罗丹明，FITC等)和蛋白质的特定氨基酸残基(如半胱氨酸Cys或赖氨酸Lys)间形成共价键，实现蛋白质的荧光标记；(3)基于化学或光“点击反应”，实现蛋白质定点荧光标记；(4)基于基因编码的香豆素酪氨酸方法实现蛋白质的定点荧光标记。受技术条件所限，这几种技术方法都有一定的缺陷：(1)荧光蛋白质(如绿色荧光蛋白质GFP)只能通过融合表达的方法标记在蛋白质的氮(N)端或碳(C)端，无法在蛋白质氨基酸其他序列中实现标记；且由于GFP体积较大，会对蛋白质结构和功能造成影响，其应用范围有限。(2)通过荧光基团和蛋白质氨基酸残基进行化学反应实现蛋白质荧光标记的方法，无法做到单一位点特异性，对于研究蛋白质相互作用具有一定的局限性。(3)基于“点击反应”的方法，需要化学或光照催化，会影响蛋白质的活性。(4)基因编码香豆素酪氨酸的方法，可以做到定点荧光标记，由于香豆素酪氨酸具有较强的量子产率，此方法可用于多种蛋白质的荧光标记，然而目前尚无法在真核生物里实现香豆素酪氨酸的定点插入。而吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶可以在细菌和真核细胞中实现穿梭，筛选特异识别7-羟基香豆素赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶，可解决上述问题。

基于此，本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法能够在真核生物(哺乳动物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，所述基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法能够在真核生物(哺乳动物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记，旨在解决目前荧光标记方法无法实现真核生物蛋白质定点荧光标记制备问题。

为实现上述目的，本发明提供一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，所述基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法包括如下步骤：

S1：获得M.Barkeri PylRS突变库；

S2：获得香豆素赖氨酸；

S3：筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(CouKRS)突变体；

S4：在鲸鱼肌红蛋白Myoglobin-4TAG中插入7-羟基香豆素赖氨酸，验证筛选得到的CouKRS能够实现在目的蛋白质制定位点插入。

优选地，所述步骤S1包括如下步骤：

S11：人工合成M.Barkeri PylRS的DNA序列；

S12：将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA连接到pBK质粒上，获得重组质粒A；

S13：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-Y349D、引物r-Y349D、引物f-L270I、引物r-L270I、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；

S14：以所述重组质粒A为模板，以所述引物f-Y349D和引物r-Y349D为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；

S15：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270I和引物r-L270I为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；

S16：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；

S17：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；

S18：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照预定的比例混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.Barkeri PylRS突变库。

优选地，所述预定的比例为1:1:32:32。

优选地，所述步骤S2包括如下步骤：

S21：取预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加预设量的苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；

S22：取预设量的上述7-羟基香豆素A和赖氨酸于60℃搅拌，经过12小时，经液相色谱分离，得到7-羟基香豆素母液C。

优选地，所述香豆素赖氨酸B经过0.22微米滤膜过滤除菌。

优选地，所述7-羟基香豆素母液C的浓度设定为100mM。

优选地，所述步骤S3包括如下步骤：

S31：构建和转化用于正筛选作用的pylT-pREP质粒；

S32：构建用于表达验证的pylT-pBAD质粒，进行转化和筛选，获得含有CouKRS的菌株，该菌株特异识别7-羟基香豆素赖氨酸。

优选地，所述CouKRS的突变位点为L270I,Y349D,N311A,N313G。

优选地，所述S4包括如下步骤：

S41：首先共转化CouKRS-pBK和Myoglobin-4tag-pBAD至TOP10中；

S42：获得纯化的Myoglobin蛋白质；

S43：将上述S42中获得Myoglobin蛋白质在488nm激光激发下，发出荧光，即可验证筛选得到的CouKRS能够实现在目的蛋白质制定位点插入。

本发明提供的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法通过合成M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上；通过采用“饱和突变”的方法，构建了能够在原核和真核生物细胞中表达的M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变库Lib-CouKRS；通过合成用于定点荧光标记的7-羟基香豆素赖氨酸，进行筛选和验证，达到了基于7-羟基香豆素在真核生物(哺乳动物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。

附图说明

图1为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的流程示意图；

图2为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S1的流程示意图；

图3为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S2的流程示意图；

图4为本发明香豆素赖氨酸的结构示意图；

图5为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S3的流程示意图；

图6为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S4的流程示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。

本发明提供的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，所述基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法是通过检测真核生物鲸鱼肌红蛋白插入了7-羟基香豆素，所述鲸鱼肌红蛋白在488nm激光激发下，发出荧光来实现的。

在本实施例中，M.Barkeri表示一种产甲烷厌氧菌；PylRS(pyrrolysineaminoacyl-tRNA synthetase)中文为吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶。

在实施例中，如图1所示，图1为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的流程示意图。野生型产甲烷厌氧菌的PylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶)只识别吡咯赖氨酸(第22种基因编码的天然氨基酸)，并催化吡咯赖氨酸和对应的tRNA发生转运反应，从而把吡咯赖氨酸连接到对应tRNA上，延伸因子EF-Tu携带上述产物至核糖体，参与蛋白质合成。tRNA又称转运RNA(transfer ribonucleic acid tRNA)，是具有携带并转运氨基酸功能的一类小分子核糖核酸。但是野生型的产甲烷厌氧菌的PylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶)并不识别香豆素赖氨酸，因此并不能确定哪一种PylRS突变体能够识别香豆素赖氨酸，所以要做突变-建库-筛选(定向进化)，最终筛选到能够特异识别香豆素赖氨酸的PylRS突变体，即命名为CoukRS。

在本实施例中，如图2所示，图2为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S1的流程示意图。步骤S1为获得M.Barkeri PylRS突变库；在实现步骤S1的过程中，又可分8个步骤来实现，分别是步骤S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17和S18。在步骤S11中首先人工合成M.Barkeri PylRS的DNA序列，然后通过步骤S12将M.Barkeri PylRS的DNA连接到pBK质粒上，既可以通过传统酶切链接，也可以采用分步PCR方法，利用饱和突变的方法，设计引物，把单个氨基酸的密码子突变为NNK(N代表A,T,C,G四种密码子，K代表T,G两种密码子)NNK组合把一个氨基酸的密码子突变为4*4*2＝32种，对应20种氨基酸。达到“无中生有”的目的，最终获得重组质粒A。此外，pBK质粒比较小，有利于下游的大容量库的构建。当上述合成的M.Barkeri PylRS的编码DNA连接到pBK质粒中，是通过分步聚合酶链式反应(PCR)方法时，实现步骤如下：在特定50微升PCR扩增体系和特定方法下实现突变库的构建。50微升PCR扩增体系包括：无菌水40微升、10倍浓度的缓冲液5微升，质粒DNA模板1微升，PCR扩增引物正负链各1微升，10mM dNTPs 1微升，高保真酶1微升。以下各步骤PCR反应体系均按照该体系进行。以上所述的反应体系，在PCR扩增仪上进行扩增，PCR反应扩增的方法为：94℃，4分钟，预变性；94℃，1分钟，变性；58℃，30秒，退火；72℃，3分钟，延伸；重复变性-退火-延伸步骤26个循环后，72℃保温5分钟，然后降温到16度，完成反应。以下各步骤突变库，均按照此方法进行。每一步骤的PCR扩增后，需要经过电击感受态大肠杆菌进行转化，并在大肠杆菌中进行扩增，经过质粒提取步骤得到可用于下一步PCR扩增反应的质粒。以上所述的可用于电击的感受态的制备采用标准步骤进行。

在本实施例中，设计定点突变引物的原理为先把野生型的pylrs连接到pbk上，然后设计引物(在特定位点有突变)，PCR后，得到本底pylrs-pbk和突变pylrs-pbk，由于本底的pylrs-pbk从DH5a中提取，腺嘌呤核苷上会甲基化，用特异识别甲基化腺嘌呤核苷的DpnI酶切即可去除本底。得到的线性质粒片段(含有突变)转化到感受态细胞中，得到环化的质粒。提取环化的质粒，以此为模版，再利用另一对突变引物进行突变，同样用DpnI处理，得到突变库2，再次重复，得到突变库3，得到突变库4。把单个氨基酸的密码子突变为NNK(N代表A,T,C,G四种密码子，K代表T,G两种密码子。)NNK组合把一个氨基酸的密码子突变为4*4*2＝32种，对应20种氨基酸。根据蛋白质晶体结构，可以获得结合底物的酶活中心，该中心由多个氨基酸组成，经过Insight II分子模拟计算，分子模拟软件Insight II对PylRS酶活力中心进行测算，可以预测底物分子周围的氨基酸，这些氨基酸是进化PylRS的重要依据。在步骤S13中，通过定点突变原理设计4对不同的引物，如表1所示，表1为采用本发明较佳实施例的引物的序列。该4对引物分别是引物f-Y349D、引物r-Y349D、引物f-L270I、引物r-L270I、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK。在步骤S14中，利用步骤S13中的引物f-Y349D、引物r-Y349D，通过PCR(聚合酶链式反应)，可获得突变库1；同理，利用步骤S13中的引物f-L270I和引物r-L270I、引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK，分别通过PCR(聚合酶链式反应)，可分别获得突变库2、突变库3、突变库4。将得到的突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照预定的比例混合，该比例可以设置成1:1:32:32，最终可获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.Barkeri PylRS突变库。详细步骤如下：在以上所述反应体系中加入上述引物f-Y349D和引物r-Y349D，进行PCR扩增，得PCR产物1；PCR产物1，经过电击转化到感受态大肠杆菌中扩增，经质粒提取，得到突变库1；以上述突变库1为模板，在反应体系中加入上述引物f-L270I和引物r-L270I，经PCR扩增和上述突变库1相同的步骤处理，得到突变库2；以上述突变库2为模板，经过引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK扩增，得到PCR产物3，PCR产物3经过上述突变库1相同的制备方法，得到突变库3，突变库3经过引物Y349NNK-f和引物Y349NNK-r引物扩增、转化、质粒提取步骤得到突变库4；把以上所述突变库1-4按照1:1:32:32的比例混合，得到最终用于7-羟基香豆素筛选用的M.Barkeri PylRS突变库(Lib-CouK)。

表1 为采用本发明较佳实施例的引物的序列

如图3所示，图3为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S2的流程示意图。在步骤S2中，主要涉及香豆素赖氨酸的合成，如图4所示，图4为本发明香豆素赖氨酸的结构示意图。其合成步骤如下：在步骤S21中，首先取间苯二酚5.5克，溶于水中，并加热到90℃，慢慢向间苯二酚溶液中滴加溶于水的苹果酸6.7克，反应2小时，得到7-羟基香豆素；在步骤S22中，取7-羟基香豆素1克，赖氨酸0.224克，分别溶于水，60℃搅拌12个小时过夜。经液相色谱分离，得到香豆素赖氨酸。把上述体系放大10倍后，得到3克7-羟基香豆素赖氨酸以供筛选。在本实施例中，香豆素赖氨酸B经过0.22微米滤膜过滤除菌。

如图5所示，图5为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S3的流程示意图。在步骤S3中，主要筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(CouKRS)突变体：在步骤S2中合成的非天然氨基酸7-羟基香豆素，溶解到水中，经过0.22微米滤膜过滤除菌，得到终浓度为100mM的7-羟基香豆素母液。进行筛选之前，构建正筛选pylT-pREP质粒，和用于表达验证的pylT-pBAD质粒。所述CouKRS的筛选步骤如下：首先共转化Lib-CouK和pylT-pREP质粒于Top10大肠杆菌感受态中，Top10大肠杆菌感受态细胞可用于DNA的化学转化。经37℃，1小时孵育后，涂布在正筛选培养板上。正筛选把目的克隆呈现出来，对应的负筛选则是把非目的克隆剔除。正筛选培养板的配制方法如下：100毫升LB培养基中加入0.015g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60℃；在其中加入1毫升以上所述的浓度为100mM的7-羟基香豆素母液，100微升80毫克/毫升的氯霉素液体，浓度为50mM的四环素100微升，浓度为50mM的卡那霉素100微升，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。经过37℃下，48小时的培养，挑选在正筛选板子上存活的单克隆细菌进行培养12小时，得到的单克隆细菌分别印在两种培养基上1和培养基2上。培养基1的配方为：100毫升LB培养基中加入0.015g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60℃；在其中加入1毫升以上所述的浓度为100mM的7-羟基香豆素母液，150微升80毫克/毫升的氯霉素液体，浓度为50mM的四环素100微升，浓度为50mM的卡那霉素100微升，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。培养基2的配方为：100毫升LB培养基中加入0.015g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60℃；在其中加入50微升80毫克/毫升的氯霉素液体，浓度为50mM的四环素100微升，浓度为50mM的卡那霉素100微升，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。印在培养基1和2上的细菌在37℃下培养48小时，能够在培养基1上生存同时不能在培养基2上生存的单克隆即为含有CouKRS的菌株。该菌株特异识别7-羟基香豆素赖氨酸。CouKRS的突变位点为L270I,Y349D,N311A,N313G，L270I,Y349D,N311A,N313G4个突变位点不重叠。

在本实施例中，7-羟基香豆素是目的底物，因此在筛选的时候添加到筛选平板上。配制母液是生化研究的常规或者常识。假设100毫升液体中含有若干成分，把他们直接混合，体积会增大，只有配成母液，才能保证浓度的情况下，不影响体积。参考PCR中的10倍buffer，就是母液。转化成功的菌株能够在氯霉素抗性平板上活下来。pylT-pREP质粒的作用就是让识别氨基酸的酶活下来。pylT基因编码tRNA为香豆素氨酰-tRNA合成酶；通过CouKRS的突变位点为L270I,Y349D,N311A,N313G的设计及筛选最终可以得到只识别香豆素赖氨酸，提高了特异性。从平板上获得抗性的目的菌株之后，进行表达蛋白质，Myoglobin(肌红蛋白)用来验证你筛选的CouKRS有用的目的蛋白。

如图6所示，图6为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S4的流程示意图。在步骤S4中主要涉及在鲸鱼肌红蛋白Myoglobin-4TAG中插入7-羟基香豆素赖氨酸，验证筛选得到的CouKRS可以实现在目的蛋白质制定位点实现插入。步骤S4共分为3个步骤，分别是S41、S42和S43。为了实现上述目的，在步骤S41中，首先共转化CouKRS-pBK和Myoglobin-4tag-pBAD至TOP10中。挑取单克隆，接种到50毫升的LB培养基中，过夜培养扩增。按照1:50的比例，把上述过夜培养扩增的细菌接种到200毫升的LB培养基中，并在培养基中加入浓度为50mM的四环素100微升，浓度为50mM的卡那霉素200微升，在37℃下培养，待A600达到0.5-0.6之间时，在培养基中加入1毫升浓度为100mM的7-羟基香豆素母液，于37℃下继续培养10小时。上述大量培养的细菌，经4000rpm，15min离心，收集得到细菌。在步骤S42中，收集步骤S41得到的细菌菌体进行高压破碎，离心速度为16000g,离心时间为20min，得到细菌上清液。细菌上清液经过镍柱和分子筛纯化，得到纯化的Myoglobin蛋白质。经过试验表明，插入了7-羟基香豆素的Myoglobin在488nm激光激发下能够发出绿色荧光，表明7-羟基香豆素介导的蛋白质荧光标记获得成功。

本发明提供的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法通过合成M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上；通过采用“饱和突变”的方法，构建了能够在原核和真核生物细胞中表达的M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变库Lib-CouKRS；通过合成用于定点荧光标记的7-羟基香豆素赖氨酸，进行筛选和验证，达到了基于7-羟基香豆素在真核生物(哺乳动物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法包括如下步骤：

S1：获得产甲烷厌氧菌的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(M.Barkeri PylRS)突变库；

S2：获得7-羟基香豆素赖氨酸；

S3：筛选特异识别7-羟基香豆素赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体(CouKRS)，所述步骤S3包括：步骤S31，构建和转化用于正筛选作用的pylT-pREP质粒；步骤S32，构建用于表达验证的pylT-pBAD质粒，进行转化和筛选，获得能够特异识别7-羟基香豆素赖氨酸的CouKRS的菌株，所述pylT基因编码7-羟基香豆素氨酰-tRNA合成酶；

S4：在鲸鱼肌红蛋白的4种密码子标签(Myoglobin-4TAG)中插入7-羟基香豆素赖氨酸，验证筛选得到的CouKRS能够实现在目的蛋白质特定位点插入；

所述步骤S1包括如下步骤：

S11：人工合成M.Barkeri PylRS的DNA序列；

S12：将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA连接到pBK质粒上，获得重组质粒A；

S13：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-Y349D、引物r-Y349D、引物f-L270I、引物r-L270I、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK，所述引物f-Y349D的序列为atggtggatggcgataccctggatattatgcatg，所述引物r-Y349D的序列为tcgccatccaccatgcagctatcgcccaca，所述引物f-L270I的序列为gaccatctataactatctgcgtaaactggatc，所述引物r-L270I的序列为gccgatcaccatgcagctatcgcccacaatttc，所述引物f-N311F313NNK的序列为catggttNNTtttNNTcaaatgggcagcggctgcacccgtgaaaac，所述引物r-N311F313NNK的序列为catttgANNaaaANNaaccatggtgaattcttccaggtgttctttg，所述引物f-Y349NNK的序列为atggtgNNKggcgataccctggatattatgcatg，所述引物r-Y349NNK的序列为tcgccMNNcaccatgcagctatcgcccacaat；

S14：以所述重组质粒A为模板，以所述引物f-Y349D和引物r-Y349D为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；

S15：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270I和引物r-L270I为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；

S16：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；

S17：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；

S18：将所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4混合，获得用于7-羟基香豆素赖氨酸筛选用的M.Barkeri PylRS突变库。

2.如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照1:1:32:32的比例进行混合。

3.如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：

S21：取间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；

S22：取上述7-羟基香豆素A和赖氨酸于60℃搅拌，经过12小时；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到7-羟基香豆素赖氨酸，所述7-羟基香豆素赖氨酸经过0.22微米滤膜过滤除菌。

4.如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述CouKRS的突变位点为L270I,Y349D,N311A,N313G。

5.如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步骤：

S41：共转化CouKRS-pBK和Myoglobin-4tag-pBAD至TOP10中；

S42：获得纯化的Myoglobin蛋白质；

S43：将上述S42中获得Myoglobin蛋白质在488nm激光激发下，发出荧光，即可验证筛选得到的CouKRS能够实现在目的蛋白质特定位点插入。

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