CN1075111C - 用芽孢杆菌属菌株产生高光学纯度l－乳酸的方法 - Google Patents
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- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
Abstract
一种产生光学纯度不低于70%的L-乳酸的方法，该方法包括下列步骤：(1)培养能够从可同化的碳源产生光学纯度不低于70%的L-乳酸的芽孢杆菌属的微生物；和(2)从培养液收集光学纯度不低于70%的L-乳酸。
Description
本发明涉及用某种芽孢杆菌属菌株产生高光学纯度L-乳酸的方法。更具体地说，本发明涉及以低的价格产生高光学纯度L-乳酸的方法。本发明也涉及同时产生高光学纯度L-乳酸和杀虫毒素的方法。
L-乳酸已用作产生聚乳酸(一种可生物降解的塑料)的起始物质。L-乳酸已在许多领域(包括食品和药物、酿造、制革以及光学材料)得以应用。本发明的细菌产生的杀虫毒素已引起人们的注意，因为它与习用的农业化学品不同，对人畜无害。
当L-乳酸在产生聚乳酸中用作起始物质时，如Kulkarni等[Biodegradable poly(lactic acid)polymers:Kukarni,R.k.,Moore,E.G.,Hegyeli,A.F.,and Leonard,F.,J.Biomed.Mater.Res.,5,169-181(1971)]和Ohara[Poly-L-lactic acid asbiodegradable plastic:Ohara,H.,Biosci.Indust.,52,642-644(1994)]所报道的，起始乳酸的光学纯度越高，所产生的聚合物的结晶程度越高。高结晶度的聚乳酸适用于弹性薄膜和纤维。如Sato等，[Properties of the ferroelectic polymer liquid crystalscontaining a chiral lactic acid derivative group:Sato,K.,Eguchi,T.,Toshida,Y.,Yoshinaga,K.,and Takasu,Y.,Polymerpreprints,Japan,39,1962-1964(1990)]和Yoshinaga等[Properties of the ferroelectric polymer liquidcrystals containing a chiral lactic acid derivative group(Ⅱ):Yoshinaga,K.,Eguchi,T.,Sato,K.,Toshida,Y.,and Takasu,Y.,Polymer Preprints,Japan,39,1962-1964(1990)]所提及的高纯度的乳酸可用作液态晶体。
联合国食品和农业组织(FAO)以及世界卫生组织(WHO)推荐的用于婴儿喂养的乳酸是L-乳酸[FAO and WHO toxicologicalevaluation of certain food additives with,a review ofgeneral principles and of specifications,p.23,WHO,Geneva(1974)]。
因此，乳酸的L-异构体是有用的，并且需要高光学纯度。
L-乳酸通常用发酵方法产生，所述发酵方法包括：
(1)使用粪链球菌的方法[用滤器-床-型反应器产生乳酸；Ohara,H.,Hiyama,K.,and Yoshida,T.,J.Ferment.Bioeng.76,73-75(1993)]；
(2)使用瑞士乳芽孢杆菌的方法[在两个系列恒化器中用瑞士乳芽孢杆菌从乳清连续产生乳酸：Aeschlimann,A.,Di Stasei,L.,and vonStockar,U.,Enzyme Microbiol.Technol.,12,926-932]；
(3)使用Lactobacillus amylovororus的方法[从猪waste-com发酵得到的一个新淀粉水解种；Nakamura,L.K.and Crowell,C.D.,Div.Ind.Microbiol.20,531-540(1979)]；
(4)使用德彼利氏乳芽孢杆菌的方法[用固定化德彼利氏乳芽孢杆菌产生L-乳酸：Stenroos,S.L.,Linko,Y.Y.,and Linko,P,Bacteriol.Lett.4,159-164(1982)]；和
(5)使用Lactococcus lactis的方法[采用酶灭活方案的计算机模拟L-乳酸批量发酵：Ishizaki,A.and Kobayashi,G.,J.Ferment.Bioeng.70,139-140(1990)]。
以上(1)到(5)是用乳酸菌产生L-乳酸的方法。这些乳酸菌是高度营养缺陷型的，如Boer等报道的[经悬浮和搅拌连续培养Bacillus Laevolacticus产生D-乳酸：Boer,J.P.de,Mattos,M.J.T.de,和Neijssel O.M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,34,149-153(190)]需要昂贵的培养基。昂贵的培养基增加了L-乳酸产品的价格。
鉴于上述情况，人们报道了使用细菌而不是乳酸菌的方法。例如Tamada等描述了使用米根霉的方法[用γ射线诱导聚合制备的聚合物支持物经固定化米根霉细胞产生L(+)-乳酸：Tamada,M.,Bagum,A.A.,and Sadai,S.,J.Ferment.Bioeng.74:379-383(1992)]。在这一方法中，培养时间长达40-50小时，导致低的生产效率。
就乳酸的D-异构体而言，以上提到的参考资料(Appl.Microbiol.Biotechnol.,34:149-153)中有用BacillusLaevolactis产生该异构体的报道。但这一方法不适于产生L-乳酸。
JP-A-58-40093、JP-B-60-6200和USP5079164公开了用凝结芽孢杆菌产生L-乳酸的方法。然而，凝结芽孢杆菌与用于本发明的细菌相比，是高度营养缺陷型的，因此，需要昂贵的培养基。这种微生物产生的L-乳酸的光学纯度也比本发明的菌株产生的要低(＜70％)。也未发现能产生杀虫毒素的凝结芽孢杆菌。尽管在JP-A-3-27291中公开了用凝结芽孢杆菌的生产方法，但其中一点也未说明所产生的异构体的类型(L或D)和所产生的乳酸的光学纯度。在JP-A-2-76592中，公开了用芽孢杆菌菌株产生乳酸的方法，但说明书中没有公开用芽孢杆菌菌株实际产生乳酸。
本发明的第一个目的是通过提供一种用属于芽孢杆菌属的特定菌株产生高光学纯度的L-乳酸的方法来给出上述问题的一种解决办法。
本发明的第二个目的是提供一种使用某种芽孢杆菌属的菌株同时产生高光学纯度L-乳酸和杀虫毒素，从而降低高纯度L-乳酸总的生产价格的方法。
本发明的第三个目的是提供一种用能够以不低于95％的高光学纯度产生L-乳酸的新芽孢杆菌菌株产生高光学纯度L-乳酸的方法。
本发明的第四个目的是提供一种能够以不低于95％的高光学纯度产生L-乳酸的新芽孢杆菌菌株。
在本发明的第一实施方案中，经培养至少一种属于芽孢杆菌属的菌株产生了光学纯度不低于70％的L-乳酸，所述的芽孢杆菌选自由炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacillus lentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌菌株组成的组。用于本实施方案的芽孢杆菌菌株能够从可同化的碳源产生L-乳酸。
在本发明的第二实施方案中，经培养至少一种菌株同时获得了光学纯度不低于70％的L-乳酸和一种杀虫毒素，所述的菌株选自由苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacilluslentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌菌株组成的组。用于本实施方案的芽孢杆菌菌株能够从可同化的碳源产生L-乳酸和一种杀虫毒素。
本发明的第三实施方案的特征是经培养能够从可同化的碳源产生L-乳酸的Bacillus sp.SHO-1(FERM BP-5682)菌株以低的生产价格产生了光学纯度不低于95％的L-乳酸。
本发明的第四实施方案是一种能够以不低于95％的高光学纯度产生L-乳酸的微生物学新芽孢杆菌菌株。
以下将详细描述本发明。
用于本发明的第一实施方案中的菌株包括能产生光学纯度不低于70％的L-乳酸的属于炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacillus lentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌的菌株。通过使用上述芽孢杆菌属的菌株，能够产生光学纯度不低于70％的L-乳酸。如Bergey’sManual of Systematic Bacteriology Vol.2(1986),P.H.A.Sneath(ed.),Williams&Wilkins,P1113所述，在这些微生物中，炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌非常相近，以致细菌学区分这些种很困难。这三个种显示出对卵黄卵磷脂酶反应阳性的共同特征。
用于本发明的第二实施方案中的能同时产生高光学纯度的L-乳酸和-种杀虫毒素的芽孢杆菌属的菌株包括苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacillus lentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌菌株。
在本发明的第三实施方案中，用Bacillus sp.SHO-1(FERMBP-5682)(一种芽孢杆菌属新菌株)能够产生不低于95％的高光学纯度的L-乳酸。在以下第四实施方案中详细描述了这一新菌株。
在第四实施方案中，使用了Bacillus sp.SHO-1(FBRMBP-5682)菌株。这一菌株能以非常高的光学纯度产生L-乳酸。这一菌株是发明人按以下方法从牛奶分离到的：将牛奶样品在BCP(溴甲酚紫)计数平板琼脂(Nissui Pharmaceutical,Co.,Ltd.)上制成条，然后将其置入BBL GasPak中，并于34℃培养24小时。在产酸的菌落周围琼脂平板的颜色由紫变黄。用接种环挑出显示出颜色变化的菌落中的细菌，再在新鲜的BCP计数平板琼脂上制成条。这一过程重复2-5次。将如此筛选出的菌落转移到含2％葡萄糖、1％酵母提取物、1％蛋白胨和3.5％磷酸氢二钾的10ml液体培养基中(用HCl调pH至7.0)，并于34℃下在GasPak中培养24小时。通过分析培养液体中包含的L-乳酸的光学纯度并选择以高光学纯度产生L-乳酸的菌株，可以获得目标菌株Bacillus sp.SHO-1。按本说明书实施例中的方法进行液体培养基中L-乳酸的光学纯度分析。所获得细菌菌株基本上是纯的。
Bacillus sp.SHO-1的细菌学性质如下：
(1)形态学
形状：杆状
大小：5μm长×2μm宽
移动性：+
孢子形成：+
孢子囊：无隆起
形状：椭圆
位置：中间至亚端
(2)生理学
革兰氏染色：+
过氧化氢酶活性：+
卵黄卵磷脂酶反应：+
吲哚产生：-
V.P.试验：+
可同化的糖：
葡萄糖：+
麦芽糖：+
果糖：+
蔗糖：-
乳糖：+
棉籽糖：-
甘露糖醇：-
以上性质说明菌株SHO-1属于芽孢杆菌属。
就以上所列性质来说，菌株SHO-1与已知的芽孢杆菌菌株没有区别。然而，如实施例中所说明的，这一菌株具有以非常高的光学纯度产生L-乳酸的能力。因此，因为菌株SHO-1在这一点上不同于任何已知的芽孢杆菌菌株，所以这一菌株被认为是属于芽孢杆菌属的一个新菌株。
菌株Bacillus sp. SHO-1已以保藏号BP-5682保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology,Ministry ofInternational Trade and Industry。
菌株Bacillus sp.SHO-1非常有用，这是因为与其它乳酸菌和凝结芽孢杆菌相比它是低营养缺陷型的，并且能在太昂贵的培养基中生长，从而使得能以低的价格产生高光学纯度的L-乳酸。
就碳源来说，只要是可同化的，任何糖均可用于本发明的第一和第二实施方案中。除了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、甘露糖醇外，也可以使用淀粉。用于第三实施方案中的优选的碳源包括葡萄糖、麦芽糖、果糖和乳糖。培养基中的糖浓度通常在2-15％(重量)范围内。
廉价的物质(例如，蛋白胨、干酪乳清、玉米浆和酵母提取物)也可以用作次要起始物质。培养基中这些次要物质的浓度通常为约0.1-2％(重量)，培养基中蛋白胨的浓度通常为约0.5-2％(重量)。
培养基也可以含有无机盐(例如，磷酸钾和磷酸铵)、pH调节剂(例如，苛性苏打、盐酸和各种缓冲液)、镁化合物、锰化合物等。细菌细胞通常用STR(搅拌罐反应器)经分批方法培养，但也可以用CSTR(连续罐反应器)经连续方法培养。细胞也可以固定在藻酸钙、角叉菜胶或光凝结(photosetting)树脂上，或者用膜型或电透析型反应器培养。例如，Coulman等(Applied Environmental Microbiology,34,725-732(1977))、Stieber and Gerhardt (Biotechnology and Bioengineering,23,523-534(1981)和其它出版物描述了膜型反应器。Majorand Bull(Biotechnology and Bioengineering,34,592-599(1989))和其它出版物描述了交叉流动型膜型反应器。
尽管培养pH值和温度取决于所使用的细胞，但本发明的第一、第二和第三实施方案中的培养pH值和温度通常分别为6.0-8.0和25-40℃。最佳条件根据所使用的细胞确定。
在本发明中，需氧培养是可能的，但厌氧培养是优选的。芽孢杆菌属的细菌是需氧菌或兼性厌氧菌，通常在需氧条件下进行通气等来培养。在这种需氧条件下，糖类(如葡萄糖)在三羧酸循环中经丙酮酸被代谢掉。在本发明中，通过在厌氧条件下培养芽孢杆菌属的微生物可以以较高转化率从丙酮酸获得高光学纯度L-乳酸。通过吹入二氧化碳气体或惰性气体(如，氮气、氩气)可以保持厌氧条件。任何习用的方法都可用于将所述细胞接种到培养基中。任何习用的方法也都可用于分离和纯化所产生的L-乳酸和所形成的可同时获得的杀虫毒素。
按照本发明的第一实施方案，L-乳酸可以以不低于70％的高光学纯度产生，这是因为培养了能够以不低于70％的光学纯度从可同化的碳源产生L-乳酸的芽孢杆菌菌株，这些菌株属于炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacillus lentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌。此外，因为这些芽孢杆菌属的菌株与乳酸菌比较为低营养缺陷型的，可以在廉价的培养基中培养，所以L-乳酸可以以较低的价格产生。
在本发明的第三实施方案中，L-乳酸可以以不低于95％的高光学纯度产生，这是因为培养了能够以不低于95％的光学纯度从可同化的碳源产生L-乳酸的Bacillus sp.SHO-1。此外，因为Bacillus sp.SHO-1与乳酸菌和凝结芽孢杆菌比较为低营养缺陷型的，可以在廉价的培养基中培养，所以L-乳酸可以以较低的价格产生。
此外，在本发明的第二实施方案中，培养也能产生杀虫毒素的芽孢杆菌属的菌株(例如，苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacillus lentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌)，能够同时产生光学纯度不低于70％的L-乳酸和一种杀虫毒素，因而可以以较低的总价格产生L-乳酸。
实施例
此后通过下列实施例详细地描述本发明。
实施例1
于34℃在Brain Heart Infusion Medium(BectonDickinson生产)中培养蜡状芽孢杆菌JCM2152 10小时，产生种子培养物。取该种子培养物0.1ml接种到在两只试管中的10ml液体培养基中。含有10g/l蛋白胨(Nihon Pharmaceutical生产的聚蛋白胨S)、20g/l葡萄糖和35g/l磷酸氢二钾的液体培养基用1MHCl调pH7.0。
各试管用可通过气体的聚氧硅烷塞子塞上，如下所述，在一只试管中进行厌氧培养，在另一只试管中进行需氧培养。
[厌氧培养]
将试管置于BBK GasPak(Becton Dickinson生产)中，并于34℃下静置培养10小时。由于这一培养在GasPak中进行，其厌氧状态的程度高于以下所述的振荡培养。
[需氧培养]
试管不置于BBK GasPak(Becton Dickinson生产)中，于34℃和120rpm下振荡培养10小时。
培养后，按下述方法测定乳酸产量(g/l)、葡萄糖耗量(g/l)、转化率(％)和光学纯度(％)。
<乳酸产量和葡萄糖耗量>
乳酸产量和葡萄糖耗量分别基于发酵液中乳酸浓度(g/l)和葡萄糖耗量(g/l)，在以下所示的条件下用高效液相层析法(HPLC)测定。乳酸产量是所产生的L-和D-异构体的总量。
HPLC:LC-6A(Shimadzu Corpoation生产)
检测器：示差折光仪(RID-6A,Shimadzu Corporation生产)
柱：Shim-pack SCR-101H(Shimadzu Corporation生产)
柱温：60℃
洗脱液：高氯酸的2.5mmol水溶液
流速：0.9ml/min[转化率]
用下列公式计算转化率：
其中乳酸产量是所产生的L-和D-异构体的总量。[光学纯度]
用下列公式计算L-乳酸的光学纯度：
光学纯度(％)=100×(L-D)/(L+D)
其中L是L-乳酸浓度，D是D-乳酸的浓度。
发酵液样品经UF膜(UFPI,MILLIPORE)过滤，以除去分子量不低于5000的分子。滤液进行高效液相层析试验，以测定发酵液中的L-和D-乳酸的浓度。
HPLC:LC-6A(Shimadzu Corporation生产)
检测器：分光光度计(SPD-6AV,Shimadzu Corporation生产)
柱：CRS10W(Mitsubishi Chemical生产)
柱温：30℃
检测长度：254nm
洗脱液：2mM CuSO4
流速：0.5ml/min
实施例2
用苏云金芽孢杆菌亚种kurustaki ATCC33679代替蜡状芽孢杆菌JCM2152(实施例1中使用的菌株)，用与实施例1相同的方法培养，并测定乳酸产量(g/l)、葡萄糖耗量(g/l)、转化率(％)和光学纯度(％)。比较实施例1
用凝结芽孢杆菌JCM2257代替蜡状芽孢杆菌JCM2152(实施例1中使用的菌株)，用与实施例1相同的方法培养，并测定乳酸产量(g/l)、葡萄糖耗量(g/l)、转化率(％)和光学纯度(％)。比较实施例2
用枯草芽孢杆菌JCM1465代替蜡状芽孢杆菌JCM2152(实施例1中使用的菌株)，用与实施例1相同的方法培养，并测定乳酸产量(g/l)、葡萄糖耗量(g/l)、转化率(％)和光学纯度(％)。
表1显示了实施例1和2以及比较实施例1和2的结果。
表1 用葡萄糖+蛋白胨培养基产生的乳酸及其化学纯度
| 细菌菌株 | 静置培养(厌氧) | |||
| 乳酸(g/l) | 葡萄糖耗量(g/l) | 转化率(％) | 光学纯度(％) | |
| [实施例1]蜡状芽孢杆菌 | 13.5 | 13.3 | 98.5 | 98.8 |
| [实施例2]苏云金芽孢杆菌 | 10.2 | 12.0 | 85.0 | 96.8 |
| [比较实施例1]凝结芽孢杆菌 | 0.0 | 0.0 | - | - |
| [比较实施例2]枯草芽孢杆菌 | 0.1 | 0.4 | 25.0 | 86.1 |
| 细菌菌株 | 振荡培养(需氧) | |||
| 乳酸(g/l) | 葡萄糖耗量(g/l) | 转化率(％) | 光学纯度(％) | |
| [实施例1]蜡状芽孢杆菌 | 11.9 | 18.2 | 65.4 | 98.2 |
| [实施例2]苏云金芽孢杆菌 | 11.9 | 19.1 | 62.3 | 97.6 |
| [比较实施例1]凝结芽孢杆菌 | 0.7 | 2.2 | 31.8 | 67.9 |
| 比较实施例2]枯草芽孢杆菌 | 3.7 | 7.5 | 49.3 | 94.4 |
如表1所示，使用蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌时，L-乳酸以较高的转化率和较高的光学纯度产生，厌氧培养中也比需氧培养中获得更高的转化率和更高的光学纯度。另一方面，当使用凝结芽孢杆菌时，即使是在需氧培养中，只产生较少量的乳酸，并且光学纯度低于70％。在厌氧培养中无乳酸产生。当使用枯草芽孢杆菌菌株时，在厌氧和需氧条件下均产生乳酸，但其浓度和转化率分别为0.1g/l,25.0％和3.7g/l,49.3％。这些水平不符合实际应用的需要。
应当指出，除蛋白胨外，不需要别的非葡萄糖次要起始物质，这对乳酸菌而言几乎是不可能的。换句话说，蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌与乳酸菌和凝结芽孢杆菌比较是低营养缺陷型的，任何培养基，只要含有葡萄糖和蛋白胨就都可使用，说明它们可由廉价的培养基以较高的光学纯度产生L-乳酸。
实施例3
在包含10g/l蛋白胨(Nihon Pharmaceutical生产的聚蛋白胨S)、5g/l磷酸铵、和100g/l葡萄糖的培养基中培养苏云金芽孢杆菌亚种kurustaki ATCC33679，用500ml恒温箱(培养液的体积：500ml),30℃下以60rpm搅拌，用6M苛性苏打维持pH7.0。在30℃的15小时培养中，以30ml/min通入氮气来保持厌氧条件。发酵液中的乳酸浓度为98g/l，光学纯度为99.5％。
经离心(20000G,15分钟)从这一发酵液收获细胞，获得30g细胞(湿重)，相差显微镜发现0.6×2μ梭状晶体。
用经150w超声波破碎仪破碎10分钟的细胞饲喂20只秋野暝幼虫，七只幼虫在1小时内死亡，10只在1-2小时内死亡，3只在2-5小时内死亡。
简单地说，当使用苏云金芽孢杆菌时，以高转化率和高光学纯度获得了L-乳酸，同时获得了一种杀虫毒素。这些结果说明，可以以较低的总价格产生L-乳酸。
实施例4
按下述方法分离Bacillus sp.SHO-1。将牛奶在BCP计数平板琼脂(Nissui Pharmaceutical生产)上制成条，然后将其置入BBLGasPak中，并于34℃培养24小时。在生长的菌落中，产酸的一个菌落周围琼脂平板的颜色由紫变黄，这是由于其中包含的澳甲酚紫的颜色改变。用接种环挑出该菌落，再在新鲜的BCP计数平板琼脂上制成条。这一过程重复5次。将如此筛选的茼落接种到含2％葡萄糖、1％酵母提取物、1％蛋白胨和3.5％磷酸氢二钾的10ml液体培养基中(用1M HCl调pH至7.0)，并于34℃下在GasPak中培养24小时。分析所得培养液选择以高光学纯度产生L-乳酸的微生物菌株。
如此便获得了Bacillus sp.SHO-1菌株。
实施例5
于34℃在Brain Heart Infusion Medium(Becton Dickinson生产)中培养Bacillus sp.SHO-110小时，产生种子培养物。取该种子培养物0.1ml 接种到在两只试管中的10ml液体培养基中。含有10g/l蚕白胨(Nihon Pharmaceuticat生产的聚蛋白胨S)、20g/l葡萄糖和35g/l磷酸氢二钾的液体培养基用1M HCl调pH7.0。
各试管用可通过气体的聚氧硅烷塞子塞上，如实施例1所述，在一只试管中进行厌氧培养。在另一只试管中进行需氧培养。
比较实施例3
用凝结芽孢杆菌JCM2257代替Bacillus sp.SHO-1(实施例5中使用的菌株)，用与实施例5相同的方法培养，并测定乳酸产量(g/l)、葡萄糖耗量(g/l)、转化率(％)和光学纯度(％)。
表2 显示了实施例5以及比较实施例3的结果。
表2用葡萄糖+蛋白胨培养基产生的乳酸及其光学纯度
| 细菌菌株 | 静置培养(厌氧) | |||
| 乳酸(g/l) | 葡萄糖耗量(g/l) | 转化率(％) | 光学纯度(％) | |
| [实施例5]B.sp.SHO-1 | 16.0 | 16.4 | 97.6 | 99.0 |
| [比较实施例3]凝结芽孢杆菌 | 0.0 | 0.0 | - | - |
| 细菌菌株 | 振荡培养(需氧) | |||
| 乳酸(g/l) | 葡萄糖耗量(g/l) | 转化率(％) | 光学纯度(％) | |
| [实施例5]B.sp.SHO-1 | 14.3 | 20.0 | 71.5 | 98.5 |
| [比较实施例3]凝结芽孢杆菌 | 0.7 | 2.2 | 31.8 | 67.9 |
如表2所示，在实施例5中使用Bacillus sp.SHO-1时，L-乳酸以较高的转化率和较高的光学纯度产生，厌氧培养中也比需氧培养中获得更高的转化率和更高的光学纯度。另一方面，在比较实施例3中使用凝结芽孢杆菌时，即使是在需氧培养中，产生较少量的乳酸，并且光学纯度低于70％。在厌氧培养中无乳酸产生。
鉴于实施例5的结果，应当指出，除蛋白胨外，不需要别的非葡萄糖次要起始物质，这对乳酸菌几乎是不可能的。换句话说，Bacillus sp.SHO-1与乳酸菌和凝结芽孢杆菌比较是低营养缺陷型的，可使用任何培养基，说明它们可由廉价的培养基以较高的光学纯度产生L-乳酸。
实施例6
在包含10g/l蛋白胨(Nihon Pharmaceutical生产的聚蛋白胨S)、5g/l磷酸铵、和100g/l葡萄糖的培养基中，用500ml恒温箱(培养液的体积：500ml),30℃下以60rpm搅拌培养Baɑillus sp.SHO-1，用6M苛性苏打维持pH7.0。在30℃的15小时培养中，以30ml/min通入氮气来保持厌氧条件。发酵液中的乳酸浓度为97g/l，光学纯度为99.9％。
以上描述了本发明，明显的是可以用许多方式变化本发明。这些变化并不脱离本发明的精神和范围，所有这些对本领域技术人员显而易见的修改应当包括在所附权利要求的范围内。
Claims (4)
1．一种产生光学纯度不低于70％的L-乳酸的方法，该方法包括下列步骤：
(1)通过使用可同化的碳源培养保藏号FERM BP-5682的微生物Bacillus sp.SHO-1；和
(2)从培养液收集光学纯度不低于70％的L-乳酸。
2．按照权利要求1的方法，其中所说的可同化的碳源选自葡萄糖、麦芽糖、果糖和乳糖的至少一种。
3．按照权利要求1的方法，其中的培养步骤(1)在厌氧条件下进行。
4．保藏号FERM BP-5682的微生物Bacillus sp.SHO-1。
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