CN110146627A - 一种高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸(α‑十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3‑二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸)的分析试剂盒，具体内容包括替代基质的预处理，干血斑样本的处理等。本方法灵敏度较高，用时较短，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种高效液相色谱串质谱连用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒及其应用。
背景技术
游离脂肪酸(Free Fatty acids，FFAs)在组织能量供应中起着重要作用，尤其是空腹状态下。正常的游离脂肪酸水平对人体健康至关重要，不同的游离脂肪酸在生理和病理状态下发挥着不同的作用，如二十碳五烯酸(C20：5)和二十二碳六烯酸(C22：6)，对炎症、癌症、动脉硬化、胰岛素抵抗和2型糖尿病具有一定的保护作用。
流行病学研究表明，脂肪酸与胰岛素抵抗、心血管疾病、2型糖尿病、高血压、肥胖等慢性病以及乳腺癌、结肠癌等疾病的发生具有一定的关联性。人体血清中脂肪酸的组成及其水平是人体摄入脂肪酸和代谢后的重要指标，进行人体血液中脂肪酸组分分析有助于健康状况评价。
Ω3含有丰富的不饱和脂肪酸(EPA和DHA)，是人体必需的不饱和脂肪酸，有助于调节血脂，预防心脑血管疾病。降低血液粘稠度，保持血液畅通流动，预防血栓形成与中风。增强脑细胞活力，改善记忆力及视力，预防老年痴呆症。EPA降低血液粘稠度，调节血脂，预防动脉硬化。增强心脑血管的健康及肾脏功能。DHA活化脑细胞，增强记忆力。有益于眼部健康，改善视力、延缓视力的衰退。调节血脂，降低血液胆固醇和甘油三脂的含量，提高高密度脂蛋白的含量,强化免疫系统。
然而，现有技术中虽然有一些针对游离脂肪酸的检测方法，但是往往操作较为复杂(如需要萃取步骤)、检测灵敏度较低，并且难以同时定量检测多种游离脂肪酸。因此，本领域迫切需要开发新的检测灵敏度较高并且能够同时定量检测多种游离脂肪酸的技术。目前尚未见同时检测这4种物质的方法及试剂盒的相关报道。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，
所述的4种游离脂肪酸分别为：α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸；
所述的分析试剂盒包括如下试剂：
(1)标准品溶液：含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液；
(2)质控品溶液：含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液；
(3)含有内标的提取液：含有十八碳三烯酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5的甲醇溶液；
(4)衍生剂：
衍生剂1：10％v/v乙酰氯的二氯甲烷溶液；
衍生剂2：1％v/v三吡啶甲基胺的乙腈溶液；
(5)复溶液：饱和一元醇；
(6)流动相添加剂A：为饱和一元羧酸；
(7)流动相添加剂B：为C1-C3胺化合物。
其中，所述的试剂盒还包括：96孔反应板和说明书。
其中，所述的标准品为含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液，具体浓度见表1，
表1 4种游离脂肪酸标准品对应的浓度(μM)
| 脂肪酸 | J1 | J2 | J3 | J4 | J5 | J6 | J7 |
| α-十八碳三烯酸 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 | 4 | 2 |
| 二十碳五烯酸 | 20 | 10 | 4 | 2 | 1 | 0.4 | 0.2 |
| ω3-二十二碳五烯酸 | 50 | 25 | 10 | 5 | 2.5 | 1 | 0.5 |
| 二十二碳六烯酸 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 | 4 | 2 |
。
其中，所述的质控品为含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液，分高、低两个浓度，分别为QCH、QCL；
其中QCH、QCL中4种游离脂肪酸质控品对应的浓度见表2：
表2 4种游离脂肪酸质控品对应的浓度(μM)
| 脂肪酸 | QCL | QCH |
| α-十八碳三烯酸 | 12 | 120 |
| 二十碳五烯酸 | 1.2 | 12 |
| ω3-二十二碳五烯酸 | 3 | 30 |
| 二十二碳六烯酸 | 12 | 120 |
。
其中，所述的含有内标的提取液为含有200nM十八碳三烯酸-13C18、200nM二十碳五烯酸-d5、200nM二十二碳六烯酸-d5的甲醇溶液。
其中，所述的流动相添加剂B为甲酸胺。
其中，所述的复溶液为乙醇。
其中，所述饱和一元羧酸为甲酸、乙酸、丙酸或丁酸中之一或它们的组合，优选甲酸和乙酸中的任意一个或两者的组合物，更优选甲酸。
上述试剂盒的制备方法，包括
(1)标准品：
浓度为J1标准品的制备：分别取50mMα-十八碳三烯酸160μL、100mM二十碳五烯酸8μL、100mMω3-二十二碳五烯酸20μL、50mM二十二碳六烯酸160μL，分别加入1652μL的甲醇，制备4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸；再取4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至3000μL，即得浓度为J1标准品；
浓度为J2标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各500μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J2标准品；
浓度为J3标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各200μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J3标准品；
浓度为J4标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至1500μL，即得浓度为J4标准品；
浓度为J5标准品的制备：取浓度为J2的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J5标准品；
浓度为J6标准品的制备：取浓度为J3的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J6标准品；
浓度为J7标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J7标准品；
(2)质控品：
浓度为QCH标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCH标准品；
浓度为QCL标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCL标准品；
(3)含有内标的提取液：；
分别取20μM氘代同位素内标物450μL，包括十碳三烯八酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5，加入45mL甲醇配置得到浓度均为200nM的混合内标；
(4)衍生剂：
衍生剂1：配置10％v/v乙酰氯的二氯甲烷溶液；
衍生剂2：配置1％v/v三吡啶甲基胺的乙腈溶液；
(5)复溶液：饱和一元醇；
(6)流动相添加剂A：饱和一元羧酸；
(7)流动相添加剂B：C1-C3胺化合物。
上述试剂盒在利用高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸中的应用。
具体应用方法为：采用高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法包括如下步骤：先用高效液相色谱将4种游离脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品与内标物的峰面积比值为Y轴，建立校准曲线，计算上述4种游离酸的含量，具体的色谱条件为：
(1)高效液相色谱色谱条件：
色谱柱型号：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm；
流动相A：0.1vt％饱和一元羧酸的水溶液；
流动相B：0.1vt％饱和一元羧酸和0.1vt％C1-C3胺化合物的甲醇溶液；
柱温：40℃；
流速：0.4mL/min；
进样量：2μL；
运行时间：12min；
采用梯度模式洗脱的方式，见表3；
表3流动相梯度洗脱参数
| 时间/min | 流速/mL/min | A/％ | B/％ |
| 0 | 0.4 | 30 | 70 |
| 8 | 0.4 | 0 | 100 |
| 10 | 0.4 | 0 | 100 |
| 12 | 0.4 | 30 | 70 |
(2)质谱条件：
在电喷雾离子正离子检测模式下，采用多反应监测的扫描模式；接口电压为4kV；DL温度：250℃；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；干燥气：10L/min；雾化气：3L/min；各目标物相应的保留时间、多反应监测离子对及电压参数见表4；
表4多反应监测离子对及相应的电压参数
其中，所述的人干血斑按照如下方法制备得到：(1)提取：取直径6mm干血斑样本于2mL离心管中，向其中加入200μL含内标的提取液，然后以2500rpm涡旋震荡30min，将上述混合溶液取150μL溶液用氮气仪吹干；(2)衍生：再加入200μL衍生试剂1(10vt％乙酰氯的二氯甲烷溶液)，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生30min，吹干；再加入200μL衍生试剂2(1vt％三吡啶甲基胺的乙腈溶液)，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生5min，吹干；(3)复溶：加400μL复溶液(饱和一元醇)，室温下，以2500rpm涡旋震荡混匀5min。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
有益效果
本发明的主要优点包括：(1)本方法可以同时检测α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，故检测效率高；(2)本方法检测α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的标准曲线线性相关性高，故检测结果准确度高。
附图说明
图1为α-十八碳三烯酸标准品色谱图。
图2为十八碳三烯酸-13C18同位素内标色谱图。
图3为二十碳五烯酸标准品色谱图。
图4为二十碳五烯酸-d5同位素内标色谱图。
图5为ω3-二十二碳五烯酸标准品色谱图。
图6为二十二碳六烯酸-d5同位素内标色谱图(为ω3-二十二碳五烯酸的内标)。
图7为二十二碳六烯酸标准品色谱图。
图8为二十二碳六烯酸-d5同位素内标色谱图(为二十二碳六烯酸两个化合物的内标)。
图9为α-十八碳三烯酸标准曲线图。
图10为二十碳五烯酸标准曲线图。
图11为ω3-二十二碳五烯酸标准曲线图。
图12为二十二碳六烯酸标准曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次开发了一种高效液相色谱质谱联用法，所述方法采用特定的流动相以及特定的质谱检测条件，不仅简化操作，并且可以在一次检测中同时定量检测出4种游离脂肪酸(α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸)，且检测结果的灵敏度高，检测结果准确性高。在此基础上完成了本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
术语
如本发明所用，术语“二十碳五烯酸-d5”和“二十碳五烯酸-2H5”可互换使用，指二十碳五烯酸中H被同位素氘所取代后形成的氘代物。在本发明中，它可被用作二十碳五烯酸质谱检测的内标。
术语“电子电离”如本发明所用是指这样的方法，其中气态或蒸汽相中的感兴趣分析物与电子流相互作用。电子与分析物的相互作用产生分析物离子，其然后可用于质谱法技术。
术语“化学电离”如本发明所用是指这样的方法，其中试剂气体(例如氨)用于电子碰撞，并且分析物离子通过试剂气体离子与分析物分子相互作用而形成。
术语“电离”如本发明所用是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。
术语“大约”如本发明所用在提及定量测量时是指所示值加上或减去10％。
检测方法
如本发明所用，“液相层析”(LC)是指当流体均一地通过细微分开的物质的柱或者通过毛细管道过滤时流体溶液的一种或多种组分选择性延迟的方法。延迟是由于当该流体相对于固定相(或多个)移动时混合物的组分在一个或多个固定相和本体流体(bulkfluid)(即流动相)之间的分布。“液相层析”包括反相液相层析(RPLC)、高效液相层析(HPLC)和高湍流液相层析(HTLC)。
如本发明所用，术语“HPLC”或“高效液相层析”是指这样的液相层析，其中分离程度是通过使流动相在压力下穿过固定相通常为紧密填充柱而增加的。
如本发明所用，“质谱法”(MS)是指通过它们的质量鉴定化合物的分析技术。MS技术一般包括(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比(m/z)。化合物可通过任何合适的方式电离并检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。
以下实施例所使用的仪器和材料来源如下：
(1)仪器：质谱：岛津8045；液相色谱：岛津LC-20AD；涡旋震荡：杭州奥盛仪器有限公司的多管涡旋混合器MTV100、微孔板振荡器MX100-4A；氮吹仪：AgelaTechnologes 96孔氮吹仪；玻璃仪器等。
(2)试剂耗材：色谱级甲醇；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm 3.5μm。
(3)标准品：十碳三烯八酸-13C18购自Medicalisotopes，纯度≥95％，二十碳五烯酸-d5和二十二碳六烯酸-d5购自Sigma公司，纯度均≥95％。
实施例1
分析试剂盒见表5。
表5分析试剂盒组分的制备
上述试剂盒的制备方法如下：
(1)标准品：
浓度为J1标准品的制备：分别取50mMα-十八碳三烯酸160μL、100mM二十碳五烯酸8μL、100mMω3-二十二碳五烯酸20μL、50mM二十二碳六烯酸160μL，分别加入1652μL的甲醇，制备4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸；再取4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至3000μL，即得浓度为J1标准品；
浓度为J2标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各500μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J2标准品；
浓度为J3标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各200μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J3标准品；
浓度为J4标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至1500μL，即得浓度为J4标准品；
浓度为J5标准品的制备：取浓度为J2的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J5标准品；
浓度为J6标准品的制备：取浓度为J3的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J6标准品；
浓度为J7标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J7标准品；
(2)质控品：
浓度为QCH标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCH标准品；
浓度为QCL标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCL标准品；
(3)含有内标的提取液：；
分别取20μM氘代同位素内标物450μL，包括十碳三烯八酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5，加入45mL甲醇配置得到浓度均为200nM的混合内标；
(4)衍生剂：
衍生剂1：配置10％v/v乙酰氯的二氯甲烷溶液；
衍生剂2：配置1％v/v三吡啶甲基胺的乙腈溶液；
(5)复溶液：乙醇；
(6)流动相添加剂A：甲酸；
(7)流动相添加剂B：甲酸胺。
实施例2
1、前处理
检测样本处理：(1)提取：取直径6mm干血斑样本于2mL离心管中，向其中加入200μL含内标的提取液，然后以2500rpm涡旋震荡30min，将上述混合溶液取150μL溶液用氮气仪吹干；(2)衍生：再加入200μL衍生试剂1(10vt％乙酰氯的二氯甲烷溶液)，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生30min，吹干；再加入200μL衍生试剂2(1vt％三吡啶甲基胺的乙腈溶液)，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生5min，吹干；(3)复溶：加400μL复溶液(饱和一元醇)，室温下，以2500rpm涡旋震荡混匀5min。
标准品：与检测样本的处理方法一致，此处不再赘述；
质控品处理：与检测样本的处理方法一致，此处不再赘述。
2、取处理好的标准品、质控品、检测样本注入到高效液相色谱串质谱中进行检测，其联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法包括如下步骤：先用高效液相色谱将4种游离脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品与内标物的峰面积比值为Y轴，建立校准曲线，计算上述4种游离酸的含量，具体的色谱条件为：
(1)高效液相色谱色谱条件：
色谱柱型号：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm；
流动相A：0.1vt％饱和一元羧酸的水溶液；
流动相B：0.1vt％饱和一元羧酸和0.1vt％C1-C3胺化合物的甲醇溶液；
柱温：40℃；
流速：0.4mL/min；
进样量：2μL；
运行时间：12min；
采用梯度模式洗脱的方式，见表3；
表3流动相梯度洗脱参数
| 时间/min | 流速/mL/min | A/％ | B/％ |
| 0 | 0.4 | 30 | 70 |
| 8 | 0.4 | 0 | 100 |
| 10 | 0.4 | 0 | 100 |
| 12 | 0.4 | 30 | 70 |
(2)质谱条件：
在电喷雾离子正离子检测模式下，采用多反应监测的扫描模式；接口电压为4kV；DL温度：250℃；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；干燥气：10L/min；雾化气：3L/min；各目标物相应的保留时间、多反应监测离子对及电压参数见表4；
表4多反应监测离子对及相应的电压参数
其中，上述干血斑按照如下方法制备得到：(1)提取：取直径6mm干血斑样本于2mL离心管中，向其中加入200μL含内标的提取液，然后以2500rpm涡旋震荡30min，将上述混合溶液取150μL溶液用氮气仪吹干；(2)衍生：再加入200μL衍生试剂1(10vt％乙酰氯的二氯甲烷溶液)，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生30min，吹干；再加入200μL衍生试剂2(1vt％三吡啶甲基胺的乙腈溶液)，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生5min，吹干；(3)复溶：加400μL乙醇，室温下，以2500rpm涡旋震荡混匀5min。其中，所述的含内标的提取液为分别取20μM氘代同位素内标物450μL，包括十碳三烯八酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5，加入45mL甲醇配置得到浓度均为200nM的含内标的提取液。
其中，所述标准品按照如下方法处理得到：
浓度为J1标准品的制备：分别取50mMα-十八碳三烯酸160μL、100mM二十碳五烯酸8μL、100mMω3-二十二碳五烯酸20μL、50mM二十二碳六烯酸160μL，分别加入1652μL的甲醇，制备4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸；再取4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至3000μL，即得浓度为J1标准品；
浓度为J2标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各500μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J2标准品；
浓度为J3标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各200μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J3标准品；
浓度为J4标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至1500μL，即得浓度为J4标准品；
浓度为J5标准品的制备：取浓度为J2的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J5标准品；
浓度为J6标准品的制备：取浓度为J3的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J6标准品；
浓度为J7标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J7标准品。
其中，质控品的制备方法为：
浓度为QCH质控品：分别取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCH质控品；
浓度为QCL质控品的：分别取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCL质控品。
实施例3：性能验证
图1为α-十八碳三烯酸标准品色谱图，图2为十八碳三烯酸-13C18同位素内标色谱图，图3为二十碳五烯酸标准品色谱图，图4为二十碳五烯酸-d5同位素内标色谱图，图5为ω3-二十二碳五烯酸标准品色谱图，图6为二十二碳六烯酸-d5同位素内标色谱图(为ω3-二十二碳五烯酸的内标)。图7为二十二碳六烯酸标准品色谱图，图8为二十二碳六烯酸-d5同位素内标色谱图(为二十二碳六烯酸两个化合物的内标)。，其各物质的出峰位置分别为5.033min，5.052min，5.049min，5.058min，6.626min，5.939min，6.094min和5.939min，这8种物质虽然没有完全分离，但对于LC-MS/MS的检测足以满足定量要求，无需完全分离。
(2)标准曲线
采用同位素内标定量法以7个标准品的标示浓度为横坐标(x)，以7个标准品与内标物峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并计算人干血斑中待测物的浓度。7种游离脂肪酸在各自范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.999以内，满足定量要求，见表6。
表6脂肪酸线性回归方程及线性相关系数
检测样本结果的计算：将检测样本的实际峰面积与内标峰面积的比值代入上述标准曲线方程，计算检测样本中待测化合物的浓度，见表7～表10。
表7α-十八碳三烯酸
表8二十碳五烯酸
表9ω3-二十二碳五烯酸
表10二十二碳六烯酸
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.一种高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，
所述的4种游离脂肪酸分别为：α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸；
所述的分析试剂盒包括如下试剂：
(1)标准品溶液：含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液；
(2)质控品溶液：含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液；
(3)含有内标的提取液：含有十八碳三烯酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5的甲醇溶液；
(4)衍生剂：
衍生剂1：10％v/v乙酰氯的二氯甲烷溶液；
衍生剂2：1％v/v三吡啶甲基胺的乙腈溶液；
(5)复溶液：饱和一元醇；
(6)流动相添加剂A：为饱和一元羧酸；
(7)流动相添加剂B：为C1-C3胺化合物。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：96孔反应板和说明书。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，所述的标准品为含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液，具体浓度见表1，
表1 4种游离脂肪酸标准品对应的浓度(μM)
。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，所述的质控品为含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液，分高、低两个浓度，分别为QCH、QCL；
其中QCH、QCL中4种游离脂肪酸质控品对应的浓度见表2：
表2 4种游离脂肪酸质控品对应的浓度(μM)
。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，所述的含有内标的提取液为含有200nM十八碳三烯酸-13C18、200nM二十碳五烯酸-d5、200nM二十二碳六烯酸-d5的甲醇溶液。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，所述的流动相添加剂B为甲酸胺。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，所述的复溶液为乙醇。
8.根据权利要求1所述的高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，所述饱和一元羧酸为甲酸、乙酸、丙酸或丁酸中的任意一个或几个的组合物。
9.根据权利要求8所述的高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，所述饱和一元羧酸为甲酸和乙酸中的任意一个或两者的组合物。
10.根据权利要求8或9所述的高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，其特征在于，所述饱和一元羧酸为甲酸。
11.权利要求1～10中任意一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：
(1)标准品：
浓度为J1标准品的制备：分别取50mMα-十八碳三烯酸160μL、100mM二十碳五烯酸8μL、100mMω3-二十二碳五烯酸20μL、50mM二十二碳六烯酸160μL，分别加入1652μL的甲醇，制备4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸；再取4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至3000μL，即得浓度为J1标准品；
浓度为J2标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各500μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J2标准品；
浓度为J3标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各200μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J3标准品；
浓度为J4标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至1500μL，即得浓度为J4标准品；
浓度为J5标准品的制备：取浓度为J2的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J5标准品；
浓度为J6标准品的制备：取浓度为J3的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J6标准品；
浓度为J7标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J7标准品；
(2)质控品：
浓度为QCH标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCH标准品；
浓度为QCL标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCL标准品；
(3)含有内标的提取液：；
分别取20μM氘代同位素内标物450μL，包括十碳三烯八酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5，加入45mL甲醇配置得到浓度均为200nM的混合内标；
(4)衍生剂：
衍生剂1：配置10％v/v乙酰氯的二氯甲烷溶液；
衍生剂2：配置1％v/v三吡啶甲基胺的乙腈溶液；
(5)复溶液：饱和一元醇；
(6)流动相添加剂A：饱和一元羧酸；
(7)流动相添加剂B：C1-C3胺化合物。
12.权利要求1～10中任意一项所述的试剂盒在利用高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸中的应用。
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