CN111662918B - 多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的共生产系统及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白体外合成技术领域，具体涉及一种多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的共生产系统及应用。本发明多蛋白体系的共生产方法通过将表达溶菌蛋白的载体和多种表达蛋白的载体共转入到蛋白表达菌株中，使所得共表达菌株表达相应的蛋白及溶菌蛋白，随着共表达菌株的生长，产生的溶菌蛋白作用于共表达菌株，使其发生自主裂解，释放出其表达的蛋白，形成多蛋白体系。本发明多蛋白体系的共生产系统可以将蛋白表达和释放一体化，且无需对共表达菌株进行物理破碎或化学破碎的步骤，可用于体外合成蛋白质和/或化合物，与现有无细胞蛋白合成系统相比更加简便、快速、高效、成本更低，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的共生产系统及应用
技术领域
本发明属于蛋白体外合成技术领域，具体涉及一种多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的共生产系统及应用。
背景技术
细胞是生命活动的基本结构和功能单位，同时也为生化反应提供了场所，有着“细胞工厂”之称。但是，细胞内生化反应网络复杂，人为地改造容易对细胞产生不利或不可预测的影响，最终导致细胞活性降低甚至功能丧失，极大程度上限制了细胞工厂的应用。因此，如何突破细胞工厂的局限是生物合成所面临的巨大挑战。针对细胞工厂的局限，无细胞蛋白合成系统(cell-free protein synthesis,CFPS)提供了很好的解决途径。无细胞蛋白合成系统是不依赖于完整的细胞在体外进行蛋白质合成的生物学技术，它以DNA或mRNA为模板，利用细胞提取物中的蛋白合成元件、蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、tRNA和能量物质等，在体外完成蛋白质合成，模拟生物细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程，产生的蛋白可用于蛋白质功能检测、结构分析等下游实验。与活细胞体系相比，模块化的无细胞蛋白质合成系统反应成分明确简单，组分易操控，实验周期短，为众多生化实验提供了一个开放通用的反应环境。
无细胞蛋白质合成系统目前主要分为两种类型：一种是直接来源于细胞裂解物(WCE:whole-cell extracts)，另一种则只含有DNA转录、蛋白质翻译和能量再生的必需成分，即重组元件蛋白质合成系统PURE(protein synthesis using recombinantelements)。不同于WCE系统，PURE系统所有添加物完全已知并浓度可控，因而具有多种显著优势：例如低降解酶环境使得mRNA或蛋白质的稳定性得到了极大提高；通过操纵系统中的蛋白或底物组分，可以便捷的对要合成的蛋白质进行设计(如非天然氨基酸的插入等)，使得系统高度模块化并具有灵活性等。
虽然PURE自2002年已经商业化，但其昂贵价格限制了在绝大部分实验室的应用。通过传统的方法制备PURE系统，需要分别表达并纯化30多种与转录、翻译和能量重生有关的蛋白，工作量大，消耗时间长，制备成本高，一般实验室无法自行制备。目前以NEB(NewEngland Biolab)为代表的大型生物制剂公司仍是采用该种方法生产PURE系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的共生产系统及应用，旨在解决现有PURE系统合成中存在的工作量大、耗时长、成本高等问题。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供了一种多蛋白体系的共生产方法，其包括如下步骤：
提供表达溶菌蛋白的载体、多种表达蛋白的载体及蛋白表达菌株，每种表达蛋白的载体分别表达多蛋白体系中的一种蛋白，且不同的表达蛋白的载体表达的蛋白各不相同；
将表达溶菌蛋白的载体与每种表达蛋白的载体分别共转入到蛋白表达菌株中，得到多种共表达菌株；
将全部的共表达菌株进行共培养，当共表达菌株的生长密度达到自主裂解密度时发生自主裂解，释放出各自表达的蛋白，得到多蛋白体系；
其中，多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶。
本发明另一方面提供一种多蛋白体系的共生产系统，其包括：
共表达菌株制备单元：用于制备多种共表达菌株，每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的共表达菌株表达的蛋白各不相同；
细胞培养单元：用于培养共表达菌株单元中的共表达菌株；
其中，多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶。
本发明再一方面提供上述多蛋白体系的共生产系统在体外合成蛋白质和/或化合物中的应用。
本发明提供的多蛋白体系的共生产方法的有益效果在于：通过将表达溶菌蛋白的载体和多种表达蛋白的载体共转入到蛋白表达菌株中，使所得共表达菌株表达相应的蛋白及溶菌蛋白，随着共表达菌株的生长，产生的溶菌蛋白作用于共表达菌株，使其发生自主裂解，释放出其表达的蛋白，形成多蛋白体系。本发明提供的多蛋白体系的共生产方法可以实现多种共表达菌株的共同培养并一次性收集获得多种蛋白，且无需对蛋白表达菌株进行机械破碎或非机械破碎的步骤，具有适用范围广、步骤简单、效率高、成本低的优点。
本发明提供的多蛋白体系的共生产系统的有益效果在于：多蛋白体系的共生产系统包括共表达菌株制备单元和细胞培养单元。其中，共表达菌株制备单元制备多种共表达菌株，由于每种共表达菌株不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白及溶菌蛋白，因此，多种共表达菌株在细胞培养单元中共培养时，溶菌蛋白会致使共表达菌株发生自主裂解，有利于共表达体系内的菌株共存的稳定性(避免部分共表达菌株因为生长过快且不受抑制而抢夺全部资源)，同时，通过自主裂解会释放出多蛋白体系中的各种蛋白，从而实现多蛋白体系的共生产。本发明提供的多蛋白体系的共生产系统可以一次性得到多种蛋白，具有培养条件易于控制、生产效率高、成本低的优点。
本发明提供的多蛋白体系的共生产系统在体外合成蛋白质和/或化合物中的应用的有益效果在于：多蛋白体系的共生产系统通过将多种共表达菌株进行共培养步骤即可收集得到用于体外合成蛋白质和/或化合物所必需的蛋白，可以不依赖于完整的细胞、在体外进行蛋白质和/或化合物的合成。与现有制备无细胞蛋白合成系统的方法相比，本发明提供的多蛋白体系的共生产系统更加简便、快速、高效、成本更低。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例提供的多蛋白体系的共生产方法的工作流程示意图；
图2为本发明提供的具体实施例中，合成红色荧光蛋白mRFP在580nm激发、610nm发射时的含量和荧光信号标准曲线；
图3为本发明提供的具体实施例中，对合成红色荧光蛋白mRFP的实时荧光信号监测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，需要理解的是，本发明实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
另外，除非上下文另外明确地使用，否则词的单数形式的表达应被理解为包含该词的复数形式。术语“包括”或“具有”旨在指定特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合的存在，但不用于排除存在或可能添加一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合。
在本发明实施例的描述中，术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组分中的每一个的具体公开。因此，如在本文中的短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非本发明另有定义，否则本发明内容中使用的术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，本发明实施例中的细胞与组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸有关的任何术语和技术都是本领域众所周知的和常用的。在任何潜在歧义的情况下，本发明提供的定义优先于任何词典或外部定义。
在本发明实施例的描述中，术语“载体”包括质粒、噬菌体、病毒或其它载体。
本发明实施例提供了一种多蛋白体系的共生产方法，其包括如下步骤：
S1、提供表达溶菌蛋白的载体、多种表达蛋白的载体及蛋白表达菌株，每种表达蛋白的载体分别表达多蛋白体系中的一种蛋白，且不同的表达蛋白的载体表达的蛋白各不相同；
S2、将表达溶菌蛋白的载体与每种表达蛋白的载体分别共转入到蛋白表达菌株中，得到多种共表达菌株；
S3、将全部的共表达菌株进行共培养，当共表达菌株的生长密度达到自主裂解密度时发生自主裂解，释放出各自表达的蛋白，得到多蛋白体系；
其中，多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶。
本发明实施例提供的多蛋白体系的共生产方法通过将表达溶菌蛋白的载体和多种表达蛋白的载体共转入到蛋白表达菌株中，使所得共表达菌株表达相应的蛋白及溶菌蛋白，随着共表达菌株的生长，产生的溶菌蛋白作用于共表达菌株，使其发生自主裂解，释放出其表达的蛋白，形成多蛋白体系。本发明实施例提供的多蛋白体系的共生产方法可以实现多种共表达菌株的共同培养并一次性收集获得多种蛋白，且无需对蛋白表达菌株进行机械破碎或者非机械破碎的步骤，具有适用范围广、步骤简单、效率高、成本低的优点。
具体的，S1中，表达溶菌蛋白的载体可用于表达溶菌蛋白。溶菌蛋白是一类通过不同途径抑制宿主细胞的细胞壁合成，或直接破坏宿主细胞的细胞壁的蛋白质。通过将表达溶菌蛋白的载体转入蛋白表达菌株中，随着共表达菌株的生长，导致表达溶菌蛋白的载体拷贝数增加以及溶菌蛋白表达的升高，进而使共表达菌株发生自主裂解。
在一些实施例中，选择表达噬菌体
Figure BDA0002507029840000061
蛋白的质粒ePop作为表达溶菌蛋白的载体。ePop作为一种工程化的基因线路，其中含有两个主要模块：一个细胞自主裂解模块：该模块基于来自噬菌体
Figure BDA0002507029840000062
蛋白的基因。噬菌体
Figure BDA0002507029840000063
只含有10个基因，其溶菌机制是产生单一的E蛋白，E蛋白可以有效抑制肽聚糖合成酶MraY，从而抑制肽聚糖的合成，并且，E蛋白还可以抑制肽聚糖前体物质二氨基庚酸进入细胞壁，进而引起宿主细胞的溶解。另一模块是细胞密度传感模块，该模块基于突变的luxR基因和ColE1来源的、缺少Rom/Rop蛋白复制的基因。因此，使用质粒ePop可以实现编程自主裂解，通过将基因线路配置为与E蛋白表达偶联的细胞密度依赖性线路，当蛋白表达菌株在培养繁殖中达到一定密度时，表达噬菌体
Figure BDA0002507029840000064
蛋白的质粒ePop拷贝数会增加，此时E蛋白的表达也更高，进而导致共表达菌株发生自主裂解。需要说明的是，基因线路是一种可以调节的线路，可根据需要执行的功能调节相应的模块，因此上述选择表达噬菌体
Figure BDA0002507029840000065
蛋白的质粒ePop的实施例仅为本发明实施例的其中一个选择，即使不使用该基因线路，利用其他可使细胞产生自主裂解或诱导裂解的基因线路；或者可以使蛋白表达菌株在生长密度达到较高时发生自主裂解的技术方案都应属于本发明的保护范围。
蛋白表达菌株在本发明实施例中用于共表达溶菌蛋白和多蛋白体系中的蛋白，因此，原则上适合共表达溶菌蛋白和其它蛋白表达菌株均适用于本发明。在一些实施例中，为了实现蛋白的稳定生产，选择大肠杆菌菌株作为蛋白表达菌株。具体地，大肠杆菌菌株包括但不限于BL21(DE3)、MC4100、MG1655、NISSLE1917系列的菌株、它们的突变菌株或衍生菌株。
多种表达蛋白的载体用于表达蛋白。其中，这些表达蛋白的载体分别不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白，因此表达蛋白的载体的种类数量与多蛋白体系中蛋白的种类数量相等。将多种表达蛋白的载体分别转入蛋白表达菌株后，可使蛋白表达菌株表达相应的蛋白。
S2中，通过将表达溶菌蛋白的载体与表达多蛋白体系蛋白的载体共转入到蛋白表达菌株中，可以得到共表达菌株，该共表达菌株同时表达溶菌蛋白和多蛋白体系蛋白。在该步骤中，所得共表达菌株的种类数量与表达蛋白的载体的种类数量相等，也与多蛋白体系中蛋白的种类数量相等，因此，可以理解的是，每种共表达菌株也分别不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白。
S3中，通过将S2得到的所有共表达菌株进行共培养，当菌株生长到相当的密度时，其表达的溶菌蛋白的浓度达到破坏共表达菌株的细胞壁的浓度时，共表达菌株发生自主裂解，将其表达的蛋白释放出来。其中，每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白，将所有共表达菌株发生自主裂解而释放的蛋白收集起来，即组成多蛋白体系。
在一些实施例中，可以对共表达菌株发生自主裂解的时机进行控制。具体地，当表达溶菌蛋白的载体为表达噬菌体
Figure BDA0002507029840000071
蛋白的质粒ePop时，可通过对ePop的基因线路中关于细胞自主裂解模块进行设置，使其在共表达菌株的生长密度达到某个数值时，表达噬菌体
Figure BDA0002507029840000072
蛋白的质粒ePop的拷贝数会显著增加，进而表达更多的溶菌蛋白，促进共表达菌株发生自主裂解。
在一些实施例中，在共表达菌株培养过程中，可每隔一段时间对其进行OD值的测定。当共表达菌株的生长密度达到自主裂解密度，即OD600大于等于0.05时，共表达菌株开始发生自主裂解。
在一些实施例中，将多种共表达菌株进行共培养之前，先将每种共表达菌株进行单独培养。通过将每种共表达菌株单独培养，可以活化共表达菌株，使其达到较佳状态。此时，在每种共表达菌株单独培养的环境中加入葡萄糖，以用于抑制菌株发生自主裂解，从而使菌株可以顺利繁殖到一定的密度；然后将共表达菌株接种成为共培养体系，不加入葡萄糖，使自主裂解线路打开，此时共培养菌株达到自主裂解的密度时即发生自主裂解。具体地，加入葡萄糖用于抑制共培养菌株发生自主裂解时，葡萄糖在培养环境下(如培养基中)的终质量体积浓度为0.5％-2％。
多蛋白体系可以有很多种，其是各代谢途径中所包括的一系列具有催化功能的蛋白的总称。在本发明实施例中，多蛋白体系包括蛋白质体外合成和/或催化合成化合物的蛋白。其中，用于蛋白质翻译和能量再生的蛋白质组成的多蛋白体系是实现体外合成蛋白质的关键，在本发明实施例中，能量再生所必需的蛋白包括肌酸激酶、肌激酶、二磷酸核苷激酶和焦磷酸酶；催化合成化合物的酶组成的多蛋白体系可以实现多种目标化合物的高效合成，目前在生物、化工、医疗等领域均有应用。
在一些实施例中，选择聚酮化合物合成酶体系和/或非核糖体多肽合成酶体系作为多蛋白体系共生产方法的目标多蛋白体系。其中，聚酮化合物是由细菌、放线菌、真菌或植物产生的一大类天然产物，包括大环内酯类、四环素类、蒽环类、聚醚类等化合物。由于这些天然产物具有抗感染、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种活性，因此提供可高效生产聚酮化合物合成酶体系的方法在医疗领域具有重要意义。催化合成聚酮化合物的酶即为聚酮化合物合成酶(polyketidesynthase,PKS)，具体包括PKS I、PKS II、PKS III。非核糖体多肽合成酶是一类特殊的酶，其可以在没有核糖体、不以mRNA为模板、也不需tRNA为携带工具的情况下，利用氨基酸及其它化合物(如水杨酸、吡啶羧酸等)合成特殊多肽。细菌和真菌体内通过非核糖体多肽合成酶体系可合成青霉素、万古霉素、放线菌素D、杆菌肽、环孢菌素A等，高效生产非核糖体多肽合成酶体系将为高效合成上述药物化合物提供更便利的条件。
在一些实施例中，选择以重组元件蛋白质合成体系作为多蛋白体系共生产方法的目标多蛋白体系。重组元件蛋白质合成体系也是多蛋白体系中的一种，其包括的一系列蛋白可以在体外条件下用于合成目的蛋白。与非核糖体多肽合成酶不同的是，在合成目的蛋白过程中，重组元件蛋白质合成体系需要核糖体和氨基酸的参与，同时还需要以mRNA作为模板，以tRNA作为携带氨基酸的工具。
在一些实施例中，当以mRNA作为模板时，选择包括翻译起始因子1(translationalinitiation factor1，IF1)、翻译起始因子2(translational initiation factor 2，IF2)、翻译起始因子3(translational initiation factor 3，IF3)、翻译延伸因子G(translational elongation factor G，EF-G)、翻译延伸因子Tu(translationalelongation factor Tu，EF-Tu)、翻译延伸因子Ts(translational elongation factorTs，EF-Ts)、翻译延伸因子4(translational elongation factor 4，EF-4)、翻译释放因子1(translational release factor 1，RF1)、翻译释放因子2(translational releasefactor 2，RF2)、翻译释放因子3(translational release factor 3，RF3)、核糖体循环因子(ribosome recycling factor，RRF)、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶(Met-tRNAformyltransferase)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌激酶(myokinase)和二磷酸核苷激酶(diphosphonucleotide kinase，NDK)、焦磷酸酶(Pyrophosphatase)和22种氨酰-tRNA合成酶作为重组元件蛋白质体系的组合，通过多蛋白体系的共生产方法进行生产得到，可以快速高效实现目标蛋白的体外合成。其中，22种氨酰-tRNA合成酶具体包括：甲硫氨酰-tRNA合成酶(Met-tRNA-synthetase)、苏氨酰-tRNA合成酶(Thr-tRNA-synthetase)、谷氨酰-tRNA合成酶(Glu-tRNA-synthetase)、丙氨酰-tRNA合成酶(Ala-tRNA-synthetase)、天冬氨酰-tRNA合成酶(Asp-tRNA-synthetase)、天冬酰胺酰-tRNA合成酶(Asn-tRNA-synthetase)、半胱氨酰-tRNA合成酶(Cys-tRNA-synthetase)、脯氨酰-tRNA合成酶(Pro-tRNA-synthetase)、酪氨酰-tRNA合成酶(Tyr-tRNA-synthetase)、谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(Gln-tRNA-synthetase)、组氨酰-tRNA合成酶(His-tRNA-synthetase)、甘氨酰-tRNA合成酶A(Gly-tRNA-synthetase-A)、甘氨酰-tRNA合成酶B(Gly-tRNA-synthetase-B)、缬氨酰-tRNA合成酶(Val-tRNA-synthetase)、赖氨酰-tRNA合成酶(Lys-tRNA-synthetase)、亮氨酰-tRNA合成酶(Leu-tRNA-synthetase)、色氨酰-tRNA合成酶(Trp-tRNA-synthetase)、苯丙氨酰-tRNA合成酶B(Phe-tRNA-B synthetase)、丝氨酰-tRNA合成酶(Ser-tRNA-synthetase)、苯丙氨酰-tRNA合成酶A(Phe-tRNA-A synthetase)、精氨酰-tRNA合成酶(Arg-tRNA synthetase)、异亮氨酰-tRNA合成酶(Ile-tRNA synthetase)。
在一些实施例中，当以编码目的蛋白的DNA作为模板时，还需在上述多蛋白体系中添加T7 RNA聚合酶；当目的蛋白是一些体外较难合成的蛋白时，通过在上述多蛋白体系中添加二硫键异构酶和/或分子伴侣蛋白，有助于提升这类目的蛋白的体外合成效率。
本发明实施例还提供了一种多蛋白体系的共生产系统，其包括：
共表达菌株制备单元，用于制备多种共表达菌株，每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的共表达菌株表达的蛋白各不相同；
细胞培养单元，用于培养共表达菌株单元中的共表达菌株；
其中，多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶。
本发明实施例提供的多蛋白体系的共生产系统包括共表达菌株制备单元和细胞培养单元，其中，共表达菌株制备单元制备多种共表达菌株，由于每种共表达菌株不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白及溶菌蛋白，因此，多种共表达菌株在细胞培养单元中共培养时，溶菌蛋白会致使共表达菌株发生自主裂解，释放出多种蛋白，实现多蛋白体系的共生产。多蛋白体系的共生产系统通过编辑菌株实现自主裂解，简化后续的蛋白纯化步骤，并且在共培养过程中维持菌群的稳定性(避免部分共表达菌株因为生长过快且不受抑制而抢夺全部资源)，可以一次性得到多种蛋白，具有培养条件易于控制、生产效率高、成本低的优点。
共表达菌株制备单元中有多种共表达菌株，且每种共表达菌株不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白。在一些实施例中，可以先构建多种表达蛋白的载体，每种表达蛋白的载体不重复地表达上述多蛋白体系中的一种蛋白；通过将这些表达载体与表达溶菌蛋白的载体分别共转入到蛋白表达菌株中，从而得到多种共表达菌株，每种共表达菌株不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白。表达溶菌蛋白的载体具体可以选择表达噬菌体
Figure BDA0002507029840000111
蛋白的质粒ePop，该质粒在表达E蛋白的基础上，还具有感应细胞密度功能，当共表达菌株的生长达到一定密度时，可以进一步促进该质粒的拷贝数增加，进而促进E蛋白的表达。同时，通过加入不同浓度的葡萄糖，还可以实现调节共表达菌株自主裂解程度的效果。
在一些实施例中，选择聚酮化合物合成酶体系和/或非核糖体多肽合成酶体系作为共生产系统的目标多蛋白体系。通过合成这两种多蛋白体系，有助于实现多种药物化合物的高效合成。
在一些实施例中，选择重组元件蛋白质合成体系作为共生产系统的目标多蛋白体系。通过合成重组元件蛋白质，有助于实现目标蛋白质的体外高效合成。
在一些实施例中，当以mRNA作为模板时，选择翻译起始因子1、翻译起始因子2、翻译起始因子3、翻译延伸因子G、翻译延伸因子Tu、翻译延伸因子Ts、翻译延伸因子4、翻译释放因子1、翻译释放因子2、翻译释放因子3、核糖体循环因子、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶、肌酸激酶、肌激酶、二磷酸核苷激酶、焦磷酸酶和22种氨酰-tRNA合成酶组合作为多蛋白体系的共生产系统的目标多蛋白体系。通过共生产合成上述蛋白，可以快速高效实现目标蛋白的体外合成。
在一些实施例中，当以编码目的蛋白的DNA作为模板时，还需在上述多蛋白体系中添加T7 RNA聚合酶；当目的蛋白是一些体外较难合成的蛋白时，通过在上述多蛋白体系中添加二硫键异构酶、分子伴侣蛋白等，有助于提升这类目的蛋白的体外合成效率。
在细胞培养单元中对共表达菌株进行共培养的条件涉及培养基、培养温度、培养湿度、培养时间、辅助添加物、光照条件等多方面。在一些实施例中，在细胞培养单元中对共表达菌株进行共培养方法为：先挑取每种共表达菌株的单克隆在含有卡那霉素和氯霉素双抗性的LB培养基，并加入终质量体积浓度为2％的葡萄糖抑制细胞裂解，在37℃、220rpm条件下培养14h-18h，然后再接种转入具有卡那霉素和氯霉素双抗性的M9培养基中，在37℃、220rpm条件下共培养5-6小时后加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导3-5小时。将共培养物离心、收集上清，纯化得到多蛋白体系。
在一些实施例中，在细胞培养单元中对共表达菌株进行共培养之前事先加入葡萄糖用于抑制共培养菌株发生自主裂解；在扩大培养时则不加入葡萄糖，使自主裂解线路打开，此时共培养菌株达到自主裂解的密度时即发生自主裂解。具体地，加入葡萄糖用于抑制共培养菌株发生自主裂解时，葡萄糖在培养环境下(如培养基中)的终质量体积浓度为0.5％-2％。
在一些实施例中，多蛋白体系的共生产系统还可以包括蛋白纯化单元，用于将共表达菌株发生自主裂解后释放并收集的多蛋白体系进行纯化，去除多余的细胞碎片和杂质蛋白。纯化的方法可以采用本领域的常用蛋白纯化方法，如可以在表达蛋白的载体构建时融合重组蛋白纯化标签如His标签，使后续的蛋白纯化过程更加快速方便。His标签作为金属螯合亲和层析的纯化标签，是蛋白纯化的常用标签，本发明实施例的蛋白纯化方法也可以采用His标签以外的任何适用于蛋白纯化的标签。
本发明实施例还提供了上述多蛋白体系的共生产系统在体外合成蛋白质和/或化合物中的应用。
本发明实施例提供的多蛋白体系的共生产系统在体外合成蛋白质和/或化合物中的应用的有益效果在于：多蛋白体系的共生产系统通过将多种共表达菌株进行共培养步骤即可一步收集得到用于体外合成蛋白质和/或化合物所必需的蛋白，可以不依赖于完整的细胞、在体外进行蛋白质和/或化合物的合成。与现有无细胞蛋白合成系统制备方法相比，多蛋白体系的共生产系统更加简便、快速、高效、成本更低。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的共生产系统及应用的进步性能显著的体现，以下通过具体实施例来举例说明上述技术方案。
实施例1
(1)将39种融合了His标签的表达蛋白的质粒分别与表达噬菌体
Figure BDA0002507029840000131
蛋白的质粒ePop共同转化进入蛋白表达菌株BL21(DE3)中，得到39种共表达菌株；其中，39种表达蛋白的质粒依次单独表达翻译起始因子1、翻译起始因子2、翻译起始因子3、翻译延伸因子G、翻译延伸因子Tu、翻译延伸因子Ts、翻译延伸因子4、翻译释放因子1、翻译释放因子2、翻译释放因子3、核糖体循环因子、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶、肌酸激酶、肌激酶和二磷酸核苷激酶、焦磷酸酶、T7 RNA聚合酶和22种氨酰-tRNA合成酶；
(2)分别从39种共表达菌株中挑单克隆于4ml LB培养基中(卡那霉素和氯霉素双抗性)，并加入200μl、40wt％的葡萄糖用来抑制细胞的自主裂解，在37℃的摇床中，220rpm分别培养14-18小时；
(3)将步骤(2)所得共表达菌株菌液与M9培养基(卡那霉素和氯霉素双抗性)按照1：100的体积比接种，在37℃摇床220rpm进行扩大培养至OD600＝0.6-0.8之间，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，再继续培养诱导3-5小时后4℃离心，收取上清过镍柱纯化收集39种混合蛋白；
(4)将步骤(3)所得39种混合蛋白用3.5kDa的透析袋进行透析，透析后的蛋白进行浓缩后加入核糖体、能量缓冲液和表达红色荧光蛋白mRFP的DNA线性模板后，在37℃金属浴中反应4小时。反应完毕后，将反应体系转移至康宁荧光检测384孔板里，利用酶标仪进行检测荧光信号。其中，能量缓冲液由L-谷氨酸钾、20种氨基酸混合物、HEPES-KOH缓冲液、亚精胺、醋酸镁、磷酸肌酸、二硫苏糖醇、甲酰叶酸、NTPs、IPTG、tRNA、RNA酶抑制剂、无菌水配制而成。
通过图2可以看出，在580nm激发和610nm发射的情况下，mRFP的含量和检测到的荧光信号呈线性关系。将重组元件蛋白合成系统中的转录翻译元件、能量再生系统、底物、无机盐、核糖体等配成反应混合物，两个重复反应中加入mRFP的DNA线性模板，阴性对照中不加入mRFP的DNA线性模板，将反应体系加入到康宁荧光检测384孔板中，设置孵育温度37℃，实时监测在580nm激发和610nm发射下的荧光信号，反应过程中荧光信号在持续增强，指示2个重复反应中mRFP的体外合成均在发生(图3)。将反应体系加入到0.2mL PCR管中，一管加入mRFP的DNA线性模板，一管不加mRFP的DNA线性模板作为阴性对照，在37℃金属浴中反应4小时，反应完毕后，将反应体系转移至康宁荧光检测384孔板里，利用酶标仪进行检测，检测到有荧光信号如表1所示:(mRFP激发：580nm，发射：610nm)。根据荧光信号和mRFP含量的线性关系，可计算出该体外合成系统在37℃反应4小时后，可合成mRFP蛋白1.4ng/μL。
表1合成红色荧光蛋白mRFP的终点荧光检测结果
荧光信号(580nm激发，610nm发射) 红色荧光蛋白mRFP含量
PURE 85 1.4ng/μL
阴性对照 7 0
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供表达溶菌蛋白的载体、多种表达蛋白的载体及蛋白表达菌株，每种所述表达蛋白的载体分别表达所述多蛋白体系中的一种蛋白，且不同的所述表达蛋白的载体表达的蛋白各不相同；
将所述表达溶菌蛋白的载体与每种所述表达蛋白的载体分别共转入到所述蛋白表达菌株中，得到多种共表达菌株；
将全部的所述共表达菌株进行共培养，当所述共表达菌株的生长密度达到自主裂解密度时发生自主裂解，释放出各自表达的蛋白，得到所述多蛋白体系；
其中，所述多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶。
2.根据权利要求1所述多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，所述多蛋白体系选自聚酮化合物合成酶体系、非核糖体多肽合成酶体系、重组元件蛋白质合成体系中的至少一种。
3.根据权利要求2所述多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，所述重组元件蛋白质体系包括翻译起始因子1、翻译起始因子2、翻译起始因子3、翻译延伸因子G、翻译延伸因子Tu、翻译延伸因子Ts、翻译延伸因子4、翻译释放因子1、翻译释放因子2、翻译释放因子3、核糖体循环因子、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶、肌酸激酶、肌激酶、二磷酸核苷激酶、焦磷酸酶和22种氨酰-tRNA合成酶。
4.根据权利要求3所述多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，所述重组元件蛋白质合成体系还包括T7 RNA聚合酶、二硫键异构酶、分子伴侣蛋白中的至少一种。
5.根据权利要求1所述多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，所述表达溶菌蛋白的载体为表达噬菌体φX174 E蛋白的质粒ePop。
6.一种多蛋白体系的共生产系统，其特征在于，包括：
共表达菌株制备单元，用于制备多种共表达菌株，每种所述共表达菌株表达所述多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的所述共表达菌株表达的蛋白各不相同，具体为：提供表达溶菌蛋白的载体、多种表达蛋白的载体及蛋白表达菌株，每种所述表达蛋白的载体分别表达所述多蛋白体系中的一种蛋白，且不同的所述表达蛋白的载体表达的蛋白各不相同；将所述表达溶菌蛋白的载体与每种所述表达蛋白的载体分别共转入到所述蛋白表达菌株中，得到多种共表达菌株；其中，当所述共表达菌株的生长密度达到自主裂解密度时，所述溶菌蛋白使菌株发生自主裂解；
细胞培养单元，用于培养所述共表达菌株单元中的共表达菌株，具体为：将全部的所述共表达菌株进行共培养，当所述共表达菌株的生长密度达到自主裂解密度时发生自主裂解，释放出各自表达的蛋白，培养基上清中得到所述多蛋白体系；
其中，所述多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶。
7.根据权利要求6所述多蛋白体系的共生产系统，其特征在于，所述多蛋白体系选自聚酮化合物合成酶体系、非核糖体多肽合成酶体系、重组元件蛋白质体系中的至少一种。
8.根据权利要求7所述多蛋白体系的共生产系统，其特征在于，所述重组元件蛋白质体系包括翻译起始因子1、翻译起始因子2、翻译起始因子3、翻译延伸因子G、翻译延伸因子Tu、翻译延伸因子Ts、翻译延伸因子4、翻译释放因子1、翻译释放因子2、翻译释放因子3、核糖体循环因子、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶、肌酸激酶、肌激酶、二磷酸核苷激酶、焦磷酸酶和22种氨酰-tRNA合成酶。
9.根据权利要求8所述多蛋白体系的共生产系统，其特征在于，所述重组元件蛋白质体系还包括T7 RNA聚合酶、二硫键异构酶、分子伴侣蛋白中的至少一种。
10.权利要求6-9任意一项所述多蛋白体系的共生产系统在体外合成蛋白质和/或化合物中的应用。
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