CN110146629A - 高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法 - Google Patents
高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110146629A CN110146629A CN201910527204.3A CN201910527204A CN110146629A CN 110146629 A CN110146629 A CN 110146629A CN 201910527204 A CN201910527204 A CN 201910527204A CN 110146629 A CN110146629 A CN 110146629A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- concentration
- standard items
- kinds
- octatecatrienoic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明提供一种高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸(α‑十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3‑二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸)的方法。先用高效液相色谱将4种游离脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品与内标物的峰面积比值为Y轴，建立校准曲线，计算人干血斑中上述4种游离酸的含量。本发明方法灵敏度较高、特异性强、准确且前处理过程简单，用时较短，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种高效液相色谱串质谱连用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法。
背景技术
游离脂肪酸(Free Fatty acids，FFAs)在组织能量供应中起着重要作用，尤其是空腹状态下。正常的游离脂肪酸水平对人体健康至关重要，不同的游离脂肪酸在生理和病理状态下发挥着不同的作用，如二十碳五烯酸(C20：5)和二十二碳六烯酸(C22：6)，对炎症、癌症、动脉硬化、胰岛素抵抗和2型糖尿病具有一定的保护作用。
流行病学研究表明，脂肪酸与胰岛素抵抗、心血管疾病、2型糖尿病、高血压、肥胖等慢性病以及乳腺癌、结肠癌等疾病的发生具有一定的关联性。人体血清中脂肪酸的组成及其水平是人体摄入脂肪酸和代谢后的重要指标，进行人体血液中脂肪酸组分分析有助于健康状况评价。
Ω3含有丰富的不饱和脂肪酸(EPA和DHA)，是人体必需的不饱和脂肪酸，有助于调节血脂，预防心脑血管疾病。降低血液粘稠度，保持血液畅通流动，预防血栓形成与中风。增强脑细胞活力，改善记忆力及视力，预防老年痴呆症。EPA降低血液粘稠度，调节血脂，预防动脉硬化。增强心脑血管的健康及肾脏功能。DHA活化脑细胞，增强记忆力。有益于眼部健康，改善视力、延缓视力的衰退。调节血脂，降低血液胆固醇和甘油三脂的含量，提高高密度脂蛋白的含量，强化免疫系统。
然而，现有技术中虽然有一些针对游离脂肪酸的检测方法，但是往往操作较为复杂(如需要萃取步骤)、检测灵敏度较低，并且难以同时定量检测多种游离脂肪酸。因此，本领域迫切需要开发新的检测灵敏度较高并且能够同时定量检测多种游离脂肪酸的技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，
其中，所述的4种游离脂肪酸为：α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸；
采用高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法包括如下步骤：先用高效液相色谱将4种游离脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品与内标物峰面积的比值为Y轴，建立校准曲线，计算上述4种游离酸的含量，具体的色谱条件为：
(1)高效液相色谱色谱条件：
色谱柱型号：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm；
流动相A：0.1vt％饱和一元羧酸的水溶液；
流动相B：0.1vt％饱和一元羧酸和0.1％C1-C3胺化合物的甲醇溶液；
其中，所述的C1-C3胺化合物优选甲酸铵；
柱温：40℃；
流速：0.4mL/min；
进样量：2μL；
运行时间：12min；
采用梯度模式洗脱的方式，见表1；
表1流动相梯度洗脱参数
| 时间/min | 流速/mL/min | A/％ | B/％ |
| 0 | 0.4 | 30 | 70 |
| 8 | 0.4 | 0 | 100 |
| 10 | 0.4 | 0 | 100 |
| 12 | 0.4 | 30 | 70 |
(2)质谱条件：
在电喷雾离子正离子检测模式下，采用多反应监测的扫描模式；接口电压为4kV；DL温度：250℃；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；检测器：Novaclinlc-MS4500+；干燥气：10L/min；雾化气：3L/min；各目标物相应的保留时间、多反应监测离子对及电压参数见表2；
表2多反应监测离子对及相应的电压参数
其中，二十二碳六烯酸-d5同时做ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸两个化合物的内标。
其中，所述的经过预处理的人干血斑按照如下方法制备得到：(1)提取：取直径6mm干血斑样本于2mL离心管中，向其中加入200μL含有内标的提取液，然后以2500rpm涡旋震荡30min，将上述混合溶液取150μL溶液用氮气仪吹干；(2)衍生：再加入200μL衍生试剂1，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生30min，吹干；再加入200μL衍生试剂2，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生5min，吹干；(3)复溶：加400μL复溶液，室温下，以2500rpm涡旋震荡混匀5min。
其中，步骤(1)中，所述的含有内标的提取液按照如下方法制备得到：所述的含内标的提取液按照如下方法制备得到：分别取20μM氘代同位素内标物450μL，包括十碳三烯八酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5，加入45mL甲醇配置得到浓度均为200nM的含内标的提取液。
其中，步骤(2)中，所述的衍生试剂1为10vt％乙酰氯的二氯甲烷溶液；衍生试剂2为1vt％三吡啶甲基胺的乙腈溶液。
其中，步骤(3)中，所述的复溶液为饱和一元醇；
其中，所述饱和一元醇优选乙醇。
其中，所述的标准品为含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液，具体浓度见表1。
其中，所述的标准品按照如下步骤制备得到：
浓度为J1标准品的制备：分别取50mMα-十八碳三烯酸160μL、100mM二十碳五烯酸8μL、100mMω3-二十二碳五烯酸20μL、50mM二十二碳六烯酸160μL，分别加入1652μL的甲醇，制备4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸；再取4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至3000μL，即得浓度为J1标准品；
浓度为J2标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各500μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J2标准品；
浓度为J3标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各200μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J3标准品；
浓度为J4标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至1500μL，即得浓度为J4标准品；
浓度为J5标准品的制备：取浓度为J2的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J5标准品；
浓度为J6标准品的制备：取浓度为J3的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J6标准品；
浓度为J7标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J7标准品。
其中，所述的质控品为含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液，分高、低两个浓度，分别是QCH、QCL，具体浓度见表4，
表4 4种游离脂肪酸质控品对应的浓度(μM)
| 脂肪酸 | QCL | QCH |
| α-十八碳三烯酸 | 12 | 120 |
| 二十碳五烯酸 | 1.2 | 12 |
| ω3-二十二碳五烯酸 | 3 | 30 |
| 二十二碳六烯酸 | 12 | 120 |
其中，质控品的制备方法为：
浓度为QCH质控品：分别取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCH质控品；
浓度为QCL质控品的：分别取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCL质控品。
其中，所述的高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法包括如下步骤：
(1)先利用电喷雾离子源对4种游离脂肪酸和内标进行电离，分别产生4种游离脂肪酸和内标的至少一种前体离子；
(2)分别产生4种游离脂肪酸和内标的前体离子的一种或多种碎片离子；和
(3)比较步骤(1)或(2)或两者中产生的所述4种游离脂肪酸和内标的一种或多种离子的量以确定人干血斑中的4种游离脂肪酸的量。
其中，步骤(1)中，所述前体离子的质/荷比为369.1/92.1，393.1/92.1，421.2/92.1，419.2/92.1，387.1/92.1，398.1/92.1，424.1/92.1中的任意一个或多个组合。
其中，所述的游离脂肪酸的母离子的质/荷比分别为369.1±0.2，393.1±0.2，421.2±0.2，419.2±0.2。
其中，所述的游离脂肪酸的碎片离子的质/荷比分别为为92.1±0.2，92.1±0.2，92.1±0.2，92.1±0.2。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
有益效果
本发明的主要优点包括：(1)本方法可以同时检测α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，故检测效率高；(2)本方法检测α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的标准曲线线性相关性高，故检测结果准确度高。
附图说明
图1为α-十八碳三烯酸标准品色谱图。
图2为十八碳三烯酸-13C18同位素内标色谱图。
图3为二十碳五烯酸标准品色谱图。
图4为二十碳五烯酸-d5同位素内标色谱图。
图5为ω3-二十二碳五烯酸标准品色谱图。
图6为二十二碳六烯酸-d5同位素内标色谱图(为ω3-二十二碳五烯酸的内标)。
图7为二十二碳六烯酸标准品色谱图。
图8为二十二碳六烯酸-d5同位素内标色谱图(为二十二碳六烯酸两个化合物的内标)。
图9为α-十八碳三烯酸标准曲线图。
图10为二十碳五烯酸标准曲线图。
图11为ω3-二十二碳五烯酸标准曲线图。
图12为二十二碳六烯酸标准曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次开发了一种高效液相色谱质谱联用法，所述方法采用特定的流动相以及特定的质谱检测条件，不仅简化操作，并且可以在一次检测中同时定量检测出4种游离脂肪酸(α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸)，且检测结果的灵敏度高，检测结果准确性高。在此基础上完成了本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
术语
如本发明所用，术语“二十碳五烯酸-d5”和“二十碳五烯酸-2H5”可互换使用，指二十碳五烯酸中H被同位素氘所取代后形成的氘代物。在本发明中，它可被用作二十碳五烯酸质谱检测的内标。
术语“电子电离”如本发明所用是指这样的方法，其中气态或蒸汽相中的感兴趣分析物与电子流相互作用。电子与分析物的相互作用产生分析物离子，其然后可用于质谱法技术。
术语“化学电离”如本发明所用是指这样的方法，其中试剂气体(例如氨)用于电子碰撞，并且分析物离子通过试剂气体离子与分析物分子相互作用而形成。
术语“电离”如本发明所用是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。
术语“大约”如本发明所用在提及定量测量时是指所示值加上或减去10％。
检测方法
如本发明所用，“液相层析”(LC)是指当流体均一地通过细微分开的物质的柱或者通过毛细管道过滤时流体溶液的一种或多种组分选择性延迟的方法。延迟是由于当该流体相对于固定相(或多个)移动时混合物的组分在一个或多个固定相和本体流体(bulkfluid)(即流动相)之间的分布。“液相层析”包括反相液相层析(RPLC)、高效液相层析(HPLC)和高湍流液相层析(HTLC)。
如本发明所用，术语“HPLC”或“高效液相层析”是指这样的液相层析，其中分离程度是通过使流动相在压力下穿过固定相通常为紧密填充柱而增加的。
如本发明所用，“质谱法”(MS)是指通过它们的质量鉴定化合物的分析技术。MS技术一般包括(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比(m/z)。化合物可通过任何合适的方式电离并检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。
实施例1：
1、材料
方法学研究实验的样品来源于北京博尔西科技提供的人全血的人干血斑。
(1)仪器：质谱：岛津8045；液相色谱：岛津LC-20AD；涡旋震荡：杭州奥盛仪器有限公司的多管涡旋混合器MTV100、微孔板振荡器MX100-4A；氮吹仪Agela Technologes 96孔氮吹仪；玻璃仪器等。
(2)试剂耗材：色谱级甲醇；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm 3.5μm。
(3)标准品：十碳三烯八酸-13C18购自Medicalisotopes，纯度≥95％，二十碳五烯酸-d5和二十二碳六烯酸-d5购自Sigma公司，纯度均≥95％。
2、方法
(1)色谱条件：流动相A：0.1vt％饱和甲酸的水溶液；流动相B：0.1vt％饱和甲酸和0.1％甲酸铵的甲醇溶液；色谱柱型号：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm；采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.4mL/min，柱温为40℃，进样量为2μL，运行时间为12min。
(2)质谱条件：
在电喷雾(ESI)离子正离子检测模式下，采用多反应监测的扫描模式；接口电压为4kV；DL温度：250℃；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；干燥气：10L/min；雾化气：3L/min；各目标物相应的保留时间、多反应监测离子对及电压参数见表2；
(3)标品配置：
浓度为J1标准品的制备：分别取50mMα-十八碳三烯酸160μL、100mM二十碳五烯酸8μL、100mMω3-二十二碳五烯酸20μL、50mM二十二碳六烯酸160μL，分别加入1652μL的甲醇，制备4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸；再取4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至3000μL，即得浓度为J1标准品；
浓度为J2标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各500μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J2标准品；
浓度为J3标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各200μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J3标准品；
浓度为J4标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至1500μL，即得浓度为J4标准品；
浓度为J5标准品的制备：取浓度为J2的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J5标准品；
浓度为J6标准品的制备：取浓度为J3的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J6标准品；
浓度为J7标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J7标准品。
(4)质控品的配置：
浓度为QCH质控品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCH标准品；
浓度为QCL质控品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各600μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为QCL标准品。
(5)含内标的提取液的配置：分别取20μM氘代同位素内标物450μL，包括十碳三烯八酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5，加入45mL甲醇配置得到浓度均为200nM的含内标的提取液。
(6)样品处理：(1)提取：取直径6mm干血斑样本于2mL离心管中，向其中加入200μL含有内标的提取液，然后以2500rpm涡旋震荡30min，将上述混合溶液取150μL溶液用氮气仪吹干；(2)衍生：再加入200μL衍生试剂1(10vt％乙酰氯的二氯甲烷溶液)，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生30min，吹干；再加入200μL衍生试剂2(1vt％三吡啶甲基胺的乙腈溶液)，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生5min，吹干；(3)复溶：加400μL乙醇，室温下，以2500rpm涡旋震荡混匀5min。
其中，所述的衍生试剂1为10vt％乙酰氯的二氯甲烷溶液；衍生试剂2为1vt％三吡啶甲基胺的乙腈溶液，复溶液为乙醇。
标准品处理：与样品的处理方法一致，此处不再赘述；
质控品处理：与样品的处理方法一致，此处不再赘述。
(7)上机检测：取处理好的标准品、质控品和检测样本溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，并记录色谱图与检测样本中α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸和同位素内标十八碳三烯酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5峰面积。
3、方法验证
(1)离子流色谱图
图1为α-十八碳三烯酸标准品色谱图，图2为十八碳三烯酸-13C18同位素内标色谱图，图3为二十碳五烯酸标准品色谱图，图4为二十碳五烯酸-d5同位素内标色谱图，图5为ω3-二十二碳五烯酸标准品色谱图，图6为二十二碳六烯酸-d5同位素内标色谱图(为ω3-二十二碳五烯酸的内标)，图7为二十二碳六烯酸标准品色谱图，图8为二十二碳六烯酸-d5同位素内标色谱图(为二十二碳六烯酸两个化合物的内标)，其各物质的出峰位置分别为5.033min，5.052min，5.049min，5.058min，6.626min，5.939min，6.094min和5.939min，这8种物质虽然没有完全分离，但对于LC-MS/MS的检测足以满足定量要求，无需完全分离。
(2)标准曲线
采用同位素内标定量法以7个标准品的标示浓度为横坐标(x)，以7个标准品与内标物峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并计算人干血斑中待测物的浓度。7种游离脂肪酸在各自范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.999以内，满足定量要求，见表5。
表5脂肪酸线性回归方程及线性相关系数
检测样本结果的计算：将检测样本的实际峰面积与内标峰面积的比值代入上述标准曲线方程，计算检测样本中待测化合物的浓度，见表6～表9。
表6 α-十八碳三烯酸
表7二十碳五烯酸
表8 ω3-二十二碳五烯酸
表9二十二碳六烯酸
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，
所述的4种游离脂肪酸为：α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸；
采用高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法包括如下步骤：先用高效液相色谱将4种游离脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品与内标物的峰面积比值为Y轴，建立校准曲线，计算上述4种游离酸的含量，具体的色谱条件为：
(1)高效液相色谱色谱条件：
色谱柱型号：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm；
流动相A：0.1vt％饱和一元羧酸的水溶液；
流动相B：0.1vt％饱和一元羧酸和0.1vt％C1-C3胺化合物的甲醇溶液；
柱温：40℃；
流速：0.4mL/min；
进样量：2μL；
运行时间：12min；
采用梯度模式洗脱的方式，见表1；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾离子正离子检测模式下，采用多反应监测的扫描模式；接口电压为4kV；DL温度：250℃；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；干燥气：10L/min；雾化气：3L/min；各目标物相应的保留时间、多反应监测离子对及电压参数见表2；
表2多反应监测离子对及相应的电压参数
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，所述的人干血斑按照如下方法制备得到：(1)提取：取直径6mm干血斑样本于2mL离心管中，向其中加入200μL含内标的提取液，然后以2500rpm涡旋震荡30min，将上述混合溶液取150μL溶液用氮气仪吹干；(2)衍生：再加入200μL衍生试剂1，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生30min，吹干；再加入200μL衍生试剂2，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生5min，吹干；(3)复溶：加400μL复溶液，室温下，以2500rpm涡旋震荡混匀5min。
3.根据权利要求2所述的高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的含内标的提取液按照如下方法制备得到：分别取20μM氘代同位素内标物450μL，包括十碳三烯八酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5，加入45mL甲醇配置得到浓度均为200nM的含内标的提取液。
4.根据权利要求2所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的衍生试剂1为10vt％乙酰氯的二氯甲烷溶液；衍生试剂2为1vt％三吡啶甲基胺的乙腈溶液。
5.根据权利要求2所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的复溶液为饱和一元醇。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，所述的标准品为含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液，具体浓度见表3，
表3 4种游离脂肪酸标准品对应的浓度(μM)
。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，所述的标准品按照如下步骤制备得到：
浓度为J1标准品的制备：分别取50mMα-十八碳三烯酸160μL、100mM二十碳五烯酸8μL、100mMω3-二十二碳五烯酸20μL、50mM二十二碳六烯酸160μL，分别加入1652μL的甲醇，制备4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸；再取4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至3000μL，即得浓度为J1标准品；
浓度为J2标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各500μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J2标准品；
浓度为J3标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各200μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J3标准品；
浓度为J4标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至1500μL，即得浓度为J4标准品；
浓度为J5标准品的制备：取浓度为J2的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J5标准品；
浓度为J6标准品的制备：取浓度为J3的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J6标准品；
浓度为J7标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J7标准品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910527204.3A CN110146629A (zh) | 2019-06-18 | 2019-06-18 | 高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910527204.3A CN110146629A (zh) | 2019-06-18 | 2019-06-18 | 高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110146629A true CN110146629A (zh) | 2019-08-20 |
Family
ID=67591626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910527204.3A Pending CN110146629A (zh) | 2019-06-18 | 2019-06-18 | 高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110146629A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107621501A (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-23 | 上海可力梅塔生物医药科技有限公司 | 血清中游离脂肪酸的lc/ms/ms联用法检测试剂盒 |
| KR20180100915A (ko) * | 2017-03-03 | 2018-09-12 | 주식회사 에스씨엘헬스케어 | 민감도 및 특이성이 향상된 지방산 분석 방법 |
| CN108645924A (zh) * | 2017-06-22 | 2018-10-12 | 南方医科大学 | 基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法 |
| CN109239238A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-01-18 | 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 | 一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法 |
-
2019
- 2019-06-18 CN CN201910527204.3A patent/CN110146629A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107621501A (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-23 | 上海可力梅塔生物医药科技有限公司 | 血清中游离脂肪酸的lc/ms/ms联用法检测试剂盒 |
| KR20180100915A (ko) * | 2017-03-03 | 2018-09-12 | 주식회사 에스씨엘헬스케어 | 민감도 및 특이성이 향상된 지방산 분석 방법 |
| CN108645924A (zh) * | 2017-06-22 | 2018-10-12 | 南方医科大学 | 基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法 |
| CN109239238A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-01-18 | 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 | 一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ERANDI HEWAWASAM等: "A validated method for analyzing polyunsaturated free fatty acids from dried blood spots using LC–MS/MS", 《PROSTAGLANDINS, LEUKOTRIENES AND ESSENTIAL FATTY ACIDS》 * |
| XINGNAN LI等: "Improved LC-MS Method for the Determination of Fatty Acids in Red Blood Cells by LC-Orbitrap MS", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pilařová et al. | Recent developments in supercritical fluid chromatography–mass spectrometry: is it a viable option for analysis of complex samples? | |
| Zhou et al. | Hydrophilic interaction ultra-performance liquid chromatography coupled with triple-quadrupole tandem mass spectrometry for highly rapid and sensitive analysis of underivatized amino acids in functional foods | |
| CN106442758A (zh) | 非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法 | |
| Li et al. | Comparative analysis of nucleosides and nucleobases from different sections of Elaphuri Davidiani Cornu and Cervi Cornu by UHPLC–MS/MS | |
| CN110007044A (zh) | 一种人体尿液中多种有机酸的定量检测方法 | |
| CN109738565B (zh) | 一种测定保健食品中非法添加化合物的方法 | |
| CN108931603A (zh) | 一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法 | |
| CN113125601B (zh) | 一种同时检测血清中4种脂溶性维生素的浓度的方法 | |
| CN106442836A (zh) | 一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法 | |
| CN107091894A (zh) | 液相色谱串联质谱检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸和/或同型半胱氨酸的方法 | |
| CN102338789A (zh) | 一种食品中黄曲霉毒素快速仪器分析方法 | |
| CN105866315B (zh) | 一种电子烟烟液中氨基酸的测定方法 | |
| CN109828060A (zh) | 益母草中核苷类成分的检测方法 | |
| CN108535395A (zh) | 一种使用UPLC-QTof同时快速测定保健酒中32种游离脂肪酸的方法 | |
| CN110146629A (zh) | 高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法 | |
| CN107449846A (zh) | Hplc‑ms测定小儿安神补脑颗粒中有效成分的方法 | |
| CN112285263A (zh) | 一种定量分析烟用香精和料液中非挥发性有机酸的方法 | |
| Yao et al. | HILIC‐UPLC‐MS/MS combined with hierarchical clustering analysis to rapidly analyze and evaluate nucleobases and nucleosides in Ginkgo biloba leaves | |
| CN110146627A (zh) | 一种高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒 | |
| CN109187830B (zh) | Gc-ms法同时快速测定食用香精香料中9种醇类化合物含量的方法 | |
| CN107102078B (zh) | 一种测定栀子黄中黄曲霉毒素b1的方法 | |
| CN110687224B (zh) | 雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法 | |
| CN111650310A (zh) | 一种测定禽类食品中利巴韦林和金刚烷胺类化合物残留量的方法 | |
| CN112684068A (zh) | 测定羟基-α-山椒素含量的方法 | |
| CN111307992A (zh) | 一种定量检测pm2.5中有机酸的柱前衍生液质联用分析方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190820 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |