CN1107889A

CN1107889A - 2-酮基-l-古洛糖酸的改良性生产方法

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Publication number: CN1107889A
Application number: CN94119235A
Authority: CN
Inventors: 山口高正; 米户贤吉; 田中义一
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1993-12-24
Filing date: 1994-12-23
Publication date: 1995-09-06
Anticipated expiration: 2014-12-23
Also published as: US5705373A; CN1080761C

Abstract

一种生产2—酮基—L—古洛糖酸(以下简称 2KGA)的方法，该方法包括：

(1)在含有能生成2KGA底物的液体培养基中培养能由L—山梨糖生成2KGA的微生物，

(2)在回收培养液中微生物的同时，回收所生成的2KGA，

(3)把所回收的微生物接种到新的液体培养基中以用于下面的培养和

(4)重复上述培养并至少再回收一次。

本发明提供了一种生产2KGA的工业可行性通用方法，该方法减少了细胞增殖和种子培养时间，并且减少了起始培养基材料用量和培养废物的量。

Description

本发明涉及一种生产2-酮基-L-古洛糖酸（以下简称2KGA）的改良性方法，其包括：

（1）在含有能生成2KGA的底物的液体培养基中，培养一种具有由L-山梨糖生成2KGA能力的微生物;

（2）在回培养液中微生物的同时，回收所生成的2KGA;

（3）将所回收的微生物接种到一种新的液体培养基中以用于下面的培养和

（4）重复上述培养并至少再回收一次，以便能缩短下一次培养的时间和提高生产效率。

本发明适用于由各种各样的底物生成2KGA的微生物细胞反应（包括发酵）。

本发明的方法有利于应用在2KGA的工业化生产中，而2KGA则是利用微生物合成L-抗坏血酸的一种有用的中间体。

尽管人们对改善通过微生物细胞反应生产有价值物质的产率有过多种尝试，但是目前尚没有能极显著地减少起始培养基材料用量及培养废物量、缩短培养操作时间且设备简单宜行的工业可行性细胞反应方法和发酵方法。

从传统上讲，作为L-抗坏血酸合成的一种有用中间体的2KGA，过去一直是用工业上通用的称为赖克斯坦（Reichstein）方法（见Helvetica Chimica Acta，Vol.17，P.311，1934）的工艺来生产的。然而，由于其步骤繁多且要使用大量的有机溶剂，对现代化工业技术来说，该方法是不能令人满意的。

人们也提出了一些替代赖克斯坦方法的方法，主要是一些利用微生物的方法，包括以下的方法：利用微生物把D-葡萄糖氧化成2，5-双酮基葡糖酸，然后经过微生物或化学反应将其还原成2KGA的方法（见日本专利申请公告公报Nos.14493/1964，25033/1978，15877/1981和35920/1984），将棒状杆菌属细菌2，5-双酮基-D-葡糖酸还原酶基因引入到能根据DNA重组技术生成2，5-双酮基-D-葡糖酸的欧文氏菌属细菌中，以通过一步性发酵过程由D-葡萄糖得到2KGA的方法（科学，230卷，144页，1985年），和利用葡糖杆菌属细菌氧化作为起始物质的D-山梨糖醇或L-山梨糖以生产2KGA的方法（见日本专利申请公开公报No.150287/1990）。

还有另一个已知的方法，即利用分离自土壤中的假葡糖杆菌属细菌把L-山梨糖有效地转化为2KGA（见日本专利申请公开公报No.228288/1987）。另外，欧洲专利申请公开No.221707（日本专利申请公告公报No.85088/1989）还公开了一种由L-山梨糖生产2KGA的更有效的方法，同样是使用上述假葡糖杆菌属细菌进行，其依据是，通过上述微生物所进行的2KGA生产会因在培养基中添加稀土元素而得到明显的促进。

在上述已知的生产2KGA的方法中，都使用了称做批量培养的普通培养方法。具体地说，在培养初始时在培养基中同时加入底物糖或糖醇，或者在培养期间半连续或连续地将底物的一部分或全部加入到培养基中，当足够的2KGA富集时则停止培养，而即使继续进行培养2KGA的有效性转化亦不再发生，这样即得到培养液。在其后过程中从培养体系中除去的细胞通常是废弃不同的;下一轮培养开始于种子培养。不过，这些方法在每一轮培养中都需要种子培养，因在主培养过程中微生物增殖或生长的需求通常使用致密性培养基。从工业生产的角度看这些都是不经济的。另外，在培养完成后分离所需产物中产生大量的培养废物，从环境保护的角度看也是不适宜的。另外，由于经种子培养得到的种子的主培养物的接种量较小，在主培养过程中使微生物增殖到所需的细胞数量则要花费很多的时间，因而也就延长了主培养过程所需的时间。

作为解决这些问题的方法，人们已经提出了固相细胞方法和固相酶方法，其中所需反应中所涉及的微生物细胞或酶被固定在一个载体上。不过，这些方法全都需要尽很大努力才能达到微生物细胞或酶的满意固定或保持其活性。近年来，人们又开发出了生物反应器，其可以利用发酵罐和滤膜的结合进行培养。然而生物反应器也有一些缺陷，包括设备复杂及一般性操作困难，需要高成本及复杂技术以防止微生物对设备的污染。

本发明的目的就在于提供一种工业可行性方法，其适用于2KGA生产的各种各样的培养或微生物细胞反应，亦可以用简便宜行的设备极大地减少起始培养基材料用量及培养废物量并缩短培养所需时间。

按照这个思路，本发明人在寻求一种微生物细胞反应的更有利的方法上进行了一系列改良尝试。发明人尝试了一种2KGA发酵方法，其中使微生物细胞在单次培养中生长以获得所需产物2KGA（其存在于培养液或微生物细胞反应液的含水部分），之后具有剩余活性的细胞再用于下一次的2KGA发酵，而不是做废料处理掉。结果发明人发现，使用重复循环培养方法，与普通批量培养和其它方法相比较，对于同样量被氧化的底物来说，有可能显著缩短发酵时间和减少起始培养基材料的用量和培养废物的量，其中如此获得的细胞的一部分或全部被用于下一次的培养，优选的是加入一种活性保持助剂。

因此，本发明涉及一种生产2-酮基-L-古洛糖酸（以下简称2KGA）的方法，该方法包括：

（1）在含有能产生2KGA的底物的液体培养基中，培养一种具有由L-山梨糖生成2KGA的微生物和

（2）在回收培养液中微生物的同时，回收所产生的2KGA，

（3）将回收的微生物接种到一种新的液体培养基中以用于下面的培养和

（4）重复上述培养并至少再回收一次。

具体地说，本发明包括一种生产2KGA的方法，该方法包括主要通过使用至少一种能产生2KGA的微生物进行培养或微生物细胞反应，其中细胞在保持其必要活性的情况下被重复使用两次或更多次，与此同时或其后所产生的2KGA被分离并回收。

这里，培养或微生物细胞反应可以是这样一种反应，其中对具有所需生产能力的微生物加以培养或另行处理以得到足够数量的细胞，然后使这些细胞与底物接触，在细胞与底物接触时可以有或没有细胞增殖。微生物细胞反应也可以通过一种普通培养方法来进行，其中经小规模种子培养而得到的种子被转移到主培养基中，以产生具有细胞增殖的所需产物，特别是在第一次中培养更是如此。更具体地说，本发明涉及一种培养方法，其中在进行培养和产生2KGA之后，使用一种分离器（如膜或离心机）把含有培养基固体物的细胞部分和含有2KGA的含水部分从培养液或细胞反应液中分离出来，并且由此得到的细胞部分能反复应用于下一次批量培养或微生物细胞反应中，优选的是使用新的培养基。在这种情况下，在把从培养液中分离的活微生物细胞接种到下一个培养基中（较好的是在反应完成之后）时，可以采用一种常用的方法使活细胞与培养其相接触。在本说明书中，“生产最终产物2KGA的发酵”也可简称为“2KGA发酵”，而“微生物细胞反应液”可包括“培养液”。“细胞重复使用性培养”也可称为“循环使用性培养”。

本发明的方法适用于多种底物和微生物。

本方法所用底物最好是糖或糖醇。底物实例包括L-山梨糖、D-葡萄糖和D-山梨糖醇。L-山梨糖是利用某些微生物的方法的最优选的底物。

本发明所用微生物最好是细菌。更具体地说，可作为优选细菌的有假葡萄糖菌属、葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、醋杆菌属和欧文氏菌属的细菌。

下文中将加以更具体地阐述本发明。本发明中所用的能产生2KGA的微生物的实例为假葡糖杆菌属、假单胞菌属、葡糖杆菌属、醋杆菌属或棒状杆菌属中的已知微生物，以及能结合2，5-双酮基-D-葡糖酸还原酶基因的欧文氏菌属微生物。除了这些微生物之外，凡能产生2KGA的微生物都可用于本发明中。特别是在用L-山梨糖做底物的发酵中，优选的是使用假葡糖杆菌属和葡糖杆菌属的微生物。更优选的是假葡糖杆菌属的微生物。其实例包括P.Saccharoketogenes菌株K591s（FERM BP-1130）、12-5（FERM BP-1129）、TH14-86（FERM BP-1128）、12-15（FERM BP-1132）、12-4（FERM BP-1131）和22-3（FERM BP-1133）。

在本发明的培养中，培养条件（如培养基组成和培养温度）可调整到所用菌株适宜的条件。例如，在使用假葡糖杆菌属细菌的2KGA发酵过程中，可以使用EP-B-0221707〔日本专利申请公开公报（JP-A）No.228288/1987〕中所描述的培养方法、培养基组成和培养条件。正如在同一专利申请公开公报中所描述的那样，当进行假葡糖杆菌属微生物的培养时有利于发酵作用，其中，在能为具有产生2KGA能力的微生物提供生长因子的共存的微生物存在下培养可产生2KGA的微生物（下文中有时称做混合性培养）。用于混合性培养中的这类共存的微生物的实例包括芽孢杆菌属、假单胞菌属、变形杆菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄单胞杆菌属和黄杆菌属的微生物。

以下是可共存的具体种类：

蜡状芽孢杆菌IFO 3131

地衣形芽孢杆菌IFO 12201

巨大芽孢杆菌IFO 12108

短小芽孢杆菌IFO 12090

解淀粉芽孢杆菌IFO 3022

枯草芽孢杆菌IFO 13719

环状芽孢杆菌IFO 3967

三叶草假单胞菌IFO 12056

嗜麦芽假单胞菌IFO 12692

无恒变形菌IFO 12930

弗劳地枸橼酸杆菌IFO 13544

阴沟肠杆菌IFO 3320

草生欧文氏菌IFO 12686

豌豆黄单胞杆菌IFO 13556

柑桔黄单胞杆菌IFO 3835和

脑膜脓毒性黄杆菌IFO 12535。

对于这类混合性培养来说，最好是使用芽孢杆菌属微生物。伴有上述微生物的混合性培养在使用葡糖杆菌属微生物的方法中也是优选的。当使用假葡糖杆菌属微生物时，最好是利用含有蔗糖、硫酸铵和（或）尿素的液体培养基。

关于本发明方法的培养方式，可根据所用微生物和培养目的采用一些常用的方式，如摇动培养、静止培养或通气搅拌培养。

培养液中的微生物细胞可利用普通设备予以回收、将细胞从培养液中除去。这类设备包括空心纤维膜滤器、陶瓷膜滤器和离心机。这些设备可单独使用或结合使用。可把两种或更多种的设备结合起来使用。如果使用离心机，最好使用能连续处理培养液的连续离心机。最好是在部分或全部无菌条件下使用设备。

说到这些设备，可以使用上述商业上可得到的普通设备，或根据需要做部分改进。

可根据培养液中细胞及固体物的量选择合适类型的设备。设备的容量与数目主要依培养液体积而定。细胞的回收率为培养液的25%以上，优选的是50-100%。细胞回收期间的温度一般为0-50℃，最好是5-40℃。

微生物（特别是细胞）可以无限制地反复使用，只要其尚保持着能产生所需产物2KGA的活性就行。在使用假葡糖杆菌属微生物生产2KGA的情况下，微生物可在至少两次循环培养中重复使用，一般为4-5次或更多次。

在本发明的微生物细胞反应方法中，最好在主培养基中添加细胞反应活性保持助剂以便在一段延展时间内保持活细胞的反应性-即所需产物的生产力。使用天然存在的有机营养物做为活性保持助剂是很有效的，如酵母膏、干酵母和（或）玉米浸泡液（下文中简称为CSL）。

主培养第一次或第二次及循环使用培养的随后轮次（如果需要的话）之后，培养液或细胞反应液中产生和富集的所需产物可用人们熟知的方法（依性质而定）加以分离和提纯。例如，2KGA可分离为游离酸，或钠盐、钾盐、钙盐、铵盐等等。

可以使用任何分离方法，只要不干扰分离目的就行。例如，可使用下述方法：通过过滤、离心、活性炭处理等把细胞从反应产物中分离出来，之后将该溶液直接浓缩，生成的晶体经过滤收集并重结晶以分离出所需产物、树脂吸附、层板和盐析。这些方法可单独使用，也可组合使用或循环重复使用。

在生产2KGA的微生物细胞反应情况下，可通过适当的方法把产物（当以游离形式获得时）转化为钠盐、钾盐、钙盐、铵盐等等。当产物以盐的形式获得时，可通过适当的方法将其转变为游离形式或其它的盐。

本发明提供了一种在工业上更经济、有效和优势的生产2KGA的微生物细胞反应方法。由于其循环重复使用细胞，该方法在每一次微生物细胞反应中不需要种子培养，而且减少了主要微生物细胞反应中的细胞增殖，并降低了起始培养基材料用量和培养废物的量。

下文中将以实施例对本发明加以更详细的阐述，但这并不构成对本发明的限制。

按下述条件对2KGA进行高效液相色谱的定量分析。

高效液相色谱（HPLC）检测条件：

柱：R101H，7.9×300mm

（Shimadzu公司生产）

流动相：4mM硫酸

检测器：RI检测器

实施例1

表1

斜面培养基（克/升）

山梨糖醇 2.5

胨 10

酵母膏 10

CaCO₃2

琼脂 20

表2

种子培养基A(克/升)

乳糖 10

酵母膏 10

玉米浸泡液 30

硫酸铵 3

pH值 7.0

表3

种子培养基B(克/升)

蔗糖 40

棉籽粉 40

K₂HPO₄6.5

KH₂PO₄5.5

NaCl 0.5

硫酸铵 0.5

MgSO₄·7H₂O 0.05

泛酸钙 0.25

pH值 7.0

表4

发酵培养基(克/升)

玉米浸泡液 20

硫酸亚铁 1

硫酸铵 3

蔗糖 0.5

核黄素 0.001

Acfcol 0.15

(Takeda化学工业公司生产)

粗稀土金属氯化物 0.1

(Mifsubishi kasei生产)

pH值 7.0

表5

循环使用培养基(克/升)

A B C D

蔗糖 0.5 0.5 0.5 0.5

硫酸铵 3 3 3 0.3

玉米浸泡液 4 4

(Oji玉米淀粉公司生产)

尿素 3

干酵母 5

(法国BEL生产)

酵母膏 1

(德国OHLY生产)

在一个200ml容量的锥形瓶中加入20ml的种子培养基A（其组成如表2所示），在120℃下灭菌20分钟。把一铂环假葡糖杆菌属P.Saccharoketogenes K591s菌株（IFO 14464，FERM BP-1130，下文中亦被称为氧化性细菌）的细胞（其在一斜面培养基上在30℃下生长3天，斜面培养基组成如表1所示）接种到这个烧瓶中，之后在28℃下摇动培养1天，由此得到第一种子培养液。同样，在一个200ml容量的锥形瓶中加入200ml种子培养基A并加以灭菌。在这个烧瓶中接种1ml第一种子培养液，此后在28℃下摇动培养两天，形成第二培养液。另外，在含有20ml种子培养基B的经灭菌的容量200ml锥形瓶中，接种一铂环巨大芽孢杆菌（IFO 12108）的细胞（生长在一斜面培养基上，培养基组成如表1所示），随后在28℃下摇动培养两天，形成巨大芽孢杆菌的种子培养液（下文中亦被称为共存的细菌）。

将10ml经灭菌的双长度发酵培养基〔含有如表1所示的成分、0.8克（5ml）CaCO₃（Shiraishi钙Kaisha有限公司）（单独灭菌和2克（5ml）L-山梨糖（单独灭菌）〕加入一容量为200ml的锥形瓶中（用120℃蒸气灭菌20分钟）。将2ml上述氧化细菌的第二种子培养液和1ml共存细菌的种子培养液转移到此烧瓶中，随后在30℃温度下摇动培养。到开始发酵后的28小时时，所有的山梨糖都全被消耗光了，在培养液中富集了1.76克2KGA。把全部这种培养液无菌性地转移到一个已预先灭菌的离心管中，利用带冷却装置的旋转微离心机在20℃温度下以每分钟3，000转的速度离心10分钟。将如表5所示的培养基（下文中亦称重复使用性培养基）从A至D每一种10ml加入一容量200ml的锥形瓶中并加以灭菌。向此烧瓶中加入已分别灭菌过的2克（5ml）L-山梨糖和0.8克（5ml）碳酸钙。把由上述离心得到的细胞总量（包括其它固体含量）无菌接种到这种混合液体中，然后在与第一次摇动培养相同的条件下进行摇动培养。这种培养下文中称做重复使用培养。

重复使用培养重复进行三次。当几乎所有L-山梨糖都转变为2KGA时停止发酵。从重复使用培养的完成到下一轮次培养的开始要花费1小时。每一种最终的培养液含1.7-1.8克2KGA。每一次发酵所需要的时间如表6所示。

表6

时间（小时）

发酵次数 A B C D

第一次 28 28 28 28

第二次 14 12 12 12

第三次 14 13 12 13

第四次 15 13 13 13

实施例2

第一次发酵由不使用共存细菌的纯培养物进行。所使用的发酵培养基通过在表4所示组成中添加5克/升干酵母制备而成。其它方面均同实施例1。第二次发酵之后，循环使用培养是使用与实施例1中相同的循环使用培养基进行的。每一次发酵所需要的时间如表7所示。每一种最终的培养液含有1.7-1.8克2KGA。

表7

时间（小时）

发酵次数 A B C D

第一次 30 30 30 30

第二次 15 13 12 13

第三次 16 13 13 12

第四次 16 14 13 13

实施例3

把20ml的种子培养基A（其组成如表2所示）加入到容量200ml的锥形瓶中，在120℃下灭菌20分钟。把一铂环假葡糖杆菌属P.Saccharoketogenes TH14-86菌株（IFO14466，FERM BP-1128）的细胞（其在一斜面培养基上在30℃下生长3天，培养基组成如表1所示）接种到这个烧瓶中，之后在28℃条件下摇动培养1天，形成第一种子培养液。同样，把两个各含有200ml种子培养基A的锥形瓶（其容量均为1升）加以灭菌。在每一烧瓶中接种10ml的第一种子培养液，之后在28℃下摇动培养两天，形成第二培养液。在含有20ml种子培养基B（如表3所示）的灭菌过的200ml容量的锥形瓶中，接种一铂环共存的细菌细胞（在组成如表1所示的一斜面培养基上生长）。然后在28℃下摇动培养两天，形成共存细菌的种子培养液。

向L-山梨糖30克、玉米浸泡液60克、FeSO₄3克、硫酸铵9克、维生素B₂3毫克、蔗糖1.5克和Acfcol（Takeda化学工业公司生产）0.5克中，加自来水至1.660ml。在用NaOH把pH值调至7后，将该混合液灭菌，得到主发酵培养基。向该培养基中，加入300ml氧化细菌的第二培养液和4ml共存细菌的种子培养液，再加入（已预先灭菌的）溶于10ml水的0.3克氯化镧溶液。在已灭菌的容量5升的罐式发酵器上联接一已用0.5%NaOH预先灭菌过的空心纤维膜滤器（Microsa PMP-102，由Asahi化学工业公司生产）和蠕动泵。将上述培养基置于此发酵罐中开始发酵，发酵条件为温度32℃、搅拌速度每分钟800转和通气速度0.5vvm。启动联在pH值传感器上的蠕动泵，其自动加入10N的NaOH水溶液，使pH值维持在6.2的数值上。另外，将270克L-山梨糖溶解于自来水至760ml。灭菌后，把该溶液连续加入到培养液中使其中的L-山梨糖浓度达到约10-30毫克/毫升。结果，18小时后共有300克L-山梨糖被完全氧化，在培养液中富集了283.4克的2KGA。当所有L-山梨糖消耗完毕时发酵停止，并且立即启动上述滤器。2，700ml含有2KGA的滤液被从系统中除过;当发酵罐中的细胞悬浮液的量达到300ml时，操作停止。在发酵罐中加入分别预先灭菌的1，680ml循环使用培养基D和30克L-山梨糖（84ml）。然后进行第二次发酵，其条件同第一次发酵。将270克L-山梨糖于760ml自来水中的溶液按第一次发酵时所用方式加入到发酵罐中。这种发酵重复循环10次。从发酵完成到下一轮发酵开始的时间不到1个小时（包括过滤时间）。每一次发酵所需时间和2KGA富集量见表8。

表8

发酵次数时间(小时) 2KGA富集量(克)

1 18 274.5

2 11.5 290.7

3 10.5 298.2

4 10.5 291.9

5 11 297.6

6 12.5 288.9

7 14 272.6

8 15 286.8

9 16 285.0

10 16 271.8

实施例4

在表1中所示的斜面培养上生长的巨大芽孢杆菌（IFO12108）细胞-生长条件28℃，时间2天，在10ml无菌水中悬浮。把溶液总量接种到一个容积为2升的坂口烧瓶中，烧瓶中含有500ml的预先灭菌的种子培养基（如表3所示），然后在28℃下摇动培养两天，生成共存细菌的种子培养液。在一个容量50升的发酵器中加入30升培养基（如表3所示，pH值7.0），用125℃蒸汽灭菌20分钟。在该发酵器中，加入500ml巨大芽孢杆菌种子培养液，然后培养4天，培养条件为：搅拌速度每分钟200转，通气速度每分钟24升，压力为1.0公斤/平方厘米，温度为28℃。将所得到的培养液用120℃蒸汽灭菌20分钟，然后贮存在冷处，其可以用做灭菌的巨大芽孢杆菌培养液（下文称作巨大培养液）的培养基的成份。

将500ml种子培养基（如表2所示）加入一个容量为两升的坂口烧瓶中，用120℃的蒸气灭菌20分钟。将一斜面假葡糖杆菌属P.Saccharoketogenes TH14-86菌株（在如表1所示的斜面培养基上生长3天，温度为28℃）的细胞接种在上述坂口烧瓶中，在30℃下摇动培养两天。把所得到的培养液转移入含有30升种子培养基〔含有2.0%的D-葡萄糖、3.0%（V/V）的巨大培养液、1.0%的玉米浸泡液、0.5%的酵母膏、0.1%的胨、0.3%的硫酸铵及2.0%的CaCO₃（Shiraishi钙Kaisha有限公司）〕的已灭菌的容量50升的发酵器，然后在32℃温度下培养48小时，培养条件为搅拌速度每分钟150转，通气速度为每分钟15升，压力为1.0公斤/平方厘米，这样形成TH14-86的第二培养液。另外，将500ml种子培养基（如表3所示）加入容量为2升的坂口烧瓶中，以120℃的蒸汽灭菌20分钟。在这个烧瓶中，加入共存细菌巨大芽孢杆菌（IFO12108）的细胞（在如表1所示的斜面培养基上生长），在28℃下摇动培养48小时，形成共生细菌的种子培养液。将80升发酵培养基（如表4所示）的水溶液加入到200升的发酵器中，用125℃的蒸汽灭菌20分钟，然后把2公斤预先灭菌的L-山梨糖（5升）、14升如上所得到的氧化细菌的第二种子培养液和500ml共生细菌的种子培养液加入到发酵器中，再将混合液稀释到100升的终体积。

在搅拌速度每分钟120转、通气速度每分钟70升、压力1.0公斤/平方厘米及温度32℃的条件下，开始发酵。另外，连续加入30升单独无菌制备的含有12公斤L-山梨糖（30升）的水溶液，使发酵器中培养液内L-山梨糖浓度达到10-30毫克/毫升。加入10NMaOH水溶液使培养液pH值保持在6.2。到发酵开始后的16小时，全部L-山梨糖均被消耗掉，累积了13.09公斤的2KGA。发酵停止后，用事先联接在发酵器上的空心纤维膜滤器（PMW302，Asahi化学工业公司）（用0.5%MaOH灭菌）将培养液过滤;将含细胞的部分浓缩至14升。把含有2KGA的滤液从体系中移出;把浓缩的细胞返还到发酵器中。将80升预先灭菌的循环使用培养基A和2公斤L-山梨糖（5升）（单独灭菌）加入到发酵器中;在同第一次发酵一样的条件下开始第二次发酵。在发酵开始时连续加入12公斤的L-山梨糖水溶液（30升）。这种发酵重复进行4次。每次发酵期所需时间和累积的2KGA量详见表9。

表9

发酵次数时间(小时) 2KGA(公斤)

第一次 16 13.0

第二次 12 13.8

第三次 10 13.7

第四次 11 14.0

实施例5

除了循环使用培养基由培养基C替代和滤器由用蒸汽灭菌的陶瓷膜（NGK绝缘体有限公司）替代之外，发酵方式同实施例4。每一次发酵所需时间和2KGA累积量详见表10。

表10

发酵次数时间(小时) 2KGA(公斤)

第一次 16 12.7

第二次 11 13.7

第三次 12 14.1

第四次 13 14.0

实施例6

除循环使用培养基用培养基D替代和滤器用经蒸汽灭菌的连续离心机（BTPX205 ALFA-LAVAL）替代之外，发酵方式同实施例4。每次发酵所需时间和2KGA累积量详见表11。

表11

发酵次数时间(小时) 2KGA(公斤)

第一次 16 13.1

第二次 11 14.4

第三次 10 14.0

第四次 12 14.3

实施例7

发酵方式同实施例1以得到第一种子培养液。将25%、50%、75%或100%的该培养液离心，再用于循环使用的培养。所用的循环使用培养基为培养基D。其它情况同实施例1。这种发酵重复进行4次。发酵完成所需时间详见表12。

表12

时间（小时）

发酵次数 25% 50% 75% 100%

第一次 28 28 28 28

第二次 22 16 12 13

第三次 22 16 12 12

第四次 23 18 13 12

Claims

1、一种生产2-酮基-L-古洛糖酸(下文简称2KGA)的方法，该方法包括：

(1)在含有能生成2KGA底物的液体培养基中培养能由L-山梨糖生成2KGA的微生物，

(2)在回收培养液中的微生物的同时，回收所生成的2KGA，

(3)把所回收的微生物接种到新的液体培养基中以用于以下的培养和

(4)重复上述培养并至少再回收一次。

2、权利要求1的方法，其中所述的能由L-山梨糖生成2KGA的微生物是假葡糖杆菌属、葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、醋杆菌属或欧文氏菌属微生物。

3、权利要求1的方法，其中所述的能由L-山梨糖生成2KGA的微生物是假葡糖杆菌属或葡糖杆菌属微生物。

4、权利要求1的方法，其中所述的能由L-山梨糖生成2KGA的微生物是假葡糖杆菌属微生物。

5、权利要求4的方法，其中能生成2KGA的微生物选自：

假葡糖杆菌属P.Saccharoketogenes K591S（FERM BP-1130）

P.Saccharoketogenes TH14-86（FERM BP-1128）

P.Saccharoketogenes12-5（FERM BP-1129）

P.Saccharoketogenes12-4（FERM BP-1131）

P.Saccharoketogenes22-3（FERM BP-1133）

6、权利要求3的方法，其中能由L-山梨糖生成2KGA的微生物在能提供生长因子的共存微生物存在下进行培养。

7、权利要求6的方法，其中可为由L-山梨糖生成2KGA的微生物提供生长因子的共存微生物是芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、变形杆菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄单胞杆菌属或黄杆菌属的细菌。

8、权利要求6的方法，其中可为由L-山梨糖生成2KGA的微生物提供生长因子的共存微生物是蜡状芽孢杆菌IFO3131、地衣形芽孢杆菌IFO12201、巨大芽孢杆菌IFO12108、短小芽孢杆菌IFO12090、解淀粉芽孢杆菌IFO3022、枯草芽孢杆菌IFO13719、环状芽孢杆菌IFO3967、三叶草假单胞菌IFO12056、嗜麦芽假单胞菌IFO12692、无恒变形菌12930、弗劳地枸橼酸杆菌IFO13544、阴沟肠杆菌IFO3320、欧文氏菌属E.herbicola IFO12686、豌豆黄单胞杆菌IFO13556、柑桔黄单胞杆菌IFO3835或脑膜脓毒性黄杆菌IFO12535。