CN104198613A

CN104198613A - 一种分析蛋白o-糖基化位点的方法

Info

Publication number: CN104198613A
Application number: CN201410475759.5A
Authority: CN
Inventors: 迟连利; 白雪; 李道远
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-09-17
Also published as: CN104198613B

Abstract

本发明涉及一种分析蛋白O-糖基化位点的方法，步骤如下：(1)将蛋白质组样品或单个蛋白样品经内切酶酶切后，再经内切糖苷酶和外切糖苷酶酶切，制得带有GalNAc糖标签的肽段和非糖肽的组学蛋白样品或单个蛋白样品；(2)上样于榴莲凝集素色谱柱进行分离，制得组学蛋白样品；(3)将单个蛋白样品或组学蛋白样品使用C₁₈反相色谱柱分离，然后在正离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；(4)将得到的质谱数据进行处理，通过搜库结果获得蛋白糖基化位点信息。本发明建立了单个蛋白和组学蛋白样品中糖蛋白的O-糖基化位点的检测方法，能更快速、更准确、更全面的得到位点信息。

Description

一种分析蛋白O-糖基化位点的方法

技术领域

本发明涉及一种分析蛋白O-糖基化位点的方法，特别涉及一种采用内切酶和外切酶部分降解糖链并联合液质联用技术对糖蛋白O-糖基化位点进行检测和鉴定的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

蛋白的糖基化是一种重要的翻译后修饰。主要有N-糖基化(N-glycosylation)和O-糖基化(O-glycosylation)两种形式。蛋白糖基化参与了细胞的很多过程，并扮有重要的角色。此外，癌症等一些疾病的发生发展过程常伴随着蛋白的糖基化位点及糖链的异常变化。因此，糖基化位点的分析对于研究揭示糖蛋白的异常变化至关重要。位点分析不仅可以直观的得到特殊疾病的标志物糖基化的改变信息，也能使进一步的糖链结构位点特异性分析变得更加直接方便。

因为N-糖基化发生在蛋白质特征序列上，有共同的五糖核心结构，并且具有从蛋白质上释放N-糖链的通用糖苷内切酶，因此，蛋白N-糖基化位点的分析方法已经很成熟。相比之下，O-糖基化位点的分析具有极大的挑战。O-糖基化发生在丝氨酸或者苏氨酸上，没有特征修饰序列可做修饰位点预测；O-糖链的结构较复杂，至少存在8种核心结构；并且，还没有发现能将O糖链从蛋白上释放的通用内切酶，这些原因使得O-糖基化位点的分析困难重重。

通常O-糖基化位点的分析会用到化学释放法如β-消除法(Zheng Y,et al.Talanta2009，78:358-363)，但是化学法有时难以控制会产生一些副反应。除以上方法外，还有其它的一些外切酶方法(P et al.J Proteome Res，2007，6:3021-3031)，鉴定得到的O-糖基化位点比较有限。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种混合外切酶法分析蛋白O-糖基化位点，可用于糖蛋白等疾病生物标志物糖基化位点的分析。

发明概述

本发明利用内切酶与混合外切酶切去N糖链与O-糖链，连接N-糖链的天冬酰胺变为天冬氨酸，连接O-糖链的丝氨酸或苏氨酸只留有一个GalNAc糖标签。单个蛋白的肽段采用LC/MS/MS直接分析，发生O-糖基化的肽段分子量增加203Da，通过高分辨质谱获得精确分子量以及二级碎片信息，据此找出O-糖基化位点。组学样本的O-糖基化分析，先用榴莲凝集素将切剩一个GalNAc单位的糖肽富集，从而对位点进行分析。该方法简单，快速，高通量，可以用于标准样品和实际样品的糖基化位点的检测。

发明详述

一种分析蛋白O-糖基化位点的方法，步骤如下：

(1)将蛋白质组样品或单个蛋白样品经内切酶酶切后，再经内切糖苷酶和外切糖苷酶组合切除N糖链与部分O-糖链，经减压干燥，制得带有GalNAc糖标签的肽段和非糖肽的组学蛋白样品或单个蛋白样品；

(2)将步骤(1)制得的带有GalNAc糖标签的肽段和非糖肽的组学蛋白样品上样于榴莲凝集素色谱柱进行分离，收集到酶切后带有GalNAc糖标签的肽段溶液，经减压干燥后，制得组学蛋白样品；

(3)将步骤(1)制得的单个蛋白样品或步骤(2)制得的组学蛋白样品使用C₁₈反相色谱柱分离，然后在正离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；

(4)将得到的质谱数据用Mascot Distiller软件进行处理，再用MASCOT在SwissProt数据库中进行搜索，参数设定如下：

酶最大漏切位点：2；

固定修饰：Carbamidomethylation，半胱氨酸；

可变修饰：+HexNAc，203Da，丝氨酸和苏氨酸；+0.9840Da，天冬酰胺变成天冬氨酸；氧化，甲硫氨酸；乙酰化，N-末端；环化，N-末端；

母离子质量误差为15ppm，二级碎片质量误差为0.8Da；通过搜库结果获得蛋白糖基化位点信息。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中内切酶为：胰蛋白酶或蛋白内切酶Glu-C(金黄色葡萄球菌V8)，内切酶与蛋白样品的质量比为1：(20～30)。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中内切糖苷酶为：肽N-糖苷酶F(PNGase F)。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中外切糖苷酶为：β(1-3,4)半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和唾液酸酶的混合。进一步优选的，每100μg经内切酶酶切后的样品或单个蛋白样品加入每种内切糖苷酶和外切糖苷酶的量均为1μl，所述β(1-3,4)半乳糖苷酶的浓度为≥2U/ml、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的浓度为≥40U/ml、唾液酸酶的浓度为≥5U/ml。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中内切糖苷酶和外切糖苷酶的酶切条件均为：37℃条件下酶切24h。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中榴莲凝集素色谱柱按如下方法制备：将1.7mL的偶联榴莲凝集素的琼脂糖凝胶装于1×1900mm的全氟烷氧基树脂管中，偶联榴莲凝集素浓度为3.5～4.5mg/ml，制得榴莲凝集素色谱柱。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中榴莲凝集素色谱柱的分离条件如下：流速100μL/min，用洗涤缓冲液洗脱8个柱体积，再用含0.8M半乳糖的洗脱缓冲液洗脱5个柱体积；将洗脱液收集后，用HyperSep C18柱脱盐，即得；

所述洗涤缓冲液为100mM Tris–HCl,pH 7.4。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中C₁₈反相色谱柱的流动相A为含有甲酸和乙腈的溶液，甲酸质量浓度为0.1％，乙腈质量浓度为2％；流动相B为含有甲酸和乙腈的溶液，甲酸质量浓度为0.1％，乙腈质量浓度为98％。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中C₁₈反相色谱柱的的检测条件如下：

将步骤(1)制得的酶切后单个蛋白样品或步骤(2)制得的组学蛋白样品溶于流动相A中，配制成浓度为0.5～1.5μg/μL的待测溶液；

流速50μL/min，洗脱梯度为：0～5min，98％流动相A，2％流动相B；5～25min，85～98％流动相A，2～15％流动相B，25～55min，60～85％流动相A，15～40％流动相B，55～60min，2～60％流动相A，40～98％流动相B，60～70min，2％流动相A，98％流动相B。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中高分辨质谱采用LTQ-Orbitrap Velos Pro型高分辨质谱，设定参数为：同位素分辨率：60000；扫描质量范围：400～1800；数据采集采用数据依赖模式；碰撞能量设定为35％。

有益效果

本发明建立了单个蛋白和组学蛋白样品中糖蛋白的O-糖基化位点的检测方法，不仅简化了操作步骤，使得单个蛋白的糖基化位点分析更简单快速，而且此方法在组学蛋白样品等复杂的体系中，也能更快速、更准确、更全面的得到位点信息，对于与疾病诊断相关的标准样品和实际样品中O-糖基化位点的检测具有极大的实用价值。

附图说明

图1图1为本发明所述方法的实验流程；

图2胎球蛋白O-糖基化位点二级图谱示例；

图3hCG新O-糖基化位点二级图谱示例；

图4凝集素柱子富集血浆蛋白色谱图和各流分TIC图；

图5血浆蛋白Proteoglycan 4肽段SPDESTPELSAEPTPK O-糖基化位点的二级图谱；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

液相色谱仪为Shimadzu纳升液相色谱仪；质谱为Thermo LTQ-Orbitrap Velos Pro型高分辨质谱，工作站为Xcalibur。

实施例1

胎球蛋白O-糖基化位点的方法，步骤如下：

1.1将50μg胎球蛋白样品加入100mM含6M盐酸胍的碳酸氢铵缓冲液(pH8.2)，1M二硫苏糖醇(终浓度为100mM)，37℃水浴孵育1h后，加入1M碘乙酰胺(终浓度为150mM)室温避光反应30min。反应液用10kDa的超滤膜超滤后，加入胰蛋白酶(Trypsin，终浓度1-2％w/w)，37℃过夜，100℃加热2min终止反应，制得内切酶酶切产物。

1.2按每100μg内切酶酶切产物加入肽N-糖苷酶F 1μl，β(1-3,4)半乳糖苷酶1μl，β-N-乙酰氨基葡糖苷酶1μl和唾液酸酶A 1μl，37℃酶切24h，然后减压干燥，制得部分脱糖链肽段样本；

1.3含有0.1wt％甲酸的2wt％的乙腈溶液作为流动相A；

1.4含有0.1wt％甲酸的98wt％的乙腈溶液作为流动相B；

1.5将部分脱糖链肽段样本溶于流动相A，配制成浓度为1μg/μL的待测溶液，使用nano-LC system(Shimadzu)进行分离，样品用C₁₈捕集柱(Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,Japan)进行在线脱盐，再用Reprosil-Pur C₁₈beads(3μm)填料填装的C₁₈反相色谱柱(15cm×75μm i.d.)进行肽段的分离；流速50μL/min，洗脱梯度为：0～5min，98％流动相A，2％流动相B；5～25min，85～98％流动相A，2～15％流动相B，25～55min，60～85％流动相A，15～40％流动相B，55～60min，2～60％流动相A，40～98％流动相B，60～70min，2％流动相A，98％流动相B；

1.6使用Thermo LTQ OrbitrapVelos Pro质谱仪在正离子模式下进行检测，得到高分辨质谱图；设定参数为：同位素分辨率：60000；扫描质量范围：400～1800；数据采集采用数据依赖模式；碰撞能量设定为35％。

1.7将得到的质谱数据用Mascot Distiller软件进行处理，再用MASCOT在SwissProt数据库中进行搜索，参数设定如下：物种：哺乳动物；酶：胰蛋白酶；酶最大漏切位点：2；固定修饰：Carbamidomethylation(半胱氨酸)；可变修饰：+HexNAc(203Da)(丝氨酸和苏氨酸)，+0.9840Da(天冬酰胺变成天冬氨酸)，氧化(甲硫氨酸)，乙酰化(N-末端)，环化(N-末端)；母离子质量误差为15ppm，二级碎片质量误差为0.8Da。通过搜库结果获得胎球蛋白糖基化位点信息，如表1所示：

表1

胎球蛋白搜库得倒的糖基化位点的二级图谱示例如图2所示。通过本方法成功检测到胎球蛋白所有文献报道的O-糖基化位点。

实施例2

与实施例1的分析方法相同，不同之处在于所分析的样品为人绒毛膜促腺性激素(hCG)，通过搜库结果获得的hCG蛋白糖基化位点信息如表2所示：

表2

注：加粗表示新发现糖基化位点

通过本方法不仅成功检测到hCG蛋白所有文献报道的O糖基化位点，并且发现了3个新的糖基化位点，其二级图谱如图3所示。

实施例3

血浆蛋白O-糖基化位点的方法，步骤如下：

1.1将20μL血浆用ProteoExtract Albumin Removal Kit按照说明书除去白蛋白

1.2将除去白蛋白的血浆样品加入100mM含6M盐酸胍的碳酸氢铵缓冲液(pH8.2)，1M二硫苏糖醇(终浓度为100mM)，37℃水浴反应1h后，加入1M碘乙酰胺(终浓度为150mM)室温避光处理30min。反应液用10kDa的超滤膜超滤后，加入胰蛋白酶(Trypsin，终浓度1-2％w/w)，37℃过夜，100度加热2min终止反应，制得内切酶酶切产物。

1.2按每100μg内切酶酶切产物加入肽N-糖苷酶F 1μl，β(1-3,4)半乳糖苷酶1μl，β-N-乙酰氨基葡糖苷酶1μl和唾液酸酶A 1μl，37℃酶切24h，然后减压干燥，制得带有GalNAc糖标签的肽段和非糖肽的样品；

1.3将1.7mL的偶联榴莲凝集素的琼脂糖装于1×1900mm的全氟烷氧基树脂管中，制备得到榴莲凝集素色谱柱；

1.4将制得的带有GalNAc糖标签的肽段和非糖肽的样品上样于榴莲凝集素色谱柱进行分离，流速100μL/min，用洗涤缓冲液(100mM Tris–HCl，pH 7.4)洗脱8个柱体积，再用含0.8M半乳糖的洗脱缓冲液洗脱5个柱体积；将洗脱液收集后，用HyperSep C₁₈柱脱盐，然后减压干燥，制得富含带有GalNAc糖标签肽段的样本；

1.5含有0.1％甲酸的2％的乙腈作为流动相A；

1.6含有0.1％甲酸的98％的乙腈作为流动相B；

1.7将富集后的富含带有GalNAc糖标签肽段的样本溶于流动相A，制得浓度为1μg/μL的待测溶液，使用nano-LC system(Shimadzu)进行分离，样品用C₁₈捕集柱(ChemicalsEvaluation and Research Institute,Japan)进行在线脱盐，再用Reprosil-Pur C₁₈beads(3μm)填料填装的C18反相色谱柱(15cm×75μm i.d.)进行肽段的分离；流速50μL/min，洗脱梯度为：0～5min，98％流动相A，2％流动相B；5～25min，85～98％流动相A，2～15％流动相B，25～55min，60～85％流动相A，15～40％流动相B，55～60min，2～60％流动相A，40～98％流动相B，60～70min，2％流动相A，98％流动相B；

1.7将得到的质谱数据用Mascot Distiller软件进行处理，再用MASCOT在SwissProt数据库中进行搜索，参数设定如下：物种：人；酶：Trypsin；酶最大漏切位点：2；固定修饰：Carbamidomethylation(半胱氨酸)；可变修饰：+HexNAc(203Da)(丝氨酸和苏氨酸)，+0.9840Da(天冬酰胺变成天冬氨酸)，氧化(甲硫氨酸)，乙酰化(N-末端)，环化(N-末端)；母离子质量误差为15ppm，二级碎片质量误差为0.8Da。通过搜库结果获得血浆蛋白糖基化位点信息，如表3所示：

表3

注：斜体字表示新发现的糖蛋白或糖肽；加粗表示新发现的糖基化位点

凝集素柱子富集色谱图和各流分TIC图如图4所示，血浆蛋白O-糖基化位点的二级图谱示例如图5所示。

Claims

1.一种分析蛋白O-糖基化位点的方法，其特征在于，步骤如下：

酶最大漏切位点：2；

固定修饰：Carbamidomethylation，半胱氨酸；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中内切酶为：胰蛋白酶或蛋白内切酶Glu-C，内切酶与蛋白样品的质量比为1：(20～30)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中内切糖苷酶为：肽N-糖苷酶F。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中外切糖苷酶为：β(1-3,4)半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和唾液酸酶A的混合；进一步优选的，每100μg经内切酶酶切后的样品或单个蛋白样品加入每种内切糖苷酶和外切糖苷酶的量均为1μl，所述β(1-3,4)半乳糖苷酶的浓度为≥2U/ml、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的浓度为≥40U/ml、唾液酸酶的浓度为≥5U/ml。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中内切糖苷酶和外切糖苷酶的酶切条件均为：37℃条件下酶切24h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中榴莲凝集素色谱柱按如下方法制备：将1.7mL的偶联榴莲凝集素的琼脂糖凝胶装于1×1900mm的全氟烷氧基树脂管中，偶联榴莲凝集素浓度为3.5～4.5mg/ml，制得榴莲凝集素色谱柱。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中榴莲凝集素色谱柱的分离条件如下：流速100μL/min，用洗涤缓冲液洗脱8个柱体积，再用含0.8M半乳糖的洗脱缓冲液洗脱5个柱体积；将洗脱液收集后，用HyperSep C18柱脱盐，即得；

所述洗涤缓冲液为100mM Tris–HCl,pH 7.4。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中C₁₈反相色谱柱的流动相A为含有甲酸和乙腈的溶液，甲酸质量浓度为0.1％，乙腈质量浓度为2％；流动相B为含有甲酸和乙腈的溶液，甲酸质量浓度为0.1％，乙腈质量浓度为98％。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中C₁₈反相色谱柱的的检测条件如下：

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中高分辨质谱采用LTQ-Orbitrap Velos Pro型高分辨质谱，设定参数为：同位素分辨率：60000；扫描质量范围：400～1800；数据采集采用数据依赖模式；碰撞能量设定为35％。