CN107192829A - 一种板蓝根蛋白质鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种板蓝根蛋白质鉴定的方法。板蓝根药材经粉碎、脱色、裂解、酶切等一系列前处理步骤后，采用纳升液质联用仪进行分离和质谱分析，通过Mascot软件进行数据库检索搜库；运用生物信息学的技术对鉴定到的蛋白质进行功能注释和通路注释。本发明的方法蛋白提取率高、鉴定蛋白的种类多，从板蓝根蛋白中总共鉴定到1116种蛋白，2589条独特的肽段，具有较高可信度的蛋白质(独特肽序列匹配数≥2)数总共有742个，占66.49％，本方法适用于板蓝根等中药蛋白质的鉴定及功能分析，具有广泛的应用前景。

Description

一种板蓝根蛋白质鉴定的方法
技术领域
本申请属于分析化学及生物信息学领域，具体地说，涉及一种板蓝根蛋白质质谱鉴定的方法及蛋白功能注释和信号通路分析。
背景技术
植物蛋白质组学(plant proteomics)是在高通量的蛋白质分析和鉴定技术得到突破，植物基因组学迅速发展的背景下产生的一门新兴学科。随着水稻(Oryzasativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和杨树(Populus trichocarpa)等植物全基因组序列测定的完成和基因组学研究的深入，植物蛋白质组学研究已成为后基因组时代的热点之一。近年来随着蛋白质组学技术的快速发展，基于各种蛋白数据库蛋白分析的信息量越来越大，为了高效的对所得到的数据进行分析，以获得更直观的信息，这时迫切需要一门能对复杂蛋白信息进行统计分析的技术。生物信息学分析技术的出现，成功的解决了这一棘手的技术难题，成为了蛋白组学研究一个不可或缺的组成部分。目前为止尚未有板蓝根蛋白的蛋白质组学研究的报道，故发明开发一种质谱技术对板蓝根蛋白质进行鉴定，同时采用生物信息学技术对板蓝根蛋白的功能和可能参与的信号通路进行研究，可以充分挖掘板蓝根蛋白资源的应用价值。本发明提供的方法简便易行，可广泛应用于中药蛋白质的鉴定。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为了提供一种板蓝根蛋白鉴定的方法。
技术方案，为了实现以上目的，本发明采取的技术方案如下：
一种板蓝根蛋白质鉴定方法，包括以下步骤：取板蓝根药材经粉碎后，在液氮中研磨，加入预冷的三氯乙酸/丙酮溶液，离心，倒掉上清液；沉淀加入丙酮溶液，震荡，离心，重复此步骤至丙酮完全无色；室温干燥沉淀；取沉淀适量，加入裂解液裂解板蓝根植物组织及细胞，提取蛋白；采用超滤管酶解法酶切板蓝根蛋白，过滤后上清液进行肽段定量，进行质谱鉴定；通过Mascot软件进行数据库检索搜库，对鉴定到的蛋白进行生物信息学分析。
作为优选方案，以上所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，包括以下步骤：
(1)取板蓝根药材粉末适量，在液氮中研磨后，加入在冰箱中预冷的三氯乙酸/丙酮溶液，然后放入-20℃冰箱中过夜；
(2)第二天用冷冻离心机设定温度为4℃，转数为6000rpm离心时间为30min，倒掉上清液；沉淀加入45mL预冷的丙酮溶液，震荡，4℃，6000rpm离心30min，重复此步骤2～5次，至丙酮完全无色；室温干燥沉淀；
(3)取适量沉淀，加入细胞裂解液进行裂解，沸水浴5～10min，然后超声处理，再放沸水浴5～10min；然后离心，收集离心上清液；再采用超滤管酶解法酶解板蓝根蛋白，过滤后取上清液进行肽段定量测定和进液质联用仪进行分析；通过Mascot软件进行数据库检索搜库对鉴定到的蛋白进行生物信息学分析。
作为优选方案，以上所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，超滤管酶解法酶解板蓝根蛋白的步骤如下：
收集离心上清液，加入二硫苏糖醇至终浓度为100mM，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μL UAbuffer混匀，转至10KD超滤管中，离心14000g 30min。加入200μL的UA缓冲液，离心力为14000g离心30min，倒掉上层液体。加入100μL 3-吲哚乙酸，600rpm振荡1min，避光室温30min，14000g离心20min。加入100μL UA buffer，14000g离心20min重复2次；加入100μL的25mM NH3HCO3溶液，离心力为14000g，每次离心时间为20min总共离心2次；加入40μL25mM NH3HCO3缓冲液，600rpm振荡1min，37℃放置16～18h；移到新的EP管中，离心力为14000g，离心15min；过滤后上清液进行肽段的定量测定。
作为优选方案，以上所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，细胞裂解液组成为：6M尿素，2M硫脲，60mM二硫苏糖醇，5％3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐和40mM三羟甲基氨基甲烷。
作为优选方案，以上所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，其特征在于，液质联用的色谱分析条件为：
缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为含0.1％甲酸的乙腈水溶液，乙腈体积浓度为84％；色谱柱以95％的A液平衡；样品由自动进样器上样到上样柱中，再经分析柱分离，流速设定为250nL/min；
相关液相梯度洗脱程序为：0min～50min，B液线性梯度从0％～50％；50min～54min，B液线性梯度从50％～100％；54min～60min，B液比例保持不变。
作为优选方案，以上所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，液质联用仪的色谱分析条件为：
分析时长为60min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300～1800m/z，一级质谱分辨率：70,000at m/z 200，AGC target设为3e6，动态排除：3.0s。
作为优选方案，以上所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，质谱数据分析处理方法为：
通过Mascot软件对原始文件进行数据库检索。数据库为下载于uniprot的数据库；利用ProteomicsTools.3.1.6添加正反库；搜库参数设定如下：enzyme为trypsin；missedcleavage设为2；静态修饰设定Carbamidomethy C；动态修饰设定Oxidation M。Peptidestolerance设为20ppm，ms/ms tolerance设为0.1Da,protein FDR≤0.01，Peptide FDR≤0.01。
作为优选方案，以上所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，生物信息学分析方法为：
(1)序列信息提取
原始数据中质谱鉴定到的蛋白质序列信息批量提取自NCBI数据库，以FASTA格式保存；
(2)序列比对
利用本地化序列比对软件NCBI BLAST+(ncbi-blast-2.2.28+-win32.ext)将鉴定到的蛋白质与NCBI nr数据库中的蛋白质序列进行比对。根据相似性原理，所得的同源蛋白的功能信息可以用于目标蛋白的功能注释；
(3)GO功能条目提取
利用Blast2GO中的Mapping功能对所有目标蛋白的比对序列所关联的GO功能条目进行提取。
(4)功能注释
在功能注释过程中，Blast2GO通过综合考量目标序列和比对序列的相似性、GO条目来源的可靠度，以及GO有向无环图的结构，将Mapping过程中提取的GO功能条目中符合条件的条目注释给目标蛋白；
(5)补充注释
功能注释过程中，对于有比对序列却没有注释信息的目标蛋白序列，适当放宽了注释条件，使更多的目标蛋白序列可以获得功能注释信息；对于剩余的其他通过序列比对仍然无法获得注释信息的目标蛋白序列，以及没有比对序列的目标蛋白序列，通过InterProScan在EBI数据库中搜索匹配的保守蛋白质motif，并将motif的功能注释信息注释给目标蛋白序列。之后利用Blast2GO中的ANNEX模块对注释信息进行进一步的补充，并在不同GO类别之间建立联系，提高注释的准确性；
(6)KEGG通路注释
利用KAAS将目标蛋白序列与KEGG GENES数据库中的植物蛋白序列进行比对，通过同源/相似蛋白的KO号注释到相关KEGG通路上。
与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
(1)本申请以板蓝根为实验材料，以获得符合蛋白质组学分析的样品制备方法为目的，填补板蓝根蛋白质谱鉴定的空白，为深入开展板蓝根蛋白质组学提供技术支持。
(2)本申请的技术方案，分析速度快，重复性好，步骤简单，易于操作，技术人员易学、易掌握。
(3)本申请中选用的实验试剂均为常规试剂，无需昂贵、稀有试剂看，实验运作成本低。
附图说明
图1为板蓝根蛋白的总离子流图。
图2板蓝根蛋白等电点PI和分子量MW的分布图
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品或原料。
实施例1：板蓝根蛋白质的质谱鉴定
1、实验材料
1.1仪器
Thermo Scientific EASY-nLC 1000纳升级液相色谱(美国Thermo公司)；
Millipore纯水器超纯水系统(Millipore,Bedford,MA)；
台式高速冷冻离心机(Allegra X-30R型，美国贝克曼库尔特公司)；
SDS-PAGE电泳仪(美国BIO-RAD公司)；
Thermo scientific EASY C18色谱柱(2cm×100μm,5μm)；
Thermo scientific EASY C18色谱柱(75μm×100mm,3μm)；
全自动680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)；
Q-Exactive质谱仪(美国Thermo Finnigan公司)。
1.2试剂与试药
三氯乙酸(TCA)(国药集团化学试剂有限公司)；
胰蛋白酶(上海Solarbio生物技术有限公司)；
甲酸、乙腈(德国Merck公司)；
十二烷基硫酸钠(SDS)(上海阿拉丁试剂公司)；
超纯水由Millipore纯水器(Millipore,Bedford,MA)制得；
其它化学试剂均为分析纯，购于上海国药化学试剂公司。
板蓝根药材经南京中医药大学鉴定教研室陈建伟教授鉴定为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根。
2实验方法
2.1样品处理
取板蓝根药材粉末适量，液氮研磨；加入在冰箱中预冷的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液45mL，放入-20℃冰箱中过夜；第二天用冷冻离心机设定温度为4℃，转数为6000rpm离心时间为30min，倒掉上清液；加入45mL预冷的丙酮溶液，震荡，4℃，6000rpm离心30min，重复此步骤至丙酮完全无色；室温干燥沉淀；取适量干粉，加入1mL裂解液，裂解液组成：6M尿素(Urea)，2M硫脲(Thiourea)，60mM二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)，5％3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)，40mM三羟甲基氨基甲烷；沸水浴5min，超声处理(100W，10次，每次10秒，每次间隔15秒)，沸水浴5min；设定转数为13400rpm离心时间为30min，收集上清液；采用BCA法测定蛋白的浓度。
2.2蛋白酶解
取浓度为100μg/mL板蓝根蛋白溶液50μL，加入DTT至终浓度为100mM，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μL UA缓冲液(8M尿素，150mM Tris-HCl pH8.0)混匀，转至10KD超滤管中，离心14000g 30min。加入200μL的UA缓冲液，离心力为14000g离心30min，倒掉上层液体。加入100μL 3-吲哚乙酸(50mM 3-吲哚乙酸)，600rpm振荡1min，避光室温30min，14000g离心20min。加入100μL UA buffer，14000g离心20min重复2次。加入100μL的25mMNH3HCO3溶液，离心力为14000g，每次离心时间为20min总共离心2次。加入40μL 25mM NH3HCO3缓冲液(含2μgTrypsin)，600rpm振荡1min，37℃放置16～18h。移到新的EP管中，离心力为14000g，离心15min。过滤后上清液进行OD280肽段定量和进液质联用仪进行分析。
2.3毛细管高效液相色谱条件
缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(其中乙腈占84％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品由自动进样器上样到上样柱上，再经分析柱分离，流速设定为250nL/min。相关液相梯度如下：0min～50min，B液线性梯度从0％～50％；50min～54min，B液线性梯度从50％～100％；54min～60min，B液比例保持不变。
2.4ESI质谱鉴定
分析时长设为60min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300～1800m/z，一级质谱分辨率：70,000at m/z 200，AGC target设为3e6，Dynamic exclusion：3.0s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照文献的方法采集。
2.5质谱数据分析
通过Mascot软件对原始文件(RAW文件)进行数据库检索。数据库为下载于uniprot的数据库Uniprot_Brassicales_207012_20140820.fasta(收录序列207012条，下载时间为2014-8-20)。利用ProteomicsTools.3.1.6添加正反库。搜库参数设定如下：enzyme为trypsin；missed cleavage设为2；静态修饰设定Carbamidomethy C；动态修饰设定Oxidation M。Peptides tolerance设为20ppm，ms/ms tolerance设为0.1Da,protein FDR≤0.01，Peptide FDR≤0.01。3、实验结果与分析
3.1板蓝根蛋白shotgun鉴定
按实验方法中的色谱和质谱条件进样，板蓝根蛋白的TIC总离子流图见图1。另外如表1所示，通过质谱鉴定到总共1116个蛋白，2589条独特的肽段，具有较高可信度的蛋白质(独特肽序列匹配数≥2)数总共有742个，占66.49％，而可信度较低的(独特肽序列匹配数为1)的蛋白数为374个，占33.51％。在总共鉴定到的1116个蛋白中有590种蛋白是已命名的蛋白，详细结果见表1。鉴定到的磷酸化酶(Phosphorylase)在其同科的芜菁、山萮菜、拟南芥中也出现过；蔗糖合酶(Sucrose synthase)在十字花科植物盐芥、拟南芥、芜菁、山萮菜等植物中也存在；单脱水抗坏血酸还原酶在十字花科甘蓝、芜菁、拟南芥等植物中也出现；膜联蛋白(Annexin)在芜菁、芥菜、山萮菜、甘蓝等植物中也出现。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在油菜中也存在，抗坏血酸过氧化物酶在番木瓜、甘蓝中也存在。板蓝根中鉴定到的大多数蛋白在同科的植物如甘蓝、芜菁、拟南芥、山萮菜、番木瓜等植物中出现，说明同科植物可能具有植物分化的同源性。植物组织中存在大量的酶，会影响植物化学成分的生源途径。同科属的植物一般具有相似的酶体系，化合物在植物组织中的合成过程也类似，所以同科属的植物一般在化学成分上具有一定的相似性。
对鉴定的已知蛋白的等电点(PI)和精确分子量做散点图，通过观察分子量和等电点的分布。如图2所示，从板蓝根中鉴定到的蛋白的等电点主要集中在4.0～10.0之间，没有超过12.0的蛋白，通过观察纵坐标，蛋白的分子量普遍小于100kDa。
表1.板蓝根蛋白独特肽序列分布情况
实施例2：板蓝根蛋白质的生物信息学分析
1序列信息提取
原始数据中质谱鉴定到的蛋白质共计1116个(数据库更新后蛋白鉴定结果中的O49485被Q8LGJ6替换)，蛋白质序列信息批量提取自NCBI数据库(版本号：release 2014_09)，以FASTA格式保存(201409121009S0LYNE.fasta)。
2基因本体论(Gene Ontology,GO)功能注释
2.1序列比对(BLAST)
利用本地化序列比对软件NCBI BLAST+(ncbi-blast-2.2.28+-win32.ext)将鉴定到的蛋白质与NCBI nr数据库中的蛋白质序列进行比对。根据相似性原理，所得的同源蛋白的功能信息可以用于目标蛋白的功能注释。
2.2GO功能条目提取(Mapping)
BlastGO是一个用于基因/蛋白质功能注释和数据分析的应用软件。利用Blast2GO(Version 2.7.1)中的Mapping功能对所有目标蛋白的比对序列所关联的GO功能条目进行提取，共提取到与其中1105个目标蛋白序列(99％)相关的18513条GO功能条目。
2.3功能注释(Annotation)
在功能注释(Annotation)过程中，Blast2GO通过综合考量目标序列和比对序列的相似性、GO条目来源的可靠度，以及GO有向无环图的结构，将Mapping过程中提取的GO功能条目中符合条件的条目注释给目标蛋白。
2.4补充注释(Annotation augmentation)
功能注释(Annotation)过程中，对于有比对序列却没有注释信息的目标蛋白序列，适当放宽了注释条件，使更多的目标蛋白序列可以获得功能注释信息。对于剩余的其他通过序列比对仍然无法获得注释信息的目标蛋白序列，以及没有比对序列的目标蛋白序列，通过InterProScan在EBI数据库中搜索匹配的保守蛋白质motif，并将motif的功能注释信息注释给目标蛋白序列。之后利用Blast2GO中的ANNEX模块对注释信息进行了进一步的补充，并在不同GO类别之间建立联系，提高注释的准确性。经过补充注释，最终的注释统计结果为：共1113条蛋白序列被8656条GO功能条目注释。
2.5KEGG通路注释
在机体中，蛋白是通过相互的作用而发挥生物学方面的功能，因此蛋白之间的通路分析有助于掌握各个蛋白在通路中所行使的职能。利用KAAS(KEGG AutomaticAnnotation Server)将目标蛋白序列与KEGG GENES数据库中的植物蛋白序列进行比对，通过同源/相似蛋白的KO号注释到相关KEGG通路上。
3实验结果与分析
3.1功能注释(Annotation)
本项目中，共957条蛋白序列被6069条GO功能条目注释，平均GO层次为6.735。
3.2GO功能注释统计
GO功能注释结果统计如表2。细胞组分分析发现构成细胞(cell)的基因条目数最多，达到了1023条，其次是细胞器(organelle)序列为787条，参与膜(membrane)的形成总共有616条基因，具有细胞连接(celljunction)的多肽链有230条，胞外区(extracellularregion)有128条，说明板蓝根蛋白中的大多数基因参与了细胞的形成。
表2.细胞组分分析
分子功能分析发现板蓝根蛋白中许多的基因序列具有酶活性的调节、抗氧化活性、催化作用、转运活性、电子载体活性、绑定等一系列的功能。参与了机体内的一些列的生化反应，其中绝大多数的基因参与细胞的绑定(binding)和催化作用，分别占了53.3％和33.2％。说明板蓝根蛋白中的一些基因是一些蛋白作用靶标的绑定位点，并具有催化生化反应的作用，参与细胞代谢、转运和电子转移的过程。从表3可知，有16个蛋白序列具有抗氧化的活性，包括过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、膜联蛋白和一些未知的具有抗氧化的蛋白。
表3.分子功能分析
如表4所示，板蓝根蛋白参与生物的调节、生长、繁殖、代谢过程、信号传导、免疫系统过程等一系列的生物过程。板蓝根蛋白参与细胞过程(cellularprocess)占20.2％，代谢过程(metabolic process)14.7％，单有机体过程(single-organism process)占13.9％，应激反应(response to stimulus)占13.2％，其中一些蛋白与细胞的生长(growth)、繁殖(reproduction)也有一定的关系。研究发现有一小部分蛋白与免疫系统过程(immunesystem process)有关，提示板蓝根蛋白具有一定的免疫调节作用的潜能。
表4.生物过程分析
3.3 GO Slim注释与统计
在本项目中，利用GO forplant.obo对目标蛋白的功能进行了注解，结果共1112条目标蛋白序列被9282条GO slim功能条目注释，平均GO Slim层次为4.644。
如表5所示细胞组分主要由细胞器(722)、细胞(1022)、被膜腔(78)、细胞外区域(128)、膜(615)、高分子配合物(121)组成。如表6所示板蓝根蛋白的分子功能主要包括结构分子活性(structural molecule activity)、催化活性(catalytic activity)、酶调节活性(enzyme regulator activity)、分子传导活性(molecular transducer activity)、绑定(binding)、转运(transporter activity)，其中主要的是绑定(binding)有771条基因，占54.6％，其次是催化活性(catalytic activity)有479条基因，占33.9％。如表7所示，生物过程(Biological Process)的GO Slim注释统计中细胞过程(cellularprocess)有856条基因，占22.2％，其次是代谢过程(metabolic process)有652条，占16.9％，注释条目中还有与生长、繁殖、信号传导等有关的基因。通过对比GO功能注释统计和GO Slim注释统计发现，两种注释统计差异较小，说明本研究功能注释的可靠性。
表5.GO Slim细胞组分分析图
表6.GO Slim分子功能分析图
表7.GO Slim生物过程分析图
3.4 KEGG通路注释
本发明中，共提取到与731个目标蛋白序列相关的141条KEGG信号/代谢通路。板蓝根蛋白参与的信号通路主要包括内吞作用(Endocytosis)、内分泌和其他因子调节钙再吸收(Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption)、抗利尿激素调节的水重吸收(Vasopressin-regulated water reabsorption)、胰腺分泌(Pancreaticsecretion)、碳代谢(Carbon metabolism)、军团杆菌病(Legionellosis)、氨基酸的生物合成(Biosynthesis ofamino acids)、核糖体(Ribosome)、吞噬体(Phagosome)等一些列的通路。
板蓝根蛋白参与内吞作用(Endocytosis)信号通路的基因数目最多，达到154个，参与吞噬体(Phagosome)的信号通路基因为49个。人体中具有一些吞噬作用的细胞，其中包括中性粒细胞和巨噬细胞。当外来的细菌和病毒入侵时，可以通过吞噬菌体消灭，生物体内的一些损伤或者衰老的细胞也可以被吞噬掉。吞噬作用是高等动物最基本的防卫机制之一，属于非特异性免疫作用的范畴。吞噬体(Phagosome)具有很好的消灭入侵的病原微生物的功能。板蓝根蛋白中的基因参与内吞作用、吞噬体信号通路，说明板蓝根蛋白具有调节机体免疫功能的作用。通过KEGG信号通路分析，本发明发现板蓝根蛋白参与了抗菌和抗病毒的相关的信号通路，除了参与内吞作用和吞噬体信号通路外板蓝根蛋白也参与了EB病毒的感染(Epstein-Barr virus infection)、甲型流感(Influenza A)、霍乱弧菌感染(Vibriocholerae infection)、致病性大肠杆菌感染(Pathogenic Escherichia coli infection)等信号通路。
鉴定出来的板蓝根蛋白中有100个基因参与胰腺分泌(Pancreatic secretion)信号通路。说明板蓝根蛋白可能对胰蛋白酶具有一定的作用。鉴定出来的板蓝根蛋白中有67个基因参与氨基酸的生物合成(Biosynthesis ofamino acids)信号通路；板蓝根蛋白也参与癌症通路(Pathways in cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)、癌症转录误调节(Transcriptional misregulation in cancer)等与癌症相关的一些通路。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式了，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：取板蓝根药材经粉碎后，在液氮中研磨，加入预冷的三氯乙酸/丙酮溶液，离心，倒掉上清液；沉淀加入丙酮溶液，震荡，离心，重复此步骤至丙酮完全无色；室温干燥沉淀；取沉淀适量，加入裂解液裂解板蓝根植物组织及细胞，提取蛋白；采用超滤管酶解法酶切板蓝根蛋白，过滤后上清液进行肽段定量，进行质谱鉴定；通过Mascot软件进行数据库检索搜库，对鉴定到的蛋白进行生物信息学分析。
2.根据权利要求1所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取板蓝根药材粉末适量，在液氮中研磨后，加入在冰箱中预冷的三氯乙酸/丙酮溶液，然后放入-20℃冰箱中过夜；
(2)第二天用冷冻离心机设定温度为4℃，转数为6000rpm离心时间为30min，倒掉上清液；沉淀加入45mL预冷的丙酮溶液，震荡，4℃，6000rpm离心30min，重复此步骤2～5次，至丙酮完全无色；室温干燥沉淀；
(3)取适量沉淀，加入细胞裂解液进行裂解，沸水浴5～10min，然后超声处理，再放沸水浴5～10min；然后离心，收集离心上清液；再采用超滤管酶解法酶解板蓝根蛋白，过滤后取上清液进行肽段定量测定和进液质联用仪进行分析；通过Mascot软件进行数据库检索搜库对鉴定到的蛋白进行生物信息学分析。
3.根据权利要求2所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，超滤管酶解法酶解板蓝根蛋白的步骤如下：
收集离心上清液，加入二硫苏糖醇至终浓度为100mM，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μL UAbuffer混匀，转至10KD超滤管中，离心14000g 30min。加入200μL的UA缓冲液，离心力为14000g离心30min，倒掉上层液体。加入100μL 3-吲哚乙酸，600rpm振荡1min，避光室温30min，14000g离心20min。加入100μL UAbuffer，14000g离心20min重复2次；加入100μL的25mM NH3HCO3溶液，离心力为14000g，每次离心时间为20min总共离心2次；加入40μL 25mMNH3HCO3缓冲液，600rpm振荡1min，37℃放置16～18h；移到新的EP管中，离心力为14000g，离心15min；过滤后上清液进行肽段的定量测定。
4.根据权利要求2所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，细胞裂解液组成为：6M尿素，2M硫脲，60mM二硫苏糖醇，5％3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐和40mM三羟甲基氨基甲烷。
5.根据权利要求1至4任一项所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，其特征在于，液质联用的色谱分析条件为：
缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为含0.1％甲酸的乙腈水溶液，乙腈体积浓度为84％；色谱柱以95％的A液平衡；样品由自动进样器上样到上样柱中，再经分析柱分离，流速设定为250nL/min；
相关液相梯度洗脱程序为：0min～50min，B液线性梯度从0％～50％；50min～54min，B液线性梯度从50％～100％；54min～60min，B液比例保持不变。
6.根据权利要求1至4任一项所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，液质联用仪的色谱分析条件为：
分析时长为60min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300～1800m/z，一级质谱分辨率：70,000at m/z 200，AGC target设为3e6，动态排除：3.0s。
7.根据权利要求1至4任一项所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，质谱数据分析处理方法为：
通过Mascot软件对原始文件进行数据库检索。数据库为下载于uniprot的数据库；利用ProteomicsTools.3.1.6添加正反库；搜库参数设定如下：enzyme为trypsin；missedcleavage设为2；静态修饰设定Carbamidomethy C；动态修饰设定Oxidation M。Peptidestolerance设为20ppm，ms/ms tolerance设为0.1Da,protein FDR≤0.01，Peptide FDR≤0.01。
8.根据权利要求1至4任一项所述的板蓝根蛋白质鉴定方法，其特征在于，生物信息学分析方法为：
(1)序列信息提取
原始数据中质谱鉴定到的蛋白质序列信息批量提取自NCBI数据库，以FASTA格式保存；
(2)序列比对
利用本地化序列比对软件NCBI BLAST+(ncbi-blast-2.2.28+-win32.ext)将鉴定到的蛋白质与NCBI nr数据库中的蛋白质序列进行比对。根据相似性原理，所得的同源蛋白的功能信息可以用于目标蛋白的功能注释；
(3)GO功能条目提取
利用Blast2GO中的Mapping功能对所有目标蛋白的比对序列所关联的GO功能条目进行提取。
(4)功能注释
在功能注释过程中，Blast2GO通过综合考量目标序列和比对序列的相似性、GO条目来源的可靠度，以及GO有向无环图的结构，将Mapping过程中提取的GO功能条目中符合条件的条目注释给目标蛋白；
(5)补充注释
功能注释过程中，对于有比对序列却没有注释信息的目标蛋白序列，适当放宽了注释条件，使更多的目标蛋白序列可以获得功能注释信息；对于剩余的其他通过序列比对仍然无法获得注释信息的目标蛋白序列，以及没有比对序列的目标蛋白序列，通过InterProScan在EBI数据库中搜索匹配的保守蛋白质motif，并将motif的功能注释信息注释给目标蛋白序列。之后利用Blast2GO中的ANNEX模块对注释信息进行进一步的补充，并在不同GO类别之间建立联系，提高注释的准确性；
(6)KEGG通路注释
利用KAAS将目标蛋白序列与KEGG GENES数据库中的植物蛋白序列进行比对，通过同源/相似蛋白的KO号注释到相关KEGG通路上。
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