CN110408672B - 一种从d-乳酸废液中提取d-乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于生物工程技术领域，提供了一种从D‑乳酸废液中提取D‑乳酸的方法，包括：将经过D‑乳酸耐受驯化的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌进行混合培养得到发酵种子液；向有D‑乳酸废液的发酵罐中接入发酵种子液，接种量为10~15%，在45~52℃温度条件下进行厌氧发酵，控制厌氧发酵期间发酵液pH值至6.5~6.8，当发酵液中的残糖含量下降至0.3~0.4g/dL后停止发酵；将待分离发酵液进行分离除杂处理。经过乳酸耐受力驯化的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌可在高浓度的乳酸废液中存活，D‑乳酸废液不必稀释即可发酵培养，减少后续提取的浓缩成本，且经过发酵消耗D‑乳酸废液中的残糖后，利于提高D‑乳酸的提取效率和纯度。

Description

一种从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法。
背景技术
乳酸是世界三大有机酸之一，它可以广泛的用于食品、医药、化工和农业等领域。而高光学纯度D-乳酸(97％以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体，是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成。
目前，D-乳酸的生产方法主要采用生物发酵法，而采用生物发酵法生产D-乳酸的过程中会产生大量的D-乳酸废液，而大量的D-乳酸废液中仍然含有一定量的D-乳酸，如果直接将D-乳酸废液排放到外界，不但会污染环境，而且还会因此而损失D-乳酸废液中的D-乳酸，而将D-乳酸废液交给污水处理公司进行处理，处理的成本很高。
考虑到上述因素，D-乳酸生产厂家一般会对D-乳酸废液进行重提取，而现有的D-乳酸重提取方法主要有萃取法、高分子树脂吸附法和分子蒸馏法，但是这些方法均不能很好地将D-乳酸从D-乳酸废液中重提取完全，并且在重提取期间还会夹带有其他的杂质(如色、胶黏物质等)，从而导致重提取得到的D-乳酸的纯度不高，重提取率低，成本高。
发明内容
本发明实施例提供一种从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，旨在解决现有的D-乳酸提取方法提取效率低和提取得到的D-乳酸的纯度不高、成本高的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，包括如下步骤：
将经过D-乳酸耐受驯化的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌进行混合培养，得到发酵种子液；向有D-乳酸废液的发酵罐中接入所述发酵种子液，接种量为10～15％，搅拌使发酵种子液与D-乳酸废液混合均匀，在45～52℃温度条件下进行厌氧发酵，控制厌氧发酵期间发酵液pH值至6.5～6.8，当发酵液中的残糖含量下降至0.3～0.4g/dL后，停止发酵，得到待分离发酵液；将所述待分离发酵液进行固液分离、浓缩、酸解、除杂和蒸馏处理，得到所述D-乳酸产品。
本发明实施例提供的D-乳酸提取方法，采用经过乳酸耐受力驯化的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌作为发酵种子液，其可以在高浓度的乳酸废液中存活，以D-乳酸废液作为发酵原料时，不必稀释即可发酵培养，不但省略了稀释的工序，并且可提高后续D-乳酸提取过程中浓缩的成本；其次，选用的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌可发酵多种单糖和多糖，并且耗糖能力强，因此可以将D-乳酸废液中残糖消耗掉，提高了后续对D-乳酸的提取效率和纯度。
附图说明
图1是本发明实施例提供的D-乳酸提取方法提取得到的D-乳酸的光学纯度的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本发明实施例提供的D-乳酸提取方法，通过提取之前采用的经过乳酸耐受力驯化的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌作为发酵种子液，发酵消耗D-乳酸废液中的残糖，可提高后续提取过程的浓缩效率和效果，节省浓缩成本，并且有利于提高D-乳酸的提取效率和纯度。
本发明实施例提供了一种从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，包括如下步骤：
将经过D-乳酸耐受驯化的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌进行混合培养，得到发酵种子液；向有D-乳酸废液的发酵罐中接入所述发酵种子液，接种量为10～15％，搅拌使发酵种子液与D-乳酸废液混合均匀，在45～52℃温度条件下进行厌氧发酵，控制厌氧发酵期间发酵液pH值至6.5～6.8，当发酵液中的残糖含量下降至0.3～0.4g/dL后，停止发酵，得到待分离发酵液；将所述待分离发酵液进行固液分离、浓缩、酸解、除杂和蒸馏处理，得到所述D-乳酸产品。
在本发明实施例中，长双歧杆菌购自CICC菌种保藏库，编号6068，蜡样芽孢杆菌购自CICC菌种保藏库，编号10040。
在本发明实施例中，D-乳酸废液中含有丰富的糖、蛋白、盐类等营养成分，利用长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌消耗D-乳酸废液中的糖类，发酵液经提取纯化后得到光纯度99％以上的D-乳酸产品。
本发明实施例提供的D-乳酸提取方法，采用经过乳酸耐受力驯化的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌作为发酵种子液，其可以在高浓度的乳酸废液中存活，以D-乳酸废液作为发酵原料时，不必稀释即可发酵培养，不但省略了稀释的工序，并且可提高后续D-乳酸提取过程中浓缩的成本；其次，选用的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌可发酵多种单糖和多糖，并且耗糖能力强，因此可以将D-乳酸废液中残糖消耗掉，提高了后续对D-乳酸的提取效率和纯度。
进一步的，所述将经过D-乳酸耐受驯化的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌进行混合培养，得到发酵种子液的步骤，具体包括：以D-乳酸含量5％的D-乳酸废液配置培养基培养长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌，筛选出生长良好的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌，并按照2％的梯度逐步递增培养液中的D-乳酸含量，重复上述培养步骤，筛选得到可在D-乳酸含量30～40％的D-乳酸废液中生长的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌，即得发酵种子液。
在本发明实施例中，一般D-乳酸废液中的D-乳酸含量在40％左右，以D-乳酸含量5％为初始浓度将D-乳酸废液进行稀释，pH调至6.5左右配制固体平板，37℃培养24小时，筛选出菌落较大的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌，然后以2％为梯度逐步增加D-乳酸含量，重复上述实验筛选生长良好的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌，进行D-乳酸耐受驯化实验，直至筛选至可在D-乳酸含量30％～40％的D-乳酸废液平板上生长的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌。
进一步的，在所述向有D-乳酸废液的发酵罐中接入所述发酵种子液的步骤之前，包括：将所述发酵种子液放置在摇床中，并于37℃温度条件下厌氧培养至OD600为1.2。OD600指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应地与样品的透过率T值成反比，在数值上来说，它们之间是对数关系。通过测定OD600可以得知发酵种子液中的菌种的生长情况，一般OD600数值如果在0.6～0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD600为1.2时，菌种生长比较好，此时可以进行转代操作。
将发酵种子液置于摇床中，可以使得发酵种子液在摇床的晃动作用下，可使得菌种与营养液混合均匀，有利于均衡菌种获得的营养成分，促进菌种的生长，缩短培养时间。
进一步的，所述向有D-乳酸废液的发酵罐中接入所述发酵种子液，接种量为10～15％，搅拌使发酵种子液与D-乳酸废液混合均匀的步骤，具体包括：
向有D-乳酸废液的发酵罐中接入所述发酵种子液，接种量为10～15％，搅拌使发酵种子液与D-乳酸废液混合均匀，搅拌转速为100～150rpm。接种量是指移入发酵种子液的体积和接种后的培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。本发明实施例优选接种量为10～15％。适当的搅拌可以使得发酵种子液和D-乳酸废液混合均匀，同时不会破坏发酵种子液的生长。
进一步的，所述控制厌氧发酵期间发酵液pH值至6.5～6.8的步骤，具体包括：用氢氧化钙调节发酵液的pH值至6.5。
在本发明实施例中，从经过乳酸耐受驯化的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌的MRS固体培养平板上各取一环菌接入MRS液体摇瓶(500mL摇瓶中装液量100mL)，放置摇床中，设置温度37℃，厌氧培养至OD6001.2后，将发酵种子液接入发酵罐中，以D-乳酸废液为原料，通过稀释控制乳酸含量在20％左右，用氢氧化钙调pH至6.5后进行厌氧发酵。
进一步的，将所述待分离发酵液进行固液分离、浓缩、酸解、除杂和蒸馏处理的步骤，具体包括：
将所述待分离发酵液进行固液分离，去除待分离发酵液中过量的钙、菌体和粗杂质，得到发酵清液。优选的，将所述待分离发酵液加热至80～85℃，趁热过滤去除待分离发酵液中过量的钙、菌体和粗杂质，用蒸馏水冲洗，控制清液透光率>95％，过滤分离的压力4～5Kpa，得到发酵清液。
对所述发酵清液进行浓缩处理，得到乳酸钙含量为27～28％的发酵浓缩液。具体的，可将上述发酵清液输入至蒸发器中进行浓缩，使发酵清液中的乳酸钙含量从10％左右浓缩至28％左右。
对所述发酵浓缩液进行酸解，得到发酵酸解液。具体的，可以用浓硫酸将所述发酵浓缩液的pH值调至1.5进行酸解，得到发酵酸解液。经酸解后，发酵浓缩液形成硫酸钙和乳酸铵，待钙含量达到预设值之后进行真空过滤。
去除所述发酵酸解液中的残留的色素和离子杂质后，浓缩其至D-乳酸含量在85％～88％，得到浓缩液。可选的，对所述发酵酸解液进行碳柱脱色、阳离子交换、阴离子交换处理，去除其中的残留的色素和离子杂质后，浓缩其至D-乳酸含量在85％～88％，得到浓缩液。将过滤后的发酵酸解液用活性炭进行脱色，测得吸光度在45％左右，停止脱色；脱色后的清液进入阳离子交换树脂柱，去除清液中残留的钙离子，测定交换后的收集液的钙含量，当检测到交换后的收集液不含有钙离子时；将收集液进入阴离子交换树脂柱，去除氯离子和硫酸根离子，对交换出液进行测定，当检测该交换出液中不含有到氯离子及硫酸根离子时，对交换出液进行浓缩至乳酸含量在85％，再进一步进行对该浓缩液进行分子蒸馏提纯，采用高效液相色谱法测定D-乳酸的光学纯度，检测结果如图1和下表1所示。
表1
Figure BDA0002157207150000061
可选的，还可采用对所述发酵酸解液进行萃取处理，去除其中的残留的色素和离子杂质后，浓缩其至D-乳酸含量在85％～88％，得到浓缩液。
示例性的，可采用溶剂萃取法对发酵酸解液进行萃取处理，例如，可用异丙醚进行萃取，并与吸附、离子交换法结合使用，具体的，先将发酵酸解液加热至80℃，然后经过滤、脱色处理后，进行离子交换、浓缩、萃取。
为了进一步说明本发明实施例提供的D-乳酸提取方法所取得的技术效果，以下通过试验例做进一步的说明。
试验一、
试验组1选用本发明实施例提供的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌作为发酵菌种；试验组2单独采用本发明实施例提供的长双歧杆菌作为发酵菌种；试验组3单独采用本发明实施例提供的蜡样芽孢杆菌作为发酵菌种；试验组4采用菊糖芽孢乳杆菌作为发酵菌种。
试验期间，除了采用的发酵菌种不同之外，其他试验条件均相同，试验48小时结束，对发酵48小时后的发酵液进行质量检测，试验结果详见下表2：
表2
Figure BDA0002157207150000071
从上表2的试验结果可以看出，采用长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌作为发酵菌相较于单独采用长双歧杆菌或蜡样芽孢杆菌或者菊糖芽孢乳杆菌，D-乳酸发酵的产量和光学纯度均较高。可见，采用长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌作为发酵菌有利于提高D-乳酸的产量及其光学纯度。
试验二、
1、发酵种子液的接种量的确定
分别向放置有等量的D-乳酸废液的发酵罐中接入发酵种子液，其中接种量分别为5％，10％，15％，20％，除了接种量不同之外，其他培养条件相同，培养48小时后，检测发酵液的D-乳酸含量(以乳酸计)和残糖量(乳酸含量用EDTA滴定乳酸钙法测定，残糖量用斐林试剂测定法测定)。测试结果见下表3。
表3
Figure BDA0002157207150000072
从上表3的试验结果可以看出，随着接种量的增加，发酵液的D-乳酸含量逐渐提高，残糖量呈下降趋势，考虑到D-乳酸含量高于40％时，不利于后续的过滤容易堵塞过滤膜，从而造成分离效果差，且分离效率低的问题，因此优选采用10％～15％的接种量，使得发酵液中的D-乳酸含量在30％～40％之间，既保证了D-乳酸的含量，又可提高从发酵液中分离出D-乳酸的效率和效果。
2、厌氧发酵温度的确定
改变厌氧发酵温度分别为40℃、45℃、50℃、52℃、60℃，其他发酵条件不变，培养48小时后，检测发酵液的D-乳酸含量(以乳酸计)和残糖量(乳酸含量用EDTA滴定乳酸钙法测定，残糖量用斐林试剂测定法测定)。测试结果见下表4。
表4
Figure BDA0002157207150000081
从上表4的试验结果中可以看出，随着厌氧发酵温度的升高，发酵液的D-乳酸含量逐渐提高，残糖量呈下降趋势，考虑到D-乳酸含量高于40％时，不利于后续的过滤容易堵塞过滤膜，从而造成分离效果差，且分离效率低的问题，因此，优选采用在45℃～52℃进行厌氧发酵，使得发酵液中的D-乳酸含量在30％～40％之间，既保证了发酵菌种的生长繁殖，消耗D-乳酸废液中的糖，并转化为D-乳酸，提高D-乳酸的含量，又可提高从发酵液中分离出D-乳酸的效率和效果。
3、搅拌速度的确定
改变搅拌速度分别为50rpm、100rpm、150rpm、200rpm，其他发酵条件不变，培养48小时后，检测发酵液的D-乳酸含量(以乳酸计)和残糖量(乳酸含量用EDTA滴定乳酸钙法测定，残糖量用斐林试剂测定法测定)。测试结果见下表5。
表5
Figure BDA0002157207150000091
从上表5的试验结果中可以看出，当搅拌速度在50rpm或200rpm时，其D-乳酸含量均低于搅拌速度在100rpm、150rpm时所得的D-乳酸含量，因此，本发明实施例优选搅拌速度在100rpm～150rpm，既利于搅拌使发酵种子液与D-乳酸废液充分混匀，利于发酵种子液利用D-乳酸中的营养成分繁殖生长，将D-乳酸中的糖转化为D-乳酸，并且利于后续的过滤分离操作，提高D-乳酸的得率以及光学纯度。
试验三、本发明实施例提供的D-乳酸提取方法的效果试验
对比例的工艺为：直接对D-乳酸废液进行固液分离、浓缩、酸解、除杂和蒸馏处理，得到D-乳酸产品，即省略了本发明提供的D-乳酸提取方法中对D-乳酸废液进行厌氧发酵的工艺。与采用本发明实施例提供的D-乳酸提取方法对D-乳酸废液进行D-乳酸提取，得到D-乳酸产品进行提取率和光学纯度测定，试验结果表明，采用本发明实施例提供的D-乳酸提取方法对D-乳酸废液进行D-乳酸提取，提取率可达85％以上，提取得到的D-乳酸的光学纯度可达到99.8％以上。
综上，本发明实施例提供的D-乳酸提取方法，采用经过乳酸耐受力驯化的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌作为发酵种子液，其可以在高浓度的乳酸废液中存活，以D-乳酸废液作为发酵原料时，不必稀释即可发酵培养，不但省略了稀释的工序，并且可提高后续D-乳酸提取过程中浓缩的成本；其次，选用的长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌可发酵多种单糖和多糖，并且耗糖能力强，因此可以将D-乳酸废液中残糖消耗掉，提高了后续对D-乳酸的提取效率和纯度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将经过D-乳酸耐受驯化的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌进行混合培养，得到发酵种子液；向有D-乳酸废液的发酵罐中接入所述发酵种子液，接种量为10~15%，搅拌使发酵种子液与D-乳酸废液混合均匀，在45~52℃温度条件下进行厌氧发酵，控制厌氧发酵期间发酵液pH值至6.5~6.8，当发酵液中的残糖含量下降至0.3~0.4g/dL后，停止发酵，得到待分离发酵液；将所述待分离发酵液进行固液分离、浓缩、酸解、除杂和蒸馏处理，得到所述D-乳酸产品。
2.如权利要求1所述的从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，所述将经过D-乳酸耐受驯化的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌进行混合培养，得到发酵种子液的步骤，具体包括：以D-乳酸含量5%的D-乳酸废液配置培养基培养长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌，筛选出生长良好的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌，并按照2%的梯度逐步递增培养液中的D-乳酸含量，重复上述培养步骤，筛选得到可在D-乳酸含量30~40%的D-乳酸废液中生长的长双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌，即得发酵种子液。
3.如权利要求1所述的从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，在所述向有D-乳酸废液的发酵罐中接入所述发酵种子液的步骤之前，包括：将所述发酵种子液放置在摇床中，并于37℃温度条件下厌氧培养至OD600为1.2。
4.如权利要求1或3所述的从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，所述向有D-乳酸废液的发酵罐中接入所述发酵种子液，接种量为10~15%，搅拌使发酵种子液与D-乳酸废液混合均匀的步骤，具体包括：向有D-乳酸废液的发酵罐中接入所述发酵种子液，接种量为10~15%，搅拌使发酵种子液与D-乳酸废液混合均匀，搅拌转速为100~150rpm。
5.如权利要求1所述的从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，所述控制厌氧发酵期间发酵液pH值至6.5~6.8的步骤，具体包括：用氢氧化钙调节发酵液的pH值至6.5。
6.如权利要求5所述的从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，将所述待分离发酵液进行固液分离、浓缩、酸解、除杂和蒸馏处理的步骤，具体包括：将所述待分离发酵液进行固液分离，去除待分离发酵液中过量的钙、菌体和粗杂质，得到发酵清液；对所述发酵清液进行浓缩处理，得到乳酸钙含量为27~28%的发酵浓缩液；对所述发酵浓缩液进行酸解，得到发酵酸解液；去除所述发酵酸解液中的残留的色素和离子杂质后，浓缩其至D-乳酸含量在85%~88%，得到浓缩液；对所述浓缩液进行分子蒸馏，得到所述D-乳酸产品。
7.如权利要求6所述的从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，所述将所述待分离发酵液进行固液分离的步骤，具体包括：将所述待分离发酵液加热至80~85℃，趁热过滤去除待分离发酵液中过量的钙、菌体和粗杂质，得到发酵清液。
8.如权利要求6所述的从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，所述对所述发酵浓缩液进行酸解，得到发酵酸解液的步骤，具体包括：用浓硫酸将所述发酵浓缩液的pH值调至1.5进行酸解，得到发酵酸解液。
9.如权利要求6所述的从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，所述去除所述发酵酸解液中的残留的色素和离子杂质后，浓缩其至D-乳酸含量在85%~88%，得到浓缩液的步骤，具体包括：对所述发酵酸解液进行碳柱脱色、阳离子交换、阴离子交换处理，去除其中的残留的色素和离子杂质后，浓缩其至D-乳酸含量在85%~88%，得到浓缩液。
10.如权利要求6所述的从D-乳酸废液中提取D-乳酸的方法，其特征在于，所述去除所述发酵酸解液中的残留的色素和离子杂质后，浓缩其至D-乳酸含量在85%~88%，得到浓缩液的步骤，具体包括：对所述发酵酸解液进行萃取处理，去除其中的残留的色素和离子杂质后，浓缩其至D-乳酸含量在85%~88%，得到浓缩液。
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