CN107435057B

CN107435057B - 采用大肠埃希氏菌jl-hyp发酵生产羟脯氨酸的方法

Info

Publication number: CN107435057B
Application number: CN201710688313.4A
Authority: CN
Inventors: 刘帅; 王卫富; 谢沛; 刘晓东; 刘小都; 李静
Original assignee: Henan Julong Biomedical Co Ltd
Current assignee: Henan Julong Biomedical Co Ltd
Priority date: 2017-08-12
Filing date: 2017-08-12
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2037-08-12
Also published as: CN107435057A

Abstract

本发明涉及采用大肠埃希氏菌JL‑HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，包括以下步骤，大肠埃希氏菌JL‑HYP菌株经斜面活化，再经梯度稀释，涂布于LB培养基上，培养后，挑取单个菌落分别接种到LB斜面培养基上，置于生化培养箱30‑36℃培养12h；从LB斜面培养基上挑取单个菌落接种到装有种子培养基的种子瓶中培养；将种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行培养30‑45h，得到含有羟脯氨酸的发酵液；提取含有羟脯氨酸的发酵液中的羟脯氨酸；本发明该工艺发酵周期短，菌体密度高，羟脯氨酸的产量和得率高。本发明发酵周期短，菌体密度高，羟脯氨酸的产量和得率高。

Description

采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生产羟脯氨酸的方法，具体的说是采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法。

背景技术

羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，全名为，顺式-4-羟基-L-脯氨酸;是L-脯氨酸羟基化后的产物，其分子式为C₅H₉NO₃。羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274℃，易溶于水，微溶于乙醇。

目前，国内外报道的生产羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工业生产方法。但是，蛋白水解提取法需经过强酸强碱处理，纯化步骤长，而且羟脯氨酸提取率在4％-7％，提取和原料成本高，不仅浪费大量原料，而且废弃物污染严重，随着目前环境压力的增加和资源原料价格的上升，传统的蛋白水解提取法正逐渐被市场淘汰。微生物发酵法正以其绿色环保的工艺、原料和成本低廉的优势迅速发展起来。

微生物发酵法生产羟脯氨酸的研究还处于实验室阶段，尚未形成成熟的工业化生产工艺，而先进的工业化生产工艺，尤其是菌种的固体培养配方及方法对于羟脯氨酸的发酵单位、成本和三废排放有重要影响。福建师范大学黄建忠等人利用大肠杆菌HYP035(Escherichia#coli.HYP035)生产羟脯氨酸,其发酵液中羟脯氨酸产量为45g/L，脯氨酸的转化率达到85％,发酵周期为40h。江南大学张震宇等人利用重组大肠杆菌发酵生产羟脯氨酸,通过利用脯氨酸-4-羟化酶基因和色氨酸启动子序列,先优化设计色氨酸串联启动子和脯氨酸-4-羟化酶结构基因,然后全基因合成色氨酸串联启动子基因和脯氨酸-4-羟化酶结构基因后,将启动子和结构基因连接到pAMP质粒上,构建了可过量表达脯氨酸-4-羟化酶的重组质粒pAMP-P2trp-Hyp,将该重组质粒导入大肠杆菌，构建出重组大肠杆菌；摇瓶发酵结果表明,该重组大肠杆菌的羟脯氨酸的产量达到0.31g/L。

另外，现有技术中自发酵液中分离提取羟脯氨酸，通常采用离子交换方法，将除去菌体的发酵液在特定的pH条件下上柱，让羟脯氨酸吸附在离子交换柱上，随后用去离子水对离子交换柱充分洗涤，除去杂质，然后用洗脱液将羟脯氨酸从离子交换柱上洗脱，得到羟脯氨酸溶液，再经过结晶和干燥，得到羟脯氨酸产品。该方法存在以下缺陷：①羟脯氨酸易氧化，收率不稳定；②粗羟脯氨酸杂质多、色泽深，影响精制收率及产品质量。③耗水量大，酸碱用量大，在生产过程中会产生大量的废渣和废水对环境造成非常严重的污染。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，该工艺发酵周期短，菌体密度高，羟脯氨酸的产量和得率高。

采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：

步骤一、大肠埃希氏菌JL-HYP菌株经斜面活化，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于LB培养基上，培养后，挑取单个菌落分别接种到LB斜面培养基上，置于生化培养箱30-36℃培养12h；从LB斜面培养基上挑取单个菌落接种到装有种子培养基的种子瓶中培养，培养条件：温度30-36℃、摇床转速200rmp、培养时间6-8 h；当OD值长到1.0-2.0时，得到种子液，备用；

步骤二、将种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行培养30-45h，得到含有羟脯氨酸的发酵液；接种量：5-15%；培养条件：初始发酵温度32-38℃，空气流量5-50L/min和搅拌速度200-800r/min使溶氧维持在10-40%，发酵pH值控制在7.0-7.2之间；

步骤三、提取含有羟脯氨酸的发酵液中的羟脯氨酸：将发酵液加热到40-60℃，用2mo1/L盐酸调节pH至2-5，过30nm陶瓷膜微滤，纯化水清洗2-3次；将上清液过强酸性阳离子交换柱，条件为：静态吸附，按20%体积比加入阳离子树脂，搅拌吸附1h；动态吸附，按15%体积装柱树脂，流速按2BV/h进料，末期用0.5-1BV水冲柱；收集上清液；在上清液中按其体积0.5-1%的量加入活性炭，60℃脱色0.5-2h，过滤除炭；收集得到羟脯氨酸上清液进行真空浓缩，得到羟脯氨酸；

所述大肠埃希氏菌JL-HYP，分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为CGMCCNO.13922，保藏日期为2017年3月23日。

所述种子培养基中包括葡萄糖20-30g/L，K₂HPO₄10-20g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5-3.0g/L，KH₂PO₄10-20g/L，酵母粉0.5-5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 5-10.0g/L，微量元素储备液5-10.0mL/L，余量为水，pH 6-7；

所述发酵培养基中包含葡萄糖20-30g/L，K₂HPO₄10-20g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5-3.0g/L，酵母粉0.5-3.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 5-10.0g/L，微量元素储备液5-10.0mL/L，余量为水， pH 6-8；

所述微量元素储备液中包含FeSO₄ 1.0-3.0g/L，MnSO₄ 0.2-1.0g/L和ZnSO₄ 0.2-1.0g/L。

所述真空浓缩的条件为真空度-0.1MPa，旋转速度100-200rpm，温度50℃-80℃。

有益效果是：

1、大肠埃希氏菌JL-HYP发酵为好氧发酵，菌体生长快；发酵过程简单，环境污染低，降低了羟脯氨酸的生产成本，有利于工业化生产的推广和应用。本发明中的发酵周期短（30-45h），菌体密度大（OD=120-180）。羟脯氨酸的产量和得率高、细胞培养时间和生产周期短、单位菌体羟脯氨酸生产水平高的优点。

2、本发明提取步骤简单，易于控制，回收率高，纯度高的优点。过膜速度快、提取过程中羟脯胺酸比较稳定，不易分解；大大缩短了整个提取周期和成品纯度较高。本发明能够实现提取生产过程的废渣废水零排放，彻底根除羟脯氨酸生产过程中环境污染问题。

生物材料的保藏

大肠埃希氏菌JL-HYP，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏日期为2017年3月23日，保藏单位及其简称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为CGMCC No. 13922。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1

分别取大肠埃希氏菌JL-HYP和普通的产羟脯氨酸的大肠杆菌接种到斜面，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基（LB）上，挑取单个菌落分别接种到斜面上，生化培养箱30-36℃培养12h左右。接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度30-36℃、摇床转速200rmp、培养时间6-8 h；当OD值长到1.0-2.0左右时，接种到500ml发酵瓶中，接种量：7%左右，培养条件：温度30-36℃、摇床转速200rmp，发酵周期30-45h。发酵结束后检测羟脯氨酸含量为23.65g/L和18.37g/L，产量提高了28.74%。

实施例2

分别从新鲜斜面上挑取大肠埃希氏菌JL-HYP和普通的产羟脯氨酸的大肠杆菌一环接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度30-36℃、摇床转速200rmp、培养时间6-8h；当OD值长到1.0-4.0左右时，将摇瓶种子以10%的接种量接入装有3L发酵培养基的5L全自动发酵罐中进行二级种子培养。培养温度30-36℃，罐压0.01-0.05MPa，空气流量1-8L/min和搅拌速度200-800r/min使溶氧维持在10-50%，pH值控制在7.0-7.2之间，培养时间为5-8h。将二级种子以10%接种量接入装有18L发酵培养基的30L全自动发酵罐中进行产酸发酵。发酵温度30-36℃，罐压0.01-0.15MPa，空气流量5-50L/min和搅拌速度200-800r/min使溶氧维持在10-40%，发酵pH值控制在7.0-7.2之间，继续培养30-45h。检测羟脯氨酸含量为75.34g/L和61.84g/L，产量提高了21.83%。

实施例3

分别从新鲜斜面上挑取大肠埃希氏菌JL-HYP和普通的产羟脯氨酸的大肠杆菌一环接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度30-36℃、摇床转速200rmp、培养时间6-8h；当OD值长到1.0-4.0左右时，将摇瓶种子接入装有0.6m³发酵培养基的2m³发酵罐中进行二级种子培养。培养温度30-36℃，罐压0.01-0.05MPa，空气流量0.1-0.6m³/min和搅拌速度100-300r/min使溶氧维持在10-50%，pH值控制在7.0-7.2之间，培养时间为5-8h。将二级种子以10%接种量接入装有6m³发酵培养基的10m³发酵罐中进行产酸发酵。发酵温度30-36℃，罐压0.01-0.15MPa，空气流量0.5-7 m³/min和搅拌速度200-800r/min使溶氧维持在10-40%，发酵pH值控制在7.0-7.2之间，继续培养30-45h。检测羟脯氨酸含量为59.23g/L和50.87g/L，产量提高了16.43%。

实施例4

将上述发酵液加热到40-60℃，用2mo1/L硫酸调节pH至2-5范围内，过30nm陶瓷膜微滤，纯化水清洗2-3次，得到上清液,取上清液过5000-10000分子量的中空纤维束膜，此时羟脯氨酸回收率为95.3-98.4%。将上清液过强酸性阳离子交换柱，条件为静态吸附：按20%体积比加入阳离子树脂，搅拌吸附1h；动态吸附：按15%体积装柱树脂，流速按2BV/h进料，末期用0.5-1BV水冲柱；收集上清液。将上清液按体积比0.5-1%加入活性炭60℃脱色0.5-2h，过滤除炭。收集得到羟脯氨酸上清液进行真空浓缩，按照下列条件进行:真空度-0.1MPa，旋转速度100-200rpm，温度50℃-80℃浓缩。将羟脯氨酸浓缩液进行降温结晶。提取收率为70.0-88.5%。

大肠杆菌JL-HYP的筛选方法：

1、大肠杆菌的定向选育：从产羟脯氨酸的原始大肠菌株中经原生质体紫外诱变、紫外诱变以及硫酸二乙酯（DES）化学诱变，被赋予脯氨酸和羟脯氨酸抗性的遗传标记，再经分离纯化（梯度稀释后、涂平板、培养，然后挑去单菌落）获得羟脯氨酸高产菌株。原生质体紫外诱变方法：取制备好的原生质体3-5ml，加入到直径5cm的平皿中，置于20w的紫外灯下，垂直照射30-120s，然后用移液枪吸取0.2ml涂布于培养皿中，避光28-35℃培养36-60h。硫酸二乙酯（DES）化学诱变方法：用羟脯胺酸高产菌株斜面菌株经一级种子培养后，离心沉降10min(3000-7000r\min)，收集菌体，用无菌水洗涤菌体2-3次，再次离心收集菌体，加入ph=7.0的磷酸盐缓冲液至原体积，用浓度为1%（v\v）的硫酸二乙酯处理20-60min，用无菌水稀释后，进行一级培养。

2、遗传稳定性试验：将1中获得羟脯氨酸高产菌株进行单菌落分离，连续摇瓶传代10代，并进行遗传标记实验和摇瓶发酵产酸试验，选择遗传标记和产酸率稳定的菌株用于进一步研究。摇瓶传代方法：把羟脯胺酸高产菌株从斜面上转接到要瓶中，待培养到对数生长期转接第二代摇瓶。

3、中国科学院微生物研究所对大肠埃希氏菌JL-GlcN进行了形态、生理形态、16RS基因，以及Antibiotics sensitivity检测，结果显示：

1）、大肠埃希氏菌JL-HYP完整的16srDNA序列（其基因序列如SEQ NO.1所示），recN序列（其基因序列如SEQ NO.2所示）进行NCBI blast分析，比对结果与大肠埃希氏菌有100%的相似性。序列比对的结果结合形态和生理生化特征，表明属于菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。

2）、细胞现状和理化试验结果如下：

表1：

表2：

表3：

本发明相关对比实验：

分两组分别发酵实验，每组多次进行500ml摇瓶、30L发酵罐和10m³发酵罐培养，取平均值；其中A组采用本发明中的工艺，将大肠埃希氏菌JL-HYP作为菌种进行发酵生产羟脯氨酸；B组采用常规工艺和普通生产羟脯氨酸的大肠杆菌；

发酵结束后，分别计算两组实验的产羟脯氨酸率和糖酸转化率；具体计算方法为：羟脯氨酸产量=发酵液中羟脯氨酸总质量/发酵液体积；糖酸转化率=（发酵液体积L*羟脯氨酸产量g/L）/发酵总耗糖量g；结果如表4所示：

表4：

实验结果显示，本发明中的工艺方法与普通的工艺相比较，羟脯氨酸产量和糖酸转化率均有大幅度的提高，具有显著的进步，更适合于工艺生产。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南宏大生物医药有限公司

<120> 采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1429

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 1

acacatgcag tcgaacggta acaggaagca agcttgcttg cttcgctgac gagtggcgga 60

cgggtgagta atgtctggga aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc 120

taataccgca taacgtcgca agacaaagag ggggaccttc gggcctcttg ccatcggatg 180

tgcccagatg ggattagcta gtaggtgggg taacggctca cctaggcgac gatccctagc 240

tggtctgaga ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag 300

gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtatg 360

aagaaggcct tcgggttgta aagtactttc agcggggagg aagggagtaa agttaatacc 420

tttgctcatt gacgttaccc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg 480

taatacggag ggtgcaaggt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcacg caggcggttt 540

gttaagtcag atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcatctgat actggcaagc 600

ttgagtctcg tagagggggg tagaattcca ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg 660

aggaataccg gtggcgaagg cggccccctg gacgaagact gacgctcagg tgcgaaagcg 720

tggggagcaa acaggattag atacctggta gtccacgccg taaacgatgt cgacttggag 780

gttgtgccct tgaggcgtgg cttccggagc taagcgttaa gtcgaccgcc tggggagtac 840

ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 900

gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctggtcttg acatccacgg aagttttaga 960

gatgagaatg tgccttcggg aaccgtgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020

ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcctttg ttgccagcgg 1080

tccggccggg aactcaaagg agactgccag tgataaactg gaggaaggtg gggatgacgt 1140

caagtcatca tggcccttac gaccagggct acacacgtgc tacaatggcg catacaaaga 1200

gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc ataaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc 1260

tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgt ggatcagaat gccacggtga 1320

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaaaagaa 1380

gtaggtagct taaccttcgg gagggcgctt accactttgt gattcatga 1429

<210> 2

<211> 828

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 2

atcgttcgtg agcttgagat tgattttcat agcggcatga ccgtaataac tggcgagacc 60

ggcgcgggta aatctattgc aatagatgcc ctcggtcttt gtctcggtgg tcgcgctgaa 120

gccgacatgg tgcgtaccgg cgctgctcgc gctgacctgt gcgccgtttt tctctgaaag 180

atacgccagc ggctctgcgc tggctggaag aaaaccagct tgaagacggg catgaatgtt 240

tgcttcgtcg cgtgatcagc agcgatggtc gctcccgtgg tttcatcaac ggtacagctg 300

ttcctctgtc acaactggcg aactgggtca gttgctgatt cagatccatg gtcagcacgc 360

tcatcaatta ctcaccaaac ctgagcacca aaaattcctg cttgatggct atgccaatga 420

aacctctcta ctgcaggaaa tgaccgcacg ttatcagttg tggcatcaaa gctgccgtga 480

cctcgcgcat catcaacagt taagtcagga acgcgccgcc cgtgcggaac tgctgcaata 540

ccaattaaaa gaacttaacg aatttaatcc gcagcccgga gagtttgaac aaatcgacga 600

agagtacaaa cgtctggcga acagcggtca attgctgacc accagccaga atgcattgga 660

ttaatggccg acggtgaaga cgcaaacctg caaagtcagc tttaacggct aaacaactgg 720

tgagcgaatt gattggcatg gacagcaaac tgtccggcgt acttgatatg ctggaagaag 780

ctaccatcca gattgctgaa gccagcgatg aactgcgcca ctactgcg 828

Claims

1.采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、大肠埃希氏菌JL-HYP菌株经斜面活化，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于LB培养基上，培养后，挑取单个菌落分别接种到LB斜面培养基上，置于生化培养箱30-36℃培养12h；从LB斜面培养基上挑取单个菌落接种到装有种子培养基的种子瓶中培养，培养条件：温度30-36℃、摇床转速200rpm、培养时间6-8 h；当OD值长到1.0-2.0时，得到种子液，备用；

所述大肠埃希氏菌JL-HYP，分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli ），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为CGMCCNO.13922，保藏日期为2017年3月23日。

2.如权利要求1所述大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述种子培养基包括葡萄糖20-30g/L，K₂HPO₄10-20g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5-3.0g/L，KH₂PO₄10-20g/L，酵母粉0.5-5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 5-10.0g/L，微量元素储备液5-10.0mL/L，余量为水，pH 6-7；所述微量元素储备液中包含FeSO₄ 1.0-3.0g/L，MnSO₄ 0.2-1.0g/L和ZnSO₄ 0.2-1.0g/L 。

3.如权利要求1所述大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基中包含葡萄糖20-30g/L，K₂HPO₄10-20g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5-3.0g/L，酵母粉0.5-3.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 5-10.0g/L，微量元素储备液5-10.0mL/L，余量为水， pH 6-8；所述微量元素储备液中包含FeSO₄ 1.0-3.0g/L，MnSO₄ 0.2-1.0g/L和ZnSO₄ 0.2-1.0g/L。

4.如权利要求1-3其中之一所述大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述真空浓缩的条件为真空度-0.1MPa，旋转速度100-200rpm，温度50℃-80℃。