CN106770871B - 一种定量检测含糖醛酸多糖的方法 - Google Patents
一种定量检测含糖醛酸多糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106770871B CN106770871B CN201611215391.4A CN201611215391A CN106770871B CN 106770871 B CN106770871 B CN 106770871B CN 201611215391 A CN201611215391 A CN 201611215391A CN 106770871 B CN106770871 B CN 106770871B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- polysaccharide
- sample
- standard
- sour water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 73
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 72
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 72
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims abstract description 31
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 44
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 12
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 11
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 11
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 3
- SOSWVVMGPYTPKV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;azane;formic acid Chemical compound [NH4+].OC=O.CC([O-])=O SOSWVVMGPYTPKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 150000002402 hexoses Chemical group 0.000 abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 13
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 13
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 13
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 13
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 13
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 8
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 7
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-KLVWXMOXSA-N (2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5-tetrahydroxy-6-oxohexanoic acid Chemical group O=C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-KLVWXMOXSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- -1 GSP disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N30/14—Preparation by elimination of some components
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明提供了一种定量检测含糖醛酸多糖的方法，具体步骤：用三氟乙酸配制含糖醛酸多糖标准品溶液，含糖醛酸多糖为主链由己糖醛酸‑氨基己糖或己糖醛酸‑己糖重复二糖片段构成的多糖；将标准品进行酸水解、除酸，得到待测样品酸水解残余物；对标准样品酸水解残余物进行溶解，利用高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪分析，得到多反应监测色谱图及标准曲线；采用与相同的方法处理并检测待测样品酸水解残余物；鉴定含糖醛酸多糖种类、得到待测样品中含糖醛酸多糖的含量。本发明操作步骤简捷，试剂价格低廉，耗时较短，且能够同时对多个由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖的重复二糖片段组成的多糖进行准确定量。
Description
技术领域
本发明涉及含糖醛酸多糖的检测技术领域，特别涉及一种定量检测含糖醛酸多糖的方法。
背景技术
含糖醛酸多糖在动物体内广泛存在，包括糖胺聚糖以及其它一些的含糖醛酸的非糖胺聚糖。糖胺聚糖主要是指由一个氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖重复单元构成的直链多糖，如透明质酸、硫酸软骨素等。而在贝类等一些生物中，还发现了含有糖醛酸与己糖连接而成的重复二糖片段的多糖，如鲍鱼性腺多糖AGSP等。含糖醛酸多糖在生理过程中起着重要作用，已引起了广泛的关注，其中一些已经被开发为药品、保健品、化妆品等。因此，建立含糖醛酸多糖定量检测方法将为相关药品、食品、保健品等产品的质量控制提供有力手段。
目前，主要有化学显色法对含糖醛酸多糖进行定量检测，也有采用高效液相色谱-液质联用技术对糖胺聚糖酶解后产生的二糖进行定量，而化学显色法的无特异性、误差较大，酶的价格比较高昂，操作繁琐，不适合常规的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测含糖醛酸多糖的新方法，通过对含糖醛酸多糖酸降解产生的二糖进行高效液相色谱-质谱检测，有效确定含糖醛酸多糖的含量。
为达到上述目的，本发明提供了一种定量检测含糖醛酸多糖的方法，具体步骤如下：
S1、用1.3mol/L的三氟乙酸水溶液配制一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品溶液，其中所述含糖醛酸多糖标准品溶液中含糖醛酸多糖浓度在0.02～2.0mg/mL范围内；
所述含糖醛酸多糖为主链由己糖醛酸-氨基己糖或己糖醛酸-己糖重复二糖片段构成的多糖；
S2、准确量取1.00mL步骤S1制得的一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品溶液，分别密封，105℃下水解3h，放至室温，采用冷冻离心浓缩除去1.3mol/L的三氟乙酸水溶液，然后加入0.3～1mL甲醇，再采用冷冻离心浓缩除去甲醇及残留的三氟乙酸，以上操作重复三次，达到除酸目的，得到标准样品酸水解残余物；
S3、对步骤S2所得标准样品酸水解残余物进行溶解，利用高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪进行分析，即可得到所述多糖标准品降解产生的二糖片段的多反应监测(MRM)色谱图，根据标准多糖溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准曲线；
二糖片段即经过步骤S2酸水解得到的，本发明中的酸水解条件可以产生二糖片段。
分析检测的条件为：
高效液相色谱：
Amide-80亲水相互作用色谱柱，
以含甲酸和乙酸铵的水溶液、乙腈为流动相等梯度洗脱，所述含甲酸和乙酸铵的水溶液中甲酸体积浓度为0.02～0.1％、乙酸铵摩尔浓度为5～25mmol/L，所述含甲酸和乙酸铵的水溶液与乙腈的体积比为30:70，
柱温30℃，
流速0.2mL/min；
质谱条件：
离子源ESI源，
正离子模式，
喷雾电压5.5kV，
辅助加热气温度600℃，
多反应监测(MRM)，监测的离子对包括379.09/203.00、379.09/198.90、379.09/114.00、356.10/338.10、356.10/162.10、356.10/144.00；
所述对步骤S2所得标准样品酸水解残余物进行溶解的具体过程为：
用1mL与所述流动相组成相同的溶液将步骤S2制得的酸水解残余物溶解，将溶解液转移到10mL离心管中，转速10000×g、离心20min、采集上清液；
所述流动相优选组成为含体积浓度为0.05％甲酸的10mmol/L乙酸铵水溶液:乙腈＝30:70。
采用与所述流动相组成相同的溶液溶解酸水解残余物可以改善酸水解残余物中二糖色谱峰峰型。
S4、取待测样品，采用与步骤S1、S2相同的方法对所述待测样品进行酸水解、除酸，得到待测样品酸水解残余物；
S5、采用与步骤S3相同的方法处理并检测待测样品酸水解残余物，得到酸水解残余物中多糖样品降解产生的二糖片段的多反应监测色谱图；
S6、将步骤S5得到的待测样品多反应监测色谱图与步骤S3得到的标准样品多反应监测色谱图进行比较，根据高效液相色谱-质谱获得的保留时间和特征离子鉴定含糖醛酸多糖种类；根据待测样品色谱峰面积结合标准曲线，即可得到待测样品中含糖醛酸多糖的含量。
优选方式下，主链由己糖醛酸-氨基己糖重复片段构成的多糖选择356.10/162.10作为定量离子对，主链由己糖醛酸-氨基己糖重复片段构成的多糖选择379.09/203.00作为定量离子对。
本发明所检测的含糖醛酸多糖是指含有由一个糖醛酸与一个氨基己糖、或一个糖醛酸与一个己糖组成的重复二糖片段的多糖。
本发明的有益效果是：
1、本发明方法能够同时定量测定多种由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖的重复二糖单元构成的多糖，操作步骤简捷，耗时较短。
2、本发明利用与流动相同比例的溶液溶解酸降解后的多糖片段，以及采用含0.02～0.1％甲酸和5～25mM乙酸铵的水溶液都可以改善三种多糖质谱图的峰型，提高定量检测的准确度。
3、本发明方法适用于定量检测由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖的重复二糖片段组成的多糖，如硫酸软骨素、透明质酸、鲍鱼性腺硫酸多糖(AGSP)等。本发明提供的方法可以无需衍生化，可直接进质谱分析，能够对这些多糖进行准确的定量测定，可用于检测含有这些多糖的药品、保健品等产品的质量。
综上，本发明操作步骤简捷，试剂价格低廉，耗时较短，且能够同时对多个由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖的重复二糖片段组成的多糖进行准确定量。
附图说明
图1是实施例1中标准多糖混合溶液的总离子流色谱图；
图2是实施例1中透明质酸(HA)二糖的质谱图；
图3是实施例1中硫酸软骨素(CS)二糖的质谱图；
图4是实施例1中鲍鱼性腺多糖AGSP二糖的质谱图；
图5是实施例1中透明质酸(HA)对应的色谱峰；
图6是实施例1中硫酸软骨素(CS)对应的色谱峰；
图7是实施例1中鲍鱼性腺多糖AGSP对应的色谱峰。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
S1、用1.3mol/L的三氟乙酸的水溶液配制一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品溶液，其中含糖醛酸多糖浓度在0.02～2.0mg/mL范围内。
S2、准确量取1.00mL标准溶液和待测样品溶液，密封，105℃下水解3h，放置室温，采用冷冻离心浓缩除去溶剂，然后加入0.3～1mL甲醇，再采用冷冻离心浓缩除去溶剂，以上操作重复三次，达到除酸目的。
S3、用与流动相相同组成的含甲酸和乙酸铵的乙腈水溶液将酸水解残余物溶解，溶解液转移到10mL离心管中，转速10000×g，离心20min并采集上清液。
S4、高效液相色谱-质谱联用分析的条件如下：
高效液相色谱-三重四极杆质谱仪；Amide-80色谱柱；以含0.02％～0.1％甲酸和5～25mM乙酸铵的水溶液(A)：乙腈(B)等度洗脱；柱温30℃；流速0.2mL/min。
质谱条件：离子源ESI源；正离子模式；喷雾电压5.5kV；辅助加热气温度600℃；进样体积2μL；监测的离子对包括379.09/203.00、379.09/198.90、379.09/114.00、356.10/338.10、356.10/162.10、356.10/144.00。
S5、根据色谱峰保留时间和监测离子丰度比或二级质谱区分各多糖的二糖片段，然后根据色谱峰面积和标准多糖浓度绘制工作曲线。
实施例1
(1)准确称取10.0mg硫酸软骨素(CS)、10.0mg透明质酸(HA)以及20.0mg鲍鱼性腺多糖AGSP，混合后用1.3mol/L的三氟乙酸溶解，配制成系列浓度(AGSP：0.04、0.12、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL，CS、HA：0.02、0.06、0.1、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)的混合标准多糖溶液，每个浓度两平行。
(2)自制样品：含有10％透明质酸、20％硫酸软骨素、70％淀粉。
(3)制备待测样品多糖溶液：取25mg自制样品于10mL容量瓶，用1.3mol/L的三氟乙酸溶液溶解定容，取1ml待加热水解；精确量取0.50mL待测样品多糖溶液于1mL水解管中再加入0.50mL混合标准多糖溶液，制成加标样品，密封，待加热水解。
(4)取标准品溶液和待测样品溶液，密封，放置在105℃烘箱中酸水解3h，冷却至室温后采用冻干浓缩一体机除去溶剂，然后加入0.5mL甲醇再次用冻干浓缩一体机除去溶剂，重复三次，以除净三氟乙酸，得到标准品溶液和待测样品溶液的酸水解残余物。
(5)用与流动相相同组成的含甲酸和乙酸铵的乙腈水溶液将标准品溶液和待测样品溶液的酸水解残余物溶解，将溶解液转移到10mL离心管中，转速10000×g，离心20min并采集上清液。
(6)色谱条件：高效液相色谱仪(日本SHIMADZU公司)；色谱柱为Amide-80 3μm(2.0×150mm)；柱温30℃；洗脱条件为含0.05％甲酸的10mM乙酸铵水溶液(A)：乙腈(B)洗脱＝30:70；流速0.2mL/min。质谱条件：4000QTRAP三重四极杆串联线性离子阱质谱仪(美国ABSCIEX公司)；离子源ESI源；正离子模式；喷雾电压5.5kV；辅助加热气温度600℃；进样体积2μL；选择多重反应监测(MRM)-信息相关采集(IDA)-增强子离子扫描(EPI)。其它参数如表1所示。
表1酸水解二糖片段的质谱分析条件
CE:碰撞能量，DP:去簇电压，EP:入口电压，CXP:碰撞室出口电压。
(7)检测得到的总离子流图如图1所示。通过IDA-EPI获得的二级质谱如图2～4所示。分别选择356.1/162.10、356.1/162.10、379.10/203.00三个离子色谱图来对透明质酸、硫酸软骨素、鲍鱼性腺多糖AGSP的二糖片段进行定量，获得的色谱图如图5～7所示，工作曲线和精密度结果如表2所示。根据工作曲线计算待测样品中硫酸软骨素的含量为0.1280g/g，RSD＝0.60％(n＝5)，透明质酸的含量为0.0714g/g，RSD＝3.35％(n＝5)。
表2
上述实施例实现了同时定量了三个物质：透明质酸、硫酸软骨素、鲍鱼性腺多糖AGSP。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种定量检测含糖醛酸多糖的方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1、用1.3mol/L的三氟乙酸水溶液配制一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品溶液，其中所述含糖醛酸多糖标准品溶液中含糖醛酸多糖浓度在0.02～2.0mg/mL范围内；
所述含糖醛酸多糖为主链由己糖醛酸-氨基己糖或己糖醛酸-己糖重复二糖片段构成的多糖；
S2、准确量取1.00mL步骤S1制得的一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品溶液，分别密封，105℃下水解3h，放至室温，采用冷冻离心浓缩除去1.3mol/L的三氟乙酸水溶液，然后加入0.3～1mL甲醇，再采用冷冻离心浓缩除去甲醇及残留的三氟乙酸，以上操作重复三次，得到标准样品酸水解残余物；
S3、对步骤S2所得标准样品酸水解残余物进行溶解，利用高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪进行分析，即可得到所述多糖标准品降解产生的二糖片段的多反应监测色谱图，根据标准多糖溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准曲线；
分析检测的条件为：
高效液相色谱：
Amide-80亲水相互作用色谱柱，
以含甲酸和乙酸铵的水溶液、乙腈为流动相等梯度洗脱，所述含甲酸和乙酸铵的水溶液中甲酸体积浓度为0.05％、乙酸铵摩尔浓度为10mmol/L，所述含甲酸和乙酸铵的水溶液与乙腈的体积比为30:70，
柱温30℃，
流速0.2mL/min；
质谱条件：
离子源ESI源，
正离子模式，
喷雾电压5.5kV，
辅助加热气温度600℃，
多反应监测，监测的离子对包括379.09/203.00、379.09/198.90、379.09/114.00、356.10/338.10、356.10/162.10、356.10/144.00；
主链由己糖醛酸-氨基己糖重复片段构成的多糖选择356.10/162.10作为定量离子对，主链由己糖醛酸-氨基己糖重复片段构成的多糖选择379.09/203.00作为定量离子对；
所述对步骤S2所得标准样品酸水解残余物进行溶解的具体过程为：
用1mL与所述流动相组成相同的溶液将步骤S2制得的酸水解残余物溶解，将溶解液转移到10mL离心管中，转速10000×g、离心20min、采集上清液；
S4、取待测样品，采用与步骤S1、S2相同的方法对所述待测样品进行酸水解、除酸，得到待测样品酸水解残余物；
S5、采用与步骤S3相同的方法处理并检测待测样品酸水解残余物，得到酸水解残余物中多糖样品降解产生的二糖片段的多反应监测色谱图；
S6、将步骤S5得到的待测样品多反应监测色谱图与步骤S3得到的标准样品多反应监测色谱图进行比较，根据高效液相色谱-质谱获得的保留时间和特征离子鉴定含糖醛酸多糖种类；根据待测样品色谱峰面积结合标准曲线，即可得到待测样品中含糖醛酸多糖的含量。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611215391.4A CN106770871B (zh) | 2016-12-26 | 2016-12-26 | 一种定量检测含糖醛酸多糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611215391.4A CN106770871B (zh) | 2016-12-26 | 2016-12-26 | 一种定量检测含糖醛酸多糖的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106770871A CN106770871A (zh) | 2017-05-31 |
| CN106770871B true CN106770871B (zh) | 2019-04-12 |
Family
ID=58927377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611215391.4A Active CN106770871B (zh) | 2016-12-26 | 2016-12-26 | 一种定量检测含糖醛酸多糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106770871B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108982733A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-12-11 | 大连工业大学 | 一种分析多糖组成结构的方法 |
| US11474100B2 (en) * | 2019-05-14 | 2022-10-18 | Hong Kong Baptist University | Chromophore-labeled oligosaccharide markers and methods of use thereof |
| CN213715246U (zh) * | 2020-08-04 | 2021-07-16 | 广东联捷生物科技有限公司 | 进样机械臂组件和进样装置 |
| CN113281277B (zh) * | 2021-05-12 | 2023-01-17 | 苏州林华医疗器械股份有限公司 | 糖胺聚糖己糖胺测定方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6388060B1 (en) * | 1998-11-06 | 2002-05-14 | Vascular Therapeutics Inc. | Process for the sulfation of uronic acid-containing polysaccharides |
| CN103698426A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-04-02 | 中国海洋大学 | 一种降解获得及检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法 |
| CN104569274A (zh) * | 2015-01-21 | 2015-04-29 | 大连工业大学 | 一种鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法 |
| CN105675779A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-06-15 | 大连工业大学 | 一种定量检测含糖醛酸多糖的方法 |
-
2016
- 2016-12-26 CN CN201611215391.4A patent/CN106770871B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6388060B1 (en) * | 1998-11-06 | 2002-05-14 | Vascular Therapeutics Inc. | Process for the sulfation of uronic acid-containing polysaccharides |
| CN103698426A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-04-02 | 中国海洋大学 | 一种降解获得及检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法 |
| CN104569274A (zh) * | 2015-01-21 | 2015-04-29 | 大连工业大学 | 一种鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法 |
| CN105675779A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-06-15 | 大连工业大学 | 一种定量检测含糖醛酸多糖的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Disaccharide Analysis of Glycosaminoglycans Using Hydrophilic Interaction Chromatography and Mass Spectrometry;Vanessa Leah Gill et al.;《Anal Chem.》;20130115;第85卷(第2期);正文第1页"Abstract"，第4页"Liquid Chromatography/Mass Spectrometry"节首段，第5-6页"Separation of Enzyme-Derived Disaccharides"节 |
| Quick characterization of uronic acid-containing polysaccharides in 5 shellfishes by oligosaccharide analysis upon acid hydrolysis;Bin Liu et al.;《Carbohydrate Research》;20161011;第435卷;page 149-155 |
| 基于部分酸水解－亲水作用色谱结合反相指纹图谱全面质量评价方法的建立的黄芪多糖指纹图谱分析及;王惠 等;《色谱》;20160731;第34卷;726-736页 |
| 酸降解-亲水相互作用色谱-质谱定量含糖醛酸多糖;徐鑫 等;《中国食品科学技术学会第十三届年会论文摘要集》;20161130;第268页"摘要" |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106770871A (zh) | 2017-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106770871B (zh) | 一种定量检测含糖醛酸多糖的方法 | |
| CN105675779B (zh) | 一种定量检测含糖醛酸多糖的方法 | |
| CN105510480B (zh) | 烘焙食品中2‑甲基咪唑和4‑甲基咪唑的检测方法及应用 | |
| CN106226424B (zh) | 一种磁性石墨烯固相萃取结合液质联用仪检测肉制品中兽药残留的方法 | |
| CN103293243A (zh) | 食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法及应用 | |
| CN103278574B (zh) | 利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测糖化血红蛋白的方法 | |
| CN104698114A (zh) | 一种大米中205种农药残留量的检测方法 | |
| CN105353068A (zh) | 一种烟草及无烟气烟草制品中挥发性n-亚硝胺的gc-ms/ms分析测定方法 | |
| CN104614466A (zh) | 电子烟烟液中防腐剂的测定方法 | |
| CN106645483B (zh) | 一种定量检测海参多糖的方法 | |
| CN101458238B (zh) | 一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法 | |
| CN102944636B (zh) | 蒸馏酒中氨基甲酸乙酯的高效液相色谱-质谱检测方法 | |
| CN109541107A (zh) | 一种液质联用测定血浆中卡马西平浓度的方法 | |
| CN106908532B (zh) | 测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法 | |
| Ning et al. | Direct detection of amino acids using extractive electrospray ionization tandem mass spectrometry | |
| CN102735764A (zh) | 一种血浆中利巴韦林含量的测定方法 | |
| CN102313787B (zh) | 一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法 | |
| CN108760920A (zh) | 一种基于hplc-msms法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法 | |
| CN106383188B (zh) | 一种齐墩果酸和熊果酸的定量检测方法 | |
| CN104359751B (zh) | 微波消解荧光法测定土壤中微量铀 | |
| CN105806927B (zh) | 化妆品中3种溴代或氯代水杨酰苯胺的离子迁移谱快速检测方法 | |
| CN105548402A (zh) | 高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒 | |
| Jiang et al. | Rapid determination of dimethoate in nanoliter of juice using surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry | |
| CN105158372A (zh) | 一种化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法 | |
| CN104849383A (zh) | 快速溶剂萃取-凝胶色谱净化-lc/ms/ms结合测定蜂花粉中硝基咪唑类药物的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |