JP3736691B2 - バチルス属微生物を用いた高純度ｌ−乳酸の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バチルス属の特定種微生物を用いた高純度Ｌ−乳酸の製造方法に関し、より詳しくは、高純度Ｌ−乳酸を安価に製造する方法に関する。また、本発明は、バチルス属の特定種微生物を用いて高純度Ｌ−乳酸と殺虫性毒素とを同時に製造する方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−乳酸は、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料、食品、医薬品、醸造、皮なめし、光学材料等に用いられる。また、殺虫性毒素は、従来の農薬と異なり、人畜に無害な農薬として注目されているものである。
【０００３】
乳酸をポリ乳酸の原料として用いる場合、光学純度の高い乳酸を原料とする方が、結晶性の高いポリマーが得られる。このことは例えば、Kulkarni,R.K., Moore,E.G., Hegyeli,A.F., and Leonard,F. (1971) Biodegradable poly(lactic acid)polymers. J. Biomed. Mater. Res.（ジャーナル オブ バイオメディカルマテリアル リサーチ），5:169-181.や、Ohara,H. (1994) Poly-L-Lactic acid as biodegradable plastic. Biosci. Indust.（バイオサイエンスとインダストリー），52:642-644. に記載されている。そして、結晶性の高いポリ乳酸は、延伸フィルム、紡糸に適している。
【０００４】
また、高純度Ｌ−乳酸は液晶に使用可能であり、例えば、Sato,k., Eguchi,T., Toshida,y., Yoshinaga,K., and Takasu,Y. (1990) Properties of the ferroelectric polymer liquid crystals containing a chiral lactic acid derivative group. Polymer preprints, Japan,（高分子化学大会予稿集）39:1962-1964. や、Yoshinaga,K., Eguchi,T., Sato,K., Toshida,Y., and Takasu,Y. (1990) Properties of the ferroelectric polymer liquid crystals containing a chiral lactic acid derivative group(II). Polymer preprings, Japan,（高分子化学大会予稿集）39:1962-1964. に記載されている。
【０００５】
さらに、FAO （国連食糧農業機関）とWHO （世界保健機関）は、乳幼児に与える乳酸はＬ−乳酸であることが好ましいとしている。このことは、FAO and WHO (1974) Toxicological evaluation of certain food additives with a review of general principles and of specifications. World Health Organization, Geneva,p23. に記載されている。
【０００６】
このように、Ｌ−乳酸は有用であり、しかも高純度であることが要求されている。
【０００７】
従来より、発酵によりＬ−乳酸を製造する方法が知られている。例えば、
(1) ストレプトコッカス フェカリス(Streptococcus faecalis)を用いたＬ−乳酸の製造が、Ohara,H., Hiyama,K., and Yoshida,T. (1993) Lactic acid production by a filter-bed-type reactor. J. Ferment. Bioeng. （ジャーナル オブ ファーメンテーション アンド バイオエンジニアリング）76:73-75. に記載され、
(2) ラクトバチルス ヘルベティクス(Lactobacillus helvetics) を用いたＬ−乳酸の製造が、Aeschlimann,A., Di Stasei,L., and von Stockar,U. Continuous production of lactic acid from whey permeate by Lactobacillus helvetics in two chemostats in series. Enzyme Microbiol. Technol. （エンザイム マイクロバイオロジー アンド テクノロジー）12:926-932. に記載され、
(3) ラクトバチルス アミロボラス(Lactobacillus amylovorus)を用いたＬ−乳酸の製造が、Nakamura,L.K. and Crowell C.D. (1979) Lactobacillus amylovorus, a new starch-hydrolyzing species from swine waste-com fermentation. Div. Ind. Microbiol. 20:531-540.に記載され、
(4) ラクトバチルス デルブルッキー(Lactobacillus delbruekii)を用いたＬ−乳酸の製造が、Stenroos,S.L., Linko,Y.Y., and Linko,P. (1982) Production of L-lactic acid with immobilized Lactobacillus delbruekii. Bacteriol. Lett.（バイオテクノロジーレター）4:159-164.に記載され、
(5) ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)を用いたＬ−乳酸の製造が、Ishizaki,A. and Kobayashi,G. (1990) Computer simulation of L-lactate batch fermentation applying the enzyme inactivation scheme. J. Ferment. Bioeng. 70:139-140.に記載されている。
【０００８】
以上(1) 〜(5) は乳酸菌を用いたＬ−乳酸の製造である。しかし、これらの乳酸菌は栄養要求性が高く、培地がコスト高となる。乳酸菌を用いた乳酸製造の培地がコスト高になることは、Boer,J.P.de, Mattos,M.J.T.de, and Neijssel O.M. (1990) D(-)Lactic acid production by suspended and aggregated continuous cultures of Bacillus laevolacticus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34:149-153. に記載されている。培地がコスト高となれば、当然のことながら、製品としてのＬ−乳酸が高価なものとなる。
【０００９】
そこで、乳酸菌以外の菌を用いたＬ−乳酸の製造法も報告されている。例えば、リゾプス オリザエ(Rhizopus oryzae) によるＬ−乳酸の製造が、Tamada,M., Bagum,A.A., and Sadai,S. (1992) Production of L(+)-lactic acid by immobilized cells of Rhizopus oryzae with polymer supports prepared by γ ray induced polymerization. J. Ferment. Bioeng. 74:379-383.に記載されている。しかし、この方法では、発酵時間が４０〜５０時間と長く、生産効率が良くない。
【００１０】
また、バチルス ラエボラクティス(Bacillus laevolactis)によるＤ−乳酸製造は、前述の Appl. Microbiol. Biotechnol. 34:149-153. に報告があるが、Ｄ−乳酸ではしかたない。
【００１１】
また、バチルス コアグランス(Bacillus coagulans)によるＬ−乳酸の製造が、特開昭５８−４００９３号公報、特公昭６０−６２００号公報、米国特許US.5079164号明細書に記載されている。しかしながら、バチルス コアグランスは、本明細書の実施例で示すが本発明で用いる菌株に比べ栄養要求性が高く、生産されるＬ−乳酸の光学純度は７０％未満のものである。また、殺虫性毒素を作るバチルス コアグランス株は知られていない。
【００１２】
また、特開平３−２７２９１号公報には、バチルス コアグランスを用いた乳酸の製造法が記載されている。しかしながら、同号公報では、生産される乳酸がＬ−乳酸であることや、その光学純度については全く言及されていない。さらに、特開平２−７６５９２号公報にも、その請求項９にバチルス属を用いた乳酸の製造法が記載されているが、実際にバチルス属を用いてＬ−乳酸を生産したことは開示されていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決すべく、バチルス属の特定種の微生物を用いてＬ−乳酸を高純度で且つ安価に製造する方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、殺虫性毒素を生産する能力を有するバチルス属の特定種の微生物を用いて、高純度Ｌ−乳酸と殺虫性毒素とを同時に生産させ、トータルコストがより下げられた高純度Ｌ−乳酸の製造方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の高純度Ｌ−乳酸の製造方法は、資化可能な炭素源から光学純度７０％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有する、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus) 、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ラルバエ(Bacillus larvae) 、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・ポピラエ(Bacillus popilliae)およびバチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus) からなる群から選ばれる少なくとも一種のバチルス属(Bacillus)の微生物を培養し、この培養物から光学純度７０％以上のＬ−乳酸を採取することを特徴とするものである。
【００１５】
また、本発明のＬ−乳酸と殺虫性毒素とを同時に製造する方法は、資化可能な炭素源から光学純度７０％以上のＬ−乳酸および殺虫性毒素を生産する能力を有する、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ラルバエ(Bacillus larvae) 、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・ポピラエ(Bacillus popilliae)およびバチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus) からなる群から選ばれる少なくとも一種のバチルス属(Bacillus)の微生物を培養し、この培養物から光学純度７０％以上のＬ−乳酸と殺虫性毒素とを採取することを特徴とするものである。
【００１６】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００１７】
本発明において、バチルス属(Bacillus)の微生物として、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus) 、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ラルバエ(Bacillus larvae) 、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・ポピラエ(Bacillus popilliae)またはバチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus) を用いる。これらバチルス属微生物を用いることにより、Ｌ−乳酸を光学純度７０％以上の高純度で得ることができる。これら微生物のうち、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシスは、大変近縁であり同定上の区別が難しいものである。このことは、バージーズ マニュアル オブ システマティック バクテリオロジーの１１１３頁にも記載されている。また、これら３種株は、エッグヨークレシチナーゼ(Egg-yolk lecithinase)反応が陽性であることが特徴である。
【００１８】
また、本発明において、バチルス属の微生物として、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ラルバエ(Bacillus larvae) 、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・ポピラエ(Bacillus popilliae)またはバチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus) を用いることにより、高純度Ｌ−乳酸と共に殺虫性毒素を得ることができる。
【００１９】
本発明において用いる炭素源としては、グルコース以外に、シュークロース、マルトース、フラクトース、ラクトース、マンニット、デンプンなど資化可能な糖であれば限定されることはない。これら糖質の培地中の濃度は、通常２〜１５重量％程度である。
【００２０】
また、副原料として、ポリペプトン、チーズホエー、コーンスティープリカー、酵母エキスなど安価な原料を用いることができる。これら副原料の培地中の濃度は、通常０．１〜２重量％程度である。
【００２１】
また、培地中には、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、苛性ソーダ、塩酸、各種緩衝液等のｐＨ調整剤、マグネシウム化合物、マンガン化合物等を含むことができる。
【００２２】
菌体の培養は、通常STR (Stirred Tank Reactor)で回分式に行なうが、これに限らず、CSTR(Continuous Tank Reactor）で連続的に行なうこともできる。また、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、光硬化性樹脂等への固定化や膜型リアクター、電解透析型リアクターにより生産しても良い。膜型リアクターは、例えば、Dialysis（透析型）のものが、Coulman らによる、Applied Environmental Microbiology, 1977年34巻、725-732 頁や、Stieber and Gerhardtによる、Biotechnology and Bioengineering, 1981年２３巻、523-534 頁などに記載されている。また、Cross-Flow型の膜型リアクターは、Major and Bullによる、Biotechnology and Bioengineering, 1989年34巻592-599 頁などに記載されている。
【００２３】
培養のｐＨおよび温度は、用いる菌体にもよるが、通常ｐＨ６．０〜８．０、温度２５〜４０℃である。最適条件は、用いる菌体により定められる。
【００２４】
また、本発明において、培養は、好気的条件下で行うこともできるが、嫌気的条件下で行うことが好ましい。バチルス属は好気性または通性好気性の微生物であり、通常、通気等を行うことにより好気的に培養する。この様な好気的条件では、グルコース等の糖はピルビン酸からクレブス回路を経て代謝される。本発明ではバチルス属の微生物を嫌気的条件下で培養することにより、ピルビン酸からより高純度のＬ−乳酸を、より高変換率で得ることができる。
【００２５】
菌体の培地中への導入は、従来公知のいずれの方法により行なっても良く、また、生産されたＬ−乳酸および場合によっては得られる殺虫性毒素の分離精製も、従来公知のいずれの方法を用いても良い。
【００２６】
本発明によれば、資化可能な炭素源から光学純度７０％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有するバチルス属の微生物、すなわち、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ラルバエ、バチルス・レンチモルブス、バチルス・ポピラエまたはバチルス・スファエリカスを培養するので、光学純度７０％以上の高純度でＬ−乳酸を製造することができる。また、これらバチルス属の微生物は、乳酸菌より栄養要求性が低く安価な培地で培養できるので、より安価にＬ−乳酸を製造することができる。
【００２７】
さらに、本発明において、殺虫性毒素をも生産する能力を有するバチルス属の微生物、すなわち、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ラルバエ、バチルス・レンチモルブス、バチルス・ポピラエまたはバチルス・スファエリカスを培養する場合には、光学純度７０％以上のＬ−乳酸と殺虫性毒素とを同時に製造することができ、トータルコストとしてＬ−乳酸をより安価に製造することができる。
【００２８】
【実施例】
次に、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【００２９】
［実施例１］
バチルス・セレウス(Bacillus cereus) JCM 2152 をブレインハートインフュージョン培地（Becton Dickinson社製）で３４℃で１０時間培養し、これを種菌とした。この０．１ｍｌづつを２本の各試験管中の次の組成からなる液体培地１０ｍｌに植菌した。
ポリペプトンＳ（日本製薬製）１０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ、およびリン酸第２カリウム３５ｇ／ｌ：なお、この培地は１ＭのＨＣｌによって、ｐＨ７．０に調整した。
各試験管の口には通気可能な多孔質のシリコン栓をし、１本の試験管では嫌気的培養を行ない、他の１本の試験管では好気的培養を次のように行なった。
＜嫌気的培養＞
試験管をＢＢＫ ＧａｓＰａｋ（Becton Dickinson社製）に入れ、３４℃で１０時間、静置培養した。ガスパック中で行なったので、次の振盪培養よりも嫌気度が高い。
＜好気的培養＞
試験管をＢＢＫ ＧａｓＰａｋ（Becton Dickinson社製）に入れることなく、３４℃で１０時間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。
【００３０】
培養後、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を以下のようにして求めた。
【００３１】
＜乳酸生成量および消費グルコース量＞
乳酸生成量および消費グルコース量は、それぞれ培養液中の乳酸濃度（ｇ／ｌ）および消費グルコース量（ｇ／ｌ）として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により次の条件で定量した。なお、乳酸生成量は、Ｌ−体及びＤ−体の合計量である。
ＨＰＬＣ；（島津製作所製、ＬＣ−６Ａ）、検出器；示差屈折率計（ＲＩＤ−６Ａ、島津製作所製）、カラム；Shim-pack SCR-101H（島津製作所製）、カラム温度；６０℃、溶離液；２．５ｍｍｏｌの過塩素酸水溶液、流速；０．９ｍｌ／ｍｉｎ。
【００３２】
＜変換率＞
変換率は、
変換率（％）＝（乳酸生成量(g/l) ／消費グルコース量(g/l) ）×１００
で計算される。ここで、乳酸生成量は、Ｌ−体及びＤ−体の合計量である。
【００３３】
＜光学純度＞
Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される：
光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
培養液サンプルをＵＦ膜（ＵＦＰＩ，ミリポア）で濾過して、分子量５０００以上の分子をカットした。これを高速液体クロマトグラフィーにより測定し、培養液中のＬ−乳酸とＤ−乳酸の濃度を定量した。ＨＰＬＣ；（島津製作所製、ＬＣ−６Ａ）、検出器；分光計（島津製作所製、ＳＰＤ−６ＡＶ）、カラム；ＣＲＳ１０Ｗ（三菱化成製）、カラム温度；３０℃、検出波長；２５４ｎｍ、溶離液；２ｍＭのＣｕＳＯ4 、流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ。
【００３４】
［実施例２］
実施例１のバチルス・セレウス(Bacillus cereus) JCM 2152に代えて、菌株としてバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis) subsp.kurustaki ATCC 33679を用いた以外は、実施例１と同様の操作で培養を行ない、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を求めた。
【００３５】
［比較例１］
実施例１のバチルス・セレウス(Bacillus cereus) JCM 2152に代えて、菌株としてバチルス・コアグランス(Bacillus coagulans) JCM 2257 を用いた以外は、実施例１と同様の操作で培養を行ない、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を求めた。
【００３６】
［比較例２］
実施例１のバチルス・セレウス(Bacillus cereus) JCM 2152に代えて、菌株としてバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) JCM 1465を用いた以外は、実施例１と同様の操作で培養を行ない、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を求めた。
【００３７】
実施例１〜２、比較例１〜２の結果を表１に示す。
【表１】
【００３８】
表１より、菌株としてバチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシスを用いた場合は、高変換率で、しかも高い光学純度でＬ−乳酸が生成した。また、好気的培養に比べ嫌気的培養の方が、高い変換率と高い光学純度が得られた。一方、菌株としてバチルス・コアグランスを用いた場合は、好気的培養した場合でも乳酸生成量は少なく、光学純度も７０％に満たないものであった。嫌気的培養の場合は、乳酸生成が認められなかった。菌株としてバチルス・ズブチリスを用いた場合は、嫌気的及び好気的条件でいずれも乳酸を生成したが、その濃度及び変換率はそれぞれ、０．１ｇ／ｌ、２５．０％、３．７ｇ／ｌ、４９．３％と実用に耐えるものではなかった。
【００３９】
また、これらの結果で注目すべきは、グルコース以外の副原料としてポリペプトンＳで良いということであり、このことは、乳酸菌ではまずあり得ない。つまり、これらバチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシスの菌株が乳酸菌やバチルス・コアグランスよりも栄養要求性が低く、培地を選ばないということであり、より安価な培地で高純度のＬ−乳酸を生産できることが明かとなった。
【００４０】
［実施例３］
バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis) subsp.kurustaki ATCC 33679を、培地はポリペプトンＳ；１０ｇ／ｌ、リン酸アンモニウム；５ｇ／ｌ、およびグルコース１００ｇ／ｌからなる培地で培養した。培養は５００ｍｌの培養器（培養液量５００ｍｌ）を用い、３０℃、６０ｒｐｍで攪拌を行い、６Ｍ苛性ソーダによりｐＨを７．０に保った。また、嫌気的条件を保つため３０ｍｌ／ｍｉｎで窒素ガスを通気し、３０℃で１５時間培養した。培養液の乳酸濃度は９８ｇ／ｌであり、光学純度は９９．５％であった。
この培養液から遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分）により菌体を集菌したところ、湿重量にして３０ｇの菌体が得られ、位相差顕微鏡で観察したところ、０．６×２μの紡錘形結晶が観察された。
菌体を１５０ｗの超音波破砕機を用いて１０分間で破砕し、これをアメリカシロヒトリの幼虫２０匹に飼料として与えたところ、７匹が１時間以内に、１０匹が１時間から２時間以内に、３匹が２時間から５時間以内に死んだ。
このように、菌株としてバチルス・チューリンゲンシスを用いた場合は、高変換率で、しかも高い光学純度でＬ−乳酸が得られると共に、殺虫性毒素が同時に得られた。従って、トータルコストとしてＬ−乳酸をより安価に製造できることが明かとなった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、上述のように、非常に高い光学純度のＬ−乳酸を安価に製造することができる。さらに好ましい本発明の方法によれば、Ｌ−乳酸と共に殺虫性毒素を同時に製造することができ、トータルコストとして高い光学純度のＬ−乳酸をより安価に製造することができる。このように、本発明の方法は、従来の微生物を用いたＬ−乳酸製造法に比べ、非常に有用なものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、バチルス属の特定種微生物を用いた高純度Ｌ−乳酸の製造方法に関し、より詳しくは、高純度Ｌ−乳酸を安価に製造する方法に関する。また、本発明は、バチルス属の特定種微生物を用いて高純度Ｌ−乳酸と殺虫性毒素とを同時に製造する方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−乳酸は、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料、食品、医薬品、醸造、皮なめし、光学材料等に用いられる。また、殺虫性毒素は、従来の農薬と異なり、人畜に無害な農薬として注目されているものである。
【０００３】
乳酸をポリ乳酸の原料として用いる場合、光学純度の高い乳酸を原料とする方が、結晶性の高いポリマーが得られる。このことは例えば、Kulkarni,R.K., Moore,E.G., Hegyeli,A.F., and Leonard,F. (1971) Biodegradable poly(lactic acid)polymers. J. Biomed. Mater. Res.（ジャーナル オブ バイオメディカルマテリアル リサーチ），5:169-181.や、Ohara,H. (1994) Poly-L-Lactic acid as biodegradable plastic. Biosci. Indust.（バイオサイエンスとインダストリー），52:642-644. に記載されている。そして、結晶性の高いポリ乳酸は、延伸フィルム、紡糸に適している。
【０００４】
また、高純度Ｌ−乳酸は液晶に使用可能であり、例えば、Sato,k., Eguchi,T., Toshida,y., Yoshinaga,K., and Takasu,Y. (1990) Properties of the ferroelectric polymer liquid crystals containing a chiral lactic acid derivative group. Polymer preprints, Japan,（高分子化学大会予稿集）39:1962-1964. や、Yoshinaga,K., Eguchi,T., Sato,K., Toshida,Y., and Takasu,Y. (1990) Properties of the ferroelectric polymer liquid crystals containing a chiral lactic acid derivative group(II). Polymer preprings, Japan,（高分子化学大会予稿集）39:1962-1964. に記載されている。
【０００５】
さらに、FAO （国連食糧農業機関）とWHO （世界保健機関）は、乳幼児に与える乳酸はＬ−乳酸であることが好ましいとしている。このことは、FAO and WHO (1974) Toxicological evaluation of certain food additives with a review of general principles and of specifications. World Health Organization, Geneva,p23. に記載されている。
【０００６】
このように、Ｌ−乳酸は有用であり、しかも高純度であることが要求されている。
【０００７】
従来より、発酵によりＬ−乳酸を製造する方法が知られている。例えば、
(1) ストレプトコッカス フェカリス(Streptococcus faecalis)を用いたＬ−乳酸の製造が、Ohara,H., Hiyama,K., and Yoshida,T. (1993) Lactic acid production by a filter-bed-type reactor. J. Ferment. Bioeng. （ジャーナル オブ ファーメンテーション アンド バイオエンジニアリング）76:73-75. に記載され、
(2) ラクトバチルス ヘルベティクス(Lactobacillus helvetics) を用いたＬ−乳酸の製造が、Aeschlimann,A., Di Stasei,L., and von Stockar,U. Continuous production of lactic acid from whey permeate by Lactobacillus helvetics in two chemostats in series. Enzyme Microbiol. Technol. （エンザイム マイクロバイオロジー アンド テクノロジー）12:926-932. に記載され、
(3) ラクトバチルス アミロボラス(Lactobacillus amylovorus)を用いたＬ−乳酸の製造が、Nakamura,L.K. and Crowell C.D. (1979) Lactobacillus amylovorus, a new starch-hydrolyzing species from swine waste-com fermentation. Div. Ind. Microbiol. 20:531-540.に記載され、
(4) ラクトバチルス デルブルッキー(Lactobacillus delbruekii)を用いたＬ−乳酸の製造が、Stenroos,S.L., Linko,Y.Y., and Linko,P. (1982) Production of L-lactic acid with immobilized Lactobacillus delbruekii. Bacteriol. Lett.（バイオテクノロジーレター）4:159-164.に記載され、
(5) ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)を用いたＬ−乳酸の製造が、Ishizaki,A. and Kobayashi,G. (1990) Computer simulation of L-lactate batch fermentation applying the enzyme inactivation scheme. J. Ferment. Bioeng. 70:139-140.に記載されている。
【０００８】
以上(1) 〜(5) は乳酸菌を用いたＬ−乳酸の製造である。しかし、これらの乳酸菌は栄養要求性が高く、培地がコスト高となる。乳酸菌を用いた乳酸製造の培地がコスト高になることは、Boer,J.P.de, Mattos,M.J.T.de, and Neijssel O.M. (1990) D(-)Lactic acid production by suspended and aggregated continuous cultures of Bacillus laevolacticus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34:149-153. に記載されている。培地がコスト高となれば、当然のことながら、製品としてのＬ−乳酸が高価なものとなる。
【０００９】
そこで、乳酸菌以外の菌を用いたＬ−乳酸の製造法も報告されている。例えば、リゾプス オリザエ(Rhizopus oryzae) によるＬ−乳酸の製造が、Tamada,M., Bagum,A.A., and Sadai,S. (1992) Production of L(+)-lactic acid by immobilized cells of Rhizopus oryzae with polymer supports prepared by γ ray induced polymerization. J. Ferment. Bioeng. 74:379-383.に記載されている。しかし、この方法では、発酵時間が４０〜５０時間と長く、生産効率が良くない。
【００１０】
また、バチルス ラエボラクティス(Bacillus laevolactis)によるＤ−乳酸製造は、前述の Appl. Microbiol. Biotechnol. 34:149-153. に報告があるが、Ｄ−乳酸ではしかたない。
【００１１】
また、バチルス コアグランス(Bacillus coagulans)によるＬ−乳酸の製造が、特開昭５８−４００９３号公報、特公昭６０−６２００号公報、米国特許US.5079164号明細書に記載されている。しかしながら、バチルス コアグランスは、本明細書の実施例で示すが本発明で用いる菌株に比べ栄養要求性が高く、生産されるＬ−乳酸の光学純度は７０％未満のものである。また、殺虫性毒素を作るバチルス コアグランス株は知られていない。
【００１２】
また、特開平３−２７２９１号公報には、バチルス コアグランスを用いた乳酸の製造法が記載されている。しかしながら、同号公報では、生産される乳酸がＬ−乳酸であることや、その光学純度については全く言及されていない。さらに、特開平２−７６５９２号公報にも、その請求項９にバチルス属を用いた乳酸の製造法が記載されているが、実際にバチルス属を用いてＬ−乳酸を生産したことは開示されていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決すべく、バチルス属の特定種の微生物を用いてＬ−乳酸を高純度で且つ安価に製造する方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、殺虫性毒素を生産する能力を有するバチルス属の特定種の微生物を用いて、高純度Ｌ−乳酸と殺虫性毒素とを同時に生産させ、トータルコストがより下げられた高純度Ｌ−乳酸の製造方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の高純度Ｌ−乳酸の製造方法は、資化可能な炭素源から光学純度７０％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有する、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus) 、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ラルバエ(Bacillus larvae) 、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・ポピラエ(Bacillus popilliae)およびバチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus) からなる群から選ばれる少なくとも一種のバチルス属(Bacillus)の微生物を培養し、この培養物から光学純度７０％以上のＬ−乳酸を採取することを特徴とするものである。
【００１５】
また、本発明のＬ−乳酸と殺虫性毒素とを同時に製造する方法は、資化可能な炭素源から光学純度７０％以上のＬ−乳酸および殺虫性毒素を生産する能力を有する、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ラルバエ(Bacillus larvae) 、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・ポピラエ(Bacillus popilliae)およびバチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus) からなる群から選ばれる少なくとも一種のバチルス属(Bacillus)の微生物を培養し、この培養物から光学純度７０％以上のＬ−乳酸と殺虫性毒素とを採取することを特徴とするものである。
【００１６】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００１７】
本発明において、バチルス属(Bacillus)の微生物として、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus) 、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ラルバエ(Bacillus larvae) 、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・ポピラエ(Bacillus popilliae)またはバチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus) を用いる。これらバチルス属微生物を用いることにより、Ｌ−乳酸を光学純度７０％以上の高純度で得ることができる。これら微生物のうち、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシスは、大変近縁であり同定上の区別が難しいものである。このことは、バージーズ マニュアル オブ システマティック バクテリオロジーの１１１３頁にも記載されている。また、これら３種株は、エッグヨークレシチナーゼ(Egg-yolk lecithinase)反応が陽性であることが特徴である。
【００１８】
また、本発明において、バチルス属の微生物として、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ラルバエ(Bacillus larvae) 、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・ポピラエ(Bacillus popilliae)またはバチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus) を用いることにより、高純度Ｌ−乳酸と共に殺虫性毒素を得ることができる。
【００１９】
本発明において用いる炭素源としては、グルコース以外に、シュークロース、マルトース、フラクトース、ラクトース、マンニット、デンプンなど資化可能な糖であれば限定されることはない。これら糖質の培地中の濃度は、通常２〜１５重量％程度である。
【００２０】
また、副原料として、ポリペプトン、チーズホエー、コーンスティープリカー、酵母エキスなど安価な原料を用いることができる。これら副原料の培地中の濃度は、通常０．１〜２重量％程度である。
【００２１】
また、培地中には、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、苛性ソーダ、塩酸、各種緩衝液等のｐＨ調整剤、マグネシウム化合物、マンガン化合物等を含むことができる。
【００２２】
菌体の培養は、通常STR (Stirred Tank Reactor)で回分式に行なうが、これに限らず、CSTR(Continuous Tank Reactor）で連続的に行なうこともできる。また、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、光硬化性樹脂等への固定化や膜型リアクター、電解透析型リアクターにより生産しても良い。膜型リアクターは、例えば、Dialysis（透析型）のものが、Coulman らによる、Applied Environmental Microbiology, 1977年34巻、725-732 頁や、Stieber and Gerhardtによる、Biotechnology and Bioengineering, 1981年２３巻、523-534 頁などに記載されている。また、Cross-Flow型の膜型リアクターは、Major and Bullによる、Biotechnology and Bioengineering, 1989年34巻592-599 頁などに記載されている。
【００２３】
培養のｐＨおよび温度は、用いる菌体にもよるが、通常ｐＨ６．０〜８．０、温度２５〜４０℃である。最適条件は、用いる菌体により定められる。
【００２４】
また、本発明において、培養は、好気的条件下で行うこともできるが、嫌気的条件下で行うことが好ましい。バチルス属は好気性または通性好気性の微生物であり、通常、通気等を行うことにより好気的に培養する。この様な好気的条件では、グルコース等の糖はピルビン酸からクレブス回路を経て代謝される。本発明ではバチルス属の微生物を嫌気的条件下で培養することにより、ピルビン酸からより高純度のＬ−乳酸を、より高変換率で得ることができる。
【００２５】
菌体の培地中への導入は、従来公知のいずれの方法により行なっても良く、また、生産されたＬ−乳酸および場合によっては得られる殺虫性毒素の分離精製も、従来公知のいずれの方法を用いても良い。
【００２６】
本発明によれば、資化可能な炭素源から光学純度７０％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有するバチルス属の微生物、すなわち、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ラルバエ、バチルス・レンチモルブス、バチルス・ポピラエまたはバチルス・スファエリカスを培養するので、光学純度７０％以上の高純度でＬ−乳酸を製造することができる。また、これらバチルス属の微生物は、乳酸菌より栄養要求性が低く安価な培地で培養できるので、より安価にＬ−乳酸を製造することができる。
【００２７】
さらに、本発明において、殺虫性毒素をも生産する能力を有するバチルス属の微生物、すなわち、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ラルバエ、バチルス・レンチモルブス、バチルス・ポピラエまたはバチルス・スファエリカスを培養する場合には、光学純度７０％以上のＬ−乳酸と殺虫性毒素とを同時に製造することができ、トータルコストとしてＬ−乳酸をより安価に製造することができる。
【００２８】
【実施例】
次に、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【００２９】
［実施例１］
バチルス・セレウス(Bacillus cereus) JCM 2152 をブレインハートインフュージョン培地（Becton Dickinson社製）で３４℃で１０時間培養し、これを種菌とした。この０．１ｍｌづつを２本の各試験管中の次の組成からなる液体培地１０ｍｌに植菌した。
ポリペプトンＳ（日本製薬製）１０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ、およびリン酸第２カリウム３５ｇ／ｌ：なお、この培地は１ＭのＨＣｌによって、ｐＨ７．０に調整した。
各試験管の口には通気可能な多孔質のシリコン栓をし、１本の試験管では嫌気的培養を行ない、他の１本の試験管では好気的培養を次のように行なった。
＜嫌気的培養＞
試験管をＢＢＫ ＧａｓＰａｋ（Becton Dickinson社製）に入れ、３４℃で１０時間、静置培養した。ガスパック中で行なったので、次の振盪培養よりも嫌気度が高い。
＜好気的培養＞
試験管をＢＢＫ ＧａｓＰａｋ（Becton Dickinson社製）に入れることなく、３４℃で１０時間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。
【００３０】
培養後、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を以下のようにして求めた。
【００３１】
＜乳酸生成量および消費グルコース量＞
乳酸生成量および消費グルコース量は、それぞれ培養液中の乳酸濃度（ｇ／ｌ）および消費グルコース量（ｇ／ｌ）として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により次の条件で定量した。なお、乳酸生成量は、Ｌ−体及びＤ−体の合計量である。
ＨＰＬＣ；（島津製作所製、ＬＣ−６Ａ）、検出器；示差屈折率計（ＲＩＤ−６Ａ、島津製作所製）、カラム；Shim-pack SCR-101H（島津製作所製）、カラム温度；６０℃、溶離液；２．５ｍｍｏｌの過塩素酸水溶液、流速；０．９ｍｌ／ｍｉｎ。
【００３２】
＜変換率＞
変換率は、
変換率（％）＝（乳酸生成量(g/l) ／消費グルコース量(g/l) ）×１００
で計算される。ここで、乳酸生成量は、Ｌ−体及びＤ−体の合計量である。
【００３３】
＜光学純度＞
Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される：
光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
培養液サンプルをＵＦ膜（ＵＦＰＩ，ミリポア）で濾過して、分子量５０００以上の分子をカットした。これを高速液体クロマトグラフィーにより測定し、培養液中のＬ−乳酸とＤ−乳酸の濃度を定量した。ＨＰＬＣ；（島津製作所製、ＬＣ−６Ａ）、検出器；分光計（島津製作所製、ＳＰＤ−６ＡＶ）、カラム；ＣＲＳ１０Ｗ（三菱化成製）、カラム温度；３０℃、検出波長；２５４ｎｍ、溶離液；２ｍＭのＣｕＳＯ4 、流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ。
【００３４】
［実施例２］
実施例１のバチルス・セレウス(Bacillus cereus) JCM 2152に代えて、菌株としてバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis) subsp.kurustaki ATCC 33679を用いた以外は、実施例１と同様の操作で培養を行ない、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を求めた。
【００３５】
［比較例１］
実施例１のバチルス・セレウス(Bacillus cereus) JCM 2152に代えて、菌株としてバチルス・コアグランス(Bacillus coagulans) JCM 2257 を用いた以外は、実施例１と同様の操作で培養を行ない、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を求めた。
【００３６】
［比較例２］
実施例１のバチルス・セレウス(Bacillus cereus) JCM 2152に代えて、菌株としてバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) JCM 1465を用いた以外は、実施例１と同様の操作で培養を行ない、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を求めた。
【００３７】
実施例１〜２、比較例１〜２の結果を表１に示す。
【表１】
表１より、菌株としてバチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシスを用いた場合は、高変換率で、しかも高い光学純度でＬ−乳酸が生成した。また、好気的培養に比べ嫌気的培養の方が、高い変換率と高い光学純度が得られた。一方、菌株としてバチルス・コアグランスを用いた場合は、好気的培養した場合でも乳酸生成量は少なく、光学純度も７０％に満たないものであった。嫌気的培養の場合は、乳酸生成が認められなかった。菌株としてバチルス・ズブチリスを用いた場合は、嫌気的及び好気的条件でいずれも乳酸を生成したが、その濃度及び変換率はそれぞれ、０．１ｇ／ｌ、２５．０％、３．７ｇ／ｌ、４９．３％と実用に耐えるものではなかった。
【００３９】
また、これらの結果で注目すべきは、グルコース以外の副原料としてポリペプトンＳで良いということであり、このことは、乳酸菌ではまずあり得ない。つまり、これらバチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシスの菌株が乳酸菌やバチルス・コアグランスよりも栄養要求性が低く、培地を選ばないということであり、より安価な培地で高純度のＬ−乳酸を生産できることが明かとなった。
【００４０】
［実施例３］
バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis) subsp.kurustaki ATCC 33679を、培地はポリペプトンＳ；１０ｇ／ｌ、リン酸アンモニウム；５ｇ／ｌ、およびグルコース１００ｇ／ｌからなる培地で培養した。培養は５００ｍｌの培養器（培養液量５００ｍｌ）を用い、３０℃、６０ｒｐｍで攪拌を行い、６Ｍ苛性ソーダによりｐＨを７．０に保った。また、嫌気的条件を保つため３０ｍｌ／ｍｉｎで窒素ガスを通気し、３０℃で１５時間培養した。培養液の乳酸濃度は９８ｇ／ｌであり、光学純度は９９．５％であった。
この培養液から遠心分離（２０，０００Ｇ、１５分）により菌体を集菌したところ、湿重量にして３０ｇの菌体が得られ、位相差顕微鏡で観察したところ、０．６×２μの紡錘形結晶が観察された。
菌体を１５０ｗの超音波破砕機を用いて１０分間で破砕し、これをアメリカシロヒトリの幼虫２０匹に飼料として与えたところ、７匹が１時間以内に、１０匹が１時間から２時間以内に、３匹が２時間から５時間以内に死んだ。
このように、菌株としてバチルス・チューリンゲンシスを用いた場合は、高変換率で、しかも高い光学純度でＬ−乳酸が得られると共に、殺虫性毒素が同時に得られた。従って、トータルコストとしてＬ−乳酸をより安価に製造できることが明かとなった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、上述のように、非常に高い光学純度のＬ−乳酸を安価に製造することができる。さらに好ましい本発明の方法によれば、Ｌ−乳酸と共に殺虫性毒素を同時に製造することができ、トータルコストとして高い光学純度のＬ−乳酸をより安価に製造することができる。このように、本発明の方法は、従来の微生物を用いたＬ−乳酸製造法に比べ、非常に有用なものである。
Claims (4)
- 資化可能な炭素源から光学純度７０％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有する、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus) 及びバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis) からなる群から選ばれる少なくとも一種のバチルス属(Bacillus)の微生物を培養し、この培養物から光学純度７０％以上のＬ−乳酸を採取することを特徴とする、Ｌ−乳酸の製造方法。
- 資化可能な炭素源から光学純度７０％以上のＬ−乳酸および殺虫性毒素を生産する能力を有する、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis) を培養し、この培養物から光学純度７０％以上のＬ−乳酸と殺虫性毒素とを採取することを特徴とする、Ｌ−乳酸と殺虫性毒素とを同時に製造する方法。
- 嫌気的条件下で培養することを特徴とする、請求項１または２項に記載の方法。
- ポリペプトンを含む培地にて培養することを特徴とする、請求項１または２項に記載の方法。
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