CN102590376B - 凝集素富集和18o标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种糖蛋白组定量方法，具体步骤为：将来自不同疾病或者相同疾病不同阶段患者的血清样本分为两组，除去高丰度蛋白，测定蛋白浓度，取等蛋白量样本进行除盐和酶解；将所得的酶解产物进行凝集素亲和层析以得到相应的亚糖蛋白组，冻干；分别以H₂ ¹⁸O和H₂ ¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合固化胰酶进行C端标记，冻干后，再以H₂ ¹⁸O和H₂ ¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合N-糖酰胺酶进行N糖基化位点标记，冻干；将两组样本混合上样进行液相色谱-质谱检测，建立基于Mascot Distiller的自定义算法进行定量数据处理。本发明拥有足够的精确性和可重复性，在1∶10～10∶1的范围之内能够保持线性，可精确的反应样本中不同N-糖链结构糖型的糖蛋白变化。

Description

凝集素富集和18O标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法

技术领域

本发明涉及一种糖蛋白组定量方法，具体涉及一种用于糖蛋白组学研究的凝集素富集和¹⁸O标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法，属于生物技术领域。 

背景技术

蛋白的糖基化是重要的翻译后修饰，对于蛋白的折叠、稳定性和活性都有着重要的意义。蛋白的糖基化和糖型改变在慢性炎症、免疫应答、细胞识别及细胞免疫调控等病理生理过程中均起重要作用，且在恶性肿瘤的发生过程中参与细胞的恶性转化、提示病灶周围的微环境变化并与恶性肿瘤的发展侵袭紧密相关；很多已知的癌相关生物标志物(Biomarker)都是糖蛋白，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)等；这些都决定着糖蛋白组学在疾病及肿瘤研究中具有重要而独特的地位。 

如何目的性的富集糖蛋白并进行有效识别和定量是目前糖蛋白组学研究中的主要难题。研究人员已建立很多富集技术用于N糖基化蛋白分析，但这些技术多集中于以下三种情况，1)研究糖基转移酶的改变或样品中糖蛋白/糖肽的总体糖基化程度和糖链结构改变趋势，但不能明确单个糖蛋白发生的具体糖链结构的改变情况；2)针对单独的蛋白进行糖链变化研究，如AFP异质体就是利用AFP蛋白N糖链上的α1-6岩藻糖的增加来进行诊断，但每次实验只能选择性的研究一种或数种蛋白在特定糖链类型上的水平改变；3)研究糖链结构在不同疾病状态下的整体改变情况，但无法将这些糖链结构改变和具体的蛋白结合起来，只能孤立的进行总体糖链改变的研究。这些方法均针对于样本中的总糖蛋白或总糖链进行研究，无法实现对组织或血液等复杂生物样本中大量复杂糖蛋白的糖基化改变的高通量定量研究，而复杂样本中每个糖蛋白的糖基化改变都会导致相应糖蛋白功能的改变，从而引起人体的病理变化过程，尤其是参与肿瘤的发生和侵袭转移过程。 

¹⁸O标记是一种相对简单、特异和成本效益好的稳定同位素标记技术，它可 以对样本中所有胰蛋白酶裂解的肽段C端羧酸进行普遍而序列独立性的标记，同时没有副反应的发生。研究者对其进行了不断的完善，Liu等富集总糖肽后在肽段C端及N糖基化位点序贯标记3个¹⁸O，与¹⁸O标记的糖肽产生6Da质量差，提高了糖基化位点鉴定和相对定量研究的准确性，得到较好的结果。但这种3¹⁸O的标记技术，没有成熟的计算机自动化处理算法和专用软件，只能依靠手工计算，这也是以往的开发者所特别指出的不足之处(Liu et a1.Proteome Res 9，227-236，2010)，对于大样本量的复杂生物样本的数据处理显然力不从心，同时这个方法尚无法确定发生糖基化改变的糖蛋白所发生的具体糖链结构变化。 

本发明针对上述糖蛋白研究中富集、标记和计算等主要问题，建立了一个整体性的策略，应用凝集素层析富集不同糖链特征的蛋白样本，联合固化胰酶(Immobilized Trypsin)及N-糖酰胺酶(PNGase-F)进行序贯¹⁸O标记，将不同糖型的配对蛋白样本以液相色谱-质谱(LC-MS)进行相对定量，而且建立基于Mascot Distiller软件(版本2.3.2.0，Matrix Science公司)的自定义的自动化算法进行数据处理，最终能够全面研究复杂生物样本中的不同糖链结构类型的糖蛋白改变情况。本发明在标准糖蛋白中验证了此方法的准确性和可重复性，又以健康人和肝癌患者的血清以ConA(concanavalin A)、LCH(Lens culinaris)和WGA(Wheat Germ agglutintin)三种凝集素层析后进行标记，通过自建的算法获得了定量数据，并加以验证，显示了这种方法可以高通量的获取复杂样本中糖蛋白的糖型变化，改进层析和标记方法后，这种整体性的研究策略可以应用在更广泛的组织标本或体液标本中，有利于疾病生物标志物的发现和疾病的治疗。 

发明内容

本发明的目的是提供一种糖蛋白组定量方法，用于在复杂的生物样本中，进行相对定量的高通量糖蛋白组学研究，寻找疾病相关糖基化位点，分析糖基化程度改变、糖链结构变化与病变的关系，寻找疾病相关的糖生物标志物，进行相关药理学和药效学研究，以真正了解糖蛋白的糖型对于疾病发生发展的意义。 

为了达到上述目的，本发明提供了一种糖蛋白组定量方法，其特征在于，具体步骤为： 

第一步：将来自不同疾病或者相同疾病不同阶段患者的血清样本分为两组，(各组样本根据研究目的可以等量混合或不混合)，除去高丰度蛋白，测定蛋白 浓度，取等蛋白量样本进行除盐和酶解； 

第二步：将第一步所得的酶解产物进行凝集素亲和层析以得到相应的亚糖蛋白组，冻干； 

第三步：分别以H₂ ¹⁸O和H₂ ¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合固化胰酶进行C端标记，冻干后，再分别以H₂ ¹⁸O和H₂ ¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合N-糖酰胺酶进行N糖基化位点标记，冻干； 

第四步：将两组样本混合上样进行液相色谱-质谱检测，建立基于Mascot Distiller的自定义算法进行定量数据处理。 

优选地，所述的自定义定量算法采用的定量协议为前导扫描(precursor)，所述的自定义定量算法中定义了三个独有修饰组(exclusive modification groups)来进行计算，A组(Group A)定义为2个¹⁸O标记在C端及1个¹⁸O标记在N糖基化位点，B组(Group B)定义为1个¹⁸O标记在C端及1个¹⁸O标记在N糖基化位点，C组(Group C)定义为¹⁶O标记在上述位点，相对的丰度比值由以下公式计算得到： 

ratio(¹⁸O/¹⁶O)＝(Group A+Group B)/Group C； 

其中，ratio(¹⁸O/¹⁶O)代表¹⁸O标记的糖肽与¹⁶O标记糖肽的丰度比值，GroupA、Group B和Group C分别代表A组、B组和C组的丰度。 

本发明的优点为： 

1)本发明优化结合了最新的¹⁸O标记技术、凝集素富集技术，以及自定制的定量算法，形成了一个完整的高通量定量糖蛋白组研究技术策略。经过在标准糖蛋白和实际临床样本上的验证，此方法拥有足够的精确性和可重复性，在1∶10～10∶1的范围之内能够保持线性，可精确的反应样本中不同N-糖链结构糖型的糖蛋白变化，能够可靠的应用于生物样本的糖蛋白与疾病关系的研究中。 

2)此方法有机地融入了凝集素层析的糖蛋白富集技术，弥补了以往研究方法中将糖蛋白和糖链结构类型的变化孤立进行研究的缺陷，并能够在一次实验中定量研究复杂生物样本中所有发生改变的糖蛋白的蛋白表达水平、糖基化位点、糖基化程度和糖链结构类型的变化。 

3)由于使用凝集素富集糖蛋白，将整个糖蛋白质组分成了更多的亚组进行研究，减低了样本的复杂度，使各个凝集素水平上能够辨认到的发生改变的蛋白 总数，多于单纯的全糖蛋白质组研究，这对于更好的低丰度生物标志物的发现也具有一定的意义 

4)在多凝集素水平同时发生不同变化的一系列糖蛋白，这种不同亚糖蛋白组的序列性改变，其本身作为疾病诊断和预后判断的生物标志物，可以较单一糖链或糖蛋白水平的生物标志物更有特异性。 

5)本方法应用3个¹⁸O标记糖蛋白产生足够大的质量差异(6Da)，使质谱能够更准确的识别和测量糖肽；对于复杂生物样品中得到的大量数据，自定义的自动化软件算法可以较手工计算更快更大规模的进行处理，并给出糖肽和糖蛋白的相对定量值，同时保持其准确性，可以高通量的进行试验数据的分析，能够用于手工定量计算无法处理的临床复杂样品的巨量数据的分析。 

附图说明

图1为本发明的具体流程图。 

图2为应用固化胰酶及N-糖酰胺酶在糖肽上标记3个¹⁸O的反应过程图。 

图3A为质谱图示¹⁸O标记后标准糖蛋白在非糖肽中所产生的不同质量差异。 

图3B为质谱图示¹⁸O标记后标准糖蛋白在糖肽中所产生的不同质量差异。 

图4A为各比率下标准糖蛋白Invertase中糖肽FATN*TTLTK的手动计算结果线性曲线图；*为N糖基化位点。 

图4B为各比率下标准糖蛋白Invertase中糖肽FATN*TTLTK的Mascot Distiller计算结果线性曲线图；*为N糖基化位点。 

图4C为各比率下标准糖蛋白Invertase中糖肽LMTN*ETSDRPLVHFTPNK的手动计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。 

图4D为各比率下标准糖蛋白Invertase中糖肽LMTN*ETSDRPLVHFTPNK的Mascot Distiller计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。 

图4E为各比率下标准糖蛋白Fetuin中糖肽AESN*GSYLQLVEISR的手动计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。 

图4F为各比率下标准糖蛋白Fetuin中糖肽AESN*GSYLQLVEISR的Mascot Distiller计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。 

图4G为各比率下标准糖蛋白Fetuin中糖肽LAPLN*DSR的手动计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。 

图4H为各比率下标准糖蛋白Fetuin中糖肽LAPLN*DSR的Mascot Distiller计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。 

图5A为¹⁸O标记的样本组的样本与¹⁶O标记的样本组的样本1∶1混合时来自标准糖蛋白Invertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。 

图5B为¹⁸O标记的样本组的样本与¹⁶O标记的样本组的样本1∶2混合时来自标准糖蛋白Invertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。 

图5C为¹⁸O标记的样本组的样本与¹⁶O标记的样本组的样本2∶1混合时来自标准糖蛋白Invertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。 

图5D为¹⁸O标记的样本组的样本与¹⁶O标记的样本组的样本1∶5混合时来自标准糖蛋白Invertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。 

图5E为¹⁸O标记的样本组的样本与¹⁶O标记的样本组的样本5∶1混合时来自标准糖蛋白Invertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。 

图5F为¹⁸O标记的样本组的样本与¹⁶O标记的样本组的样本10∶1混合时来自标准糖蛋白Invertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。 

图5G为¹⁸O标记的样本组的样本与¹⁶O标记的样本组的样本1∶10混合时来自标准糖蛋白Invertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。 

图6A为Mascot Distiller得出的标准糖蛋白Invertase在各混合比率下的蛋白标准曲线。 

图6B为Mascot Distiller得出的标准糖蛋白Fetuin在各混合比率下的蛋白标准曲线。 

图7A为ConA富集的血清糖蛋白Clusterin的去糖基化肽LAN*LTQGEDQYYLR的质谱图； 

图7B为ConA富集的血清糖蛋白Clusterin的糖肽的b、y离子序列谱图； 

图7C为ConA富集的血清糖蛋白Clusterin的非糖肽的b、y离子序列谱图； 

图8A为肝癌患者组和对照组间对应ConA、LCH、WGA水平发生不同丰度变化的糖肽。 

图8B为肝癌患者组和对照组间对应ConA、LCH、WGA水平发生不同丰度变化的糖蛋白。 

图9A为使用Trans-Proteomic Pipel ine Ver.4.5(TPP，Seattle Proteome Center)中的自定义定量工具XPRESS，对实验数据进行处理所得结果图。 

图9B为使用Trans-Proteomic Pipeline Ver.4.5(TPP，Seattle Proteome Center)中的自定义定量工具ASAP ratio，对实验数据进行处理所得结果图。 

具体实施方式

本发明提供了一种凝集素富集¹⁸O标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法，其特征在于，应用凝集素层析将具有不同糖链特征的糖蛋白样本分离成相应的亚糖蛋白组，联合固化胰酶及N-糖酰胺酶进行序贯¹⁸O标记，将不同糖型的配对蛋白样本以液相色谱-质谱进行相对定量，建立基于Mascot Distiller的自定义算法进行定量数据处理，最终能够实现高通量的研究复杂生物样本中的与某一病理过程，如肿瘤的侵袭转移密切相关的多种糖蛋白糖基化改变，包括糖基化位点、糖基化程度及糖链结构的定量和定性改变。 

下面结合实施例来具体说明本发明。 

实施例1：方法学的建立 

如图1所示，本发明的糖蛋白定量方法的具体步骤为： 

第一步：标准糖蛋白样本制备： 

将标准糖蛋白牛胎球蛋白(Bovine fetuin，Sigma公司)200ug和酵母转化酶(Yeast invertase，Sigma公司)200ug，分别用50mM NH₄HCO₃溶解后得到浓度为1ug/uL的蛋白样本； 

第二步：蛋白样本酶解： 

将第一步所得的浓度为1ug/uL的蛋白样本在100℃水浴10分钟，恢复至室温后，加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol，Sigma公司)，所加入的二硫苏糖醇的量为10mM(在蛋白样本溶液中的浓度)，在57℃孵育30分钟，再加入碘乙酰胺(Iodoacetamide，GE Healthcare公司)，所加入的碘乙酰胺的量为30mM(在蛋白样本溶液中的浓度)，室温避光孵育60分钟，最后再加入二硫苏糖醇，所加入的二硫苏糖醇的量为10mM(在蛋白样本溶液中的浓度)，57℃孵育10分钟。将所得的混合物用3kDa截留分子量(MWCO)的Spin column(Pierce公司)除盐后，将所得的除盐混合物按照1∶80的质量比加入胰酶(Trypsin，Sigma公司)，37℃孵育4小时，将所得的部分酶解混合物再按照1∶80的质量比加入胰酶，37℃孵育12小时，酶解后的样本100℃水浴10分钟并立即置于冰上5分钟，以充 分萃灭胰酶得到酶解后的肽样本，防止后步操作中回标的发生。整个方法中，各步骤各组均同步进行，以避免组间差异。 

第三步、凝集素亲和层析： 

选用ConA凝集素进行亲和层析。以固定ConA的树脂装柱，并以Binding Buffer洗柱3次，将第一步所得的酶解后的肽样本以Binding Buffer稀释(按体积稀释，比例：5X Binding Buffer/样本＝1/4)，上柱，使用颠倒混匀的摇床孵育10分钟，再以Binding Buffer清洗柱床4次，使用Elution Buffer孵育5分钟，离心洗脱目的糖肽，重复使用Elution Buffer孵育、洗脱一次。合并洗脱液后上C18小柱(Waters公司)，以除去洗脱液中的杂质和糖分，冻干样本。 

上述的固定ConA的树脂、Binding Buffer以及Elution Buffer均来自Glycoprotein工solation Kit，Pierce公司生产。 

第四步、同位素标记： 

将第三步所得的冻干样本加入20％(slurry v/w，胶体态的固化胰酶的体积和蛋白冻干样本的质量之比)的固化胰酶(Immobilized Trypsin，ABI公司)，轻摇20分钟然后冻干，以100μL含20％(体积浓度)乙腈的50mM NH₄HCO₃(pH6.8)溶液重溶样本，两组样本的NH₄HCO₃溶液分别以H₂ ¹⁸O(Cambridge Isotope公司)和H₂ ¹⁶O制备，于37℃下酶催化进行C端标记24小时。以MicroSpin column(Pierce公司)除去固化胰酶。加入5μL甲酸，以萃灭可能残留的胰酶活性，冻干，以H₂ ¹⁸O和H₂ ¹⁶O分别配置的100mM NH₄HCO₃溶液重溶(H₂ ¹⁸O和H₂ ¹⁶O与固化胰酶标记时对应)，以1μL/mg(以初始蛋白量为基准)的量加入PNGase-F(New England Biolabs公司)，37℃孵育过夜。样本冻干后，将¹⁸O标记的样本组的样本与¹⁶O标记的样本组的样本分别按照1∶1，1∶2，2∶1，1∶5，5∶1，1∶10，10∶1的体积比例进行混合上样进行液相色谱-质谱检测。 

第五步、质谱数据处理和分析： 

质谱所得数据由手动计算，并于Mascot Distiller软件搜库并应用如表1所示的自定义定量算法得到定量结果。其中定量协议为前导扫描(precursor)，为了防止C端不完全标记和回标现象对定量结果的干扰，本发明在自定义定量算法中定义了三个独有修饰组(exclusive modification groups)来进行计算，A组(Group A)定义为2个¹⁸O标记在C端及1个¹⁸O标记在N糖基化位点，B组 (Group B)定义为1个¹⁸O标记在C端及1个¹⁸O标记在N糖基化位点，C组(Group C)定义为¹⁶O标记在上述位点。因为在本发明的实验中，各组样本是独立处理的，所以在一组样本中只会出现给定的一组修饰，不可能出现各组修饰混合出现的情况，所以本发明应用了独有修饰组(exclusive modification groups)的定义方式以避免可变修饰(variable modifications)所造成的过于复杂的计算。自定义算法中按照本发明应用的H₂ ¹⁸O的纯度定义了¹⁸O同位素的纯度为97％，以进一步减小误差。相对的丰度比值由以下公式计算得到： 

ratio(¹⁸O/¹⁶O)＝(Group A+Group B)/Group C； 

式中，其中，ratio(¹⁸O/¹⁶O)代表¹⁸O标记的糖肽与¹⁶O标记糖肽的丰度比值，GroupA、Group B和Group C分别代表A组、B组和C组的丰度。 

表1、自定义算法具体设定： 

第六步：结果分析： 

本发明的目的是建立凝集素富集糖肽联合酶促¹⁸O₃标记技术，对不同N糖基化类型的糖蛋白组学进行相对定量，并能以软件自动化处理数据，得到定量结果，整个方法在糖肽和糖蛋白的定量结果上应该保持具备线性、准确性和可重复性。经过消化和凝集素层析之后，得到具有凝集素相对应特异性糖链结构的糖肽，构成了亚糖蛋白组，通过Trypsin和PNGase-F处理，对于糖肽，2个¹⁸O标记到肽段的C端和1个¹⁸O标记到N-糖基化位点，从而与¹⁶O处理的配对肽段产生6Da的质量差，对于非糖肽，2个¹⁸O标记到肽段的C端，没有糖基化位点可标记，因此只有4Da的质量差，且这些配对肽段具有相同的保留时间(retention time)，当它们最终按照实验设计的比率混合后，可以在后面的质谱检测中被准确的识别和分析。整个体系是基于¹⁸O标记的，其具体的反应式见图2，相对的浓度比例由前导扫描(the precursor scan)中肽的离子对的相对信号强度来定量，在开始的实验设计中，可以根据需要研究的具体糖链类型选择相应的凝集素。 

为了明确此方法对于N-糖蛋白定量的可行性，本发明应用两种标准糖蛋白Invertase和Fetuin来进行验证。标准糖蛋白被胰酶消化，应用ConA(concanavalin A)进行凝集素层析，按照前述的流程处理后，将以¹⁸O及¹⁶O标记的样本，以1∶1，1∶2，2∶1，1∶5，5∶1，1∶10，10∶1的体积比例进行混合，以LC-MS进行处理，按照公式 $\mathrm{Ratio}(O_{16}/O_{18})=$ $\frac{I_0}{I_2+I_4+I_6-\left(\frac{M_2}{M_0}\right)I_4-[\frac{M_2}{M_0}+\frac{M_4}{M_0}-{\left(\frac{M_2}{M_0}\right)}^2]I_2-[\frac{M_2}{M_0}+\frac{M_4}{M_0}+\frac{M_6}{M_0}-{\left(\frac{M_2}{M_0}\right)}^2+{\left(\frac{M_2}{M_0}\right)}^3-2\frac{M_2{M}_4}{{M_0}^2}]I_2}$

计算糖肽的相对浓度值，即¹⁸O₃/¹⁶O₃的比率；式中，其中I₀、I₂、I₄和I₆是实验得到的谱图中第一个、第三个、第五个、第七个峰的强度；M₀、M₂、M₄和M₆是相应的理论同位素峰的强度，可以通过MS-Isotope(http://prospector.ucsf.edu)计算得到。以公式 $\mathrm{Ratio}(O_{16}/O_{18})=$ $\frac{I_0}{I_2+I_4-\left(\frac{M_2}{M_0}\right)I_2-[\frac{M_2}{M_0}+\frac{M_4}{M_0}-{\left(\frac{M_2}{M_0}\right)}^2]I_0}.$

计算非糖肽的相对浓度值，即¹⁸O₂/¹⁶O₂比率。 

首先，在质谱图上，¹⁸O标记后标准糖蛋白在非糖肽和糖肽中所产生的不同质 量差异。对于标准糖蛋白Invertase中的非糖肽VFWYEPSQK，在1∶1的¹⁸O/¹⁶O混合比率中，质谱峰产生4Da的质量差异(图3A)。对于同一个蛋白中的糖肽FATN*TTLTK，在1∶1的¹⁸O/¹⁶O混合比率中，质谱峰产生6Da的质量差异(图3B)，(*为N糖基化位点)。这样，就可以在分析中准确的区别糖肽和非糖肽。本发明手工计算了Invertase和Fetuin中4个糖肽和4个非糖肽的变化比率，发现它们和理论值非常接近，如表2所示： 

表2：标准糖蛋白中，手动计算和自定义算法对于糖肽和非糖肽的相对定量结果对比表。其中，样本A以¹⁸O标记，B以¹⁶O标记。*为N糖基化位点，N表示未给出数值。 

图4A-图4H为各比率下标准糖蛋白中糖肽的线性曲线，M为手动计算结果，D为Mascot Distiller计算结果，两者相关系数(R2)均＞0.99，提示本实验方法保持着较好的线性和准确性，Mascot Distiller所得曲线和手工计算曲线显示出类似的准确性，可以替代手工计算，为实验结果的分析提供准确的数据。图5A-图5G为来自标准糖蛋白Invertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。这说明这种实验方法，无论对于糖肽还是非糖肽而言，在1∶10～10∶1的动态区间内都拥有良好的线性和准确性，其相对定量结果是可信的。 

Mascot Distiller的相对定量结果： 

本发明应用Mascot软件重新处理了上步中得到的标准糖蛋白验证数据，并于Mascot Distiller中使用自定义的定量算法(Quantitation Methods)计算了各比例混合的糖肽和非糖肽相对浓度值，并进一步得出了糖蛋白的相对浓度值.从表2中可以看出，对于糖肽和非糖肽的相对定量计算，Mascot Distiller结合 自定义的定量算法得出的结果，与理论值及手工计算的结果相比，非常接近，在1∶10～10∶1的动态区间内，具有有良好的线性和准确性(表2、图4)。而且Mascot Distiller最终直接给出了各个蛋白水平的相对定量数据，图6A和图6B为Mascot Distiller得出的标准糖蛋白Invertase和Fetuin在各混合比率下的蛋白标准曲线，其相关系数(R²)均＞0.99，提示本实验在蛋白水平也保持着较好的线性和准确性，可以为实验结果的分析提供准确的数据，这充分说明这种定量算法，在¹⁸O串联标记的糖肽和非糖肽的定量计算中，其结果是相当可靠的，可以替代手工计算，为进一步的分析，提供数据依据。对于蛋白样本中寻找biomarker的研究，可以准确的直接给出凝集素相对应特异性糖链结构蛋白的相对定量值，极大的方便了实验结果的分析。 

如前所述，在Mascot Distiller定量方法的设定中，本发明定义了三个修饰组(modification groups)，用(Group A+Group B)/Group C计算得出最终的¹⁸O/¹⁶O的相对定量值，以防止回标和不完全C-端¹⁸O标记对定量结果的影响，如果不考虑这些影响因素，将会给最终的结果计算带来比较大的误差。 

为得到本方法中糖肽和糖蛋白相对定量的衡量标准，本发明采用Liu等的方法(Liu et al.Proteome Res 9，227-236，2010)，对以1∶1¹⁶O/¹⁸O比例混合的标准糖蛋白进行了7次重复分析和定量计算，测量出了本方法标准糖蛋白质谱测定中的标准误(SD)。自动化计算的相对定量数值如表3所示： 

表3：ConA凝集素富集的1∶1¹⁸O/¹⁶O比率混合的标准糖蛋白Fetuin和Invertase中，糖蛋白和四个糖肽的标准偏差(SD)，数值由Mascot Distiller计算得到，*为N糖基化位点。 

对于糖肽来说，SD的范围是0.023to 0.186，对于糖蛋白，SD的范围是0.075to 0.216。实验测得的糖肽和糖蛋白比率在3倍最大SD值之外，认为其有显著性变化，在1～3倍SD值之内，可以认为其有较小的变化22。依此，本发明给 出了本实验方法的定量标准，对于糖肽而言，比率小于0.63，大于1.57被认为具有显著性变化，比率在0.63～0.84及1.19～1.57之间被认为具有轻度变化，对于糖蛋白而言，比率小于0.60，大于1.65被认为具有显著性变化，比率在0.60～0.82及1.22～1.65之间具有轻度变化。 

综上，本发明看到Mascot Distiller的计算结果和手工计算几乎没有差异，自动化计算的结果是可靠的，可以取代手动计算，用于实验结果的分析，同时SD值的重复分析结果，也代表着本实验具有较好的可重复性。 

实施例2：实际临床样本验证 

1、样本处理： 

3例肝细胞癌患者(均来自复旦大学附属中山医院)及3例健康人对照组的血清分别等量混合后，作为肝细胞癌患者组和对照组，以ProteoMiner Protein Enrichment Kit(Bio-Rad公司)除去白蛋白和免疫球蛋白G等高丰度蛋白。测定蛋白浓度后，取等蛋白量进行下一步操作。 

2、蛋白样本酶解：操作同实施例1。 

3、凝集素亲和层析： 

选用ConA，WGA和LCH凝集素进行亲和层析。其中，固定ConA的树脂、固定WGA的树脂、相应的Binding Buffer以及Elution Buffer均来自Glycoprotein Isolation Kit，Pierce公司生产，固定LCH的树脂、相应的Binding Buffer以及Elution Buffer均来自AffiSpin Lectin kit，GALAB公司生产，ConA凝集素亲和层析步骤与实施例1中相同，WGA和LCH的凝集素亲和层析步骤类似于实施例1中的ConA凝集素亲和层析步骤，区别在于所用凝集素不同。 

4、同位素标记：操作步骤同实施例1，其中，肝细胞癌患者组以¹⁸O标记，对照组以¹⁶O标记，将肝细胞癌患者组的样本与对照组的样本分别按照1∶1的体积比例进行混合上样进行液相色谱-质谱检测； 

5、质谱数据处理和分析：质谱检测条件及后期数据处理均同实施例1。 

6、结果分析： 

为了进一步检验此实验方法在复杂生物样本的实际应用能力，本发明应用本方法进行了糖蛋白组学研究，比较正常人和肝癌患者血清中，不同的凝集素所对应的糖型所发生的改变，每份相对定量的混合标本，均进行4次重复检测。在 ConA、LCH和WGA这三种凝集素对应糖型的正常人和肝癌患者血清糖蛋白中，一共确定了有43种糖肽，35种糖蛋白发生了不同程度的改变，其中有14种糖肽和13种糖蛋白在多个凝集素层面发生了改变(表4)。所有确定的N连接糖肽都具有Asn-X-Thr/Ser(X不为P)的共有序列。 

表4：临床蛋白样本验证使用的3例肝癌患者和3例健康对照组血清中，由三种凝集素富集的发生改变和显著性改变的糖肽和糖蛋白数目。数值由Mascot Distiller计算得到，*为N糖基化位点。 

图7A-7C是一个有代表性的nano-LC-ESI-MS/MS谱图，是由ConA富集的血清糖肽中的一个糖基化的肽段，此肽源自蛋白complement C4-A，图7A是一个放大的MS谱图，这对双电荷的肽在m/z 553.30和556.30有相差3Da的单同位素峰，这表明3个¹⁸O标记及单糖基化。¹⁸O和¹⁶O标记肽显示出了典型的离子碎片的MS/MS谱图，在y8和y9离子之间有117Da的质量差，相当于天冬氨酸被一个¹⁸O标记后产生的质量差，这证实了这个位置的天冬酰胺的脱酰胺基作用。图7B和图7C的所有单电荷的y离子序列发生了4Da的质量差，证实C-端被两个¹⁸O所标记，而所有单电荷的b离子序列发生了2Da的质量差，证实一个¹⁸O标记在单糖基化位点(即Asn residue)，这证实了本发明的标记策略是可行的，标记结果是可靠的。 

为了进一步验证Mascot Distiller自动化定量结果的正确性，本发明从实际样品的结果中选择了4个糖肽进行了手工计算，发现它们手工计算的值和自动化定量的值非常接近(表5)，这证实了本发明的定量方案在复杂生物样品中依然可靠。 

表5：临床蛋白样本验证使用的3例肝癌患者和3例健康对照组血清中，对其中的4个糖肽的Mascot Distiller自定义算法的定量结果进行了手工计算的验证。两者的结果非常近似，这证明了自定义算法的准确性。*为N糖基化位点。 

在本发明的验证结果中，糖肽和糖蛋白在不同的凝集素所对应的糖型水平上，发生了不同程度甚至是相反的变化，在图8A-8B中本发明列出了多个在多种凝集素水平发生不同丰度变化的糖蛋白和糖肽，图8A为在ConA、LCH、WGA水平发生不同丰度变化的糖肽。图8B为在ConA、LCH、WGA水平发生不同丰度变化的糖蛋白。(*为N糖基化位点，正负号代表相对于健康对照组上升或下降，数值为百分比)对这些变化所对应的病理生理意义的进一步探讨，可能对于正确理解癌症的发生发展，具有重要的意义，如作为生物标志物，这种不同亚糖蛋白组的序列性改变，其本身可以较单一蛋白或糖蛋白水平的标志物更有特异性。而且，由于使用凝集素富集糖蛋白，将整个糖蛋白质组分成了更多的亚组进行研究，减低了样本的复杂度，使各个凝集素水平上能够辨认到的发生改变的蛋白总数，多于单纯的全糖蛋白质组研究，这对于更好的低丰度生物标志物的发现也具有一定的意义。 

在¹⁸O标记方法中，有一些标记方法可以得到自动化计算机软件的支持，但是对于较新的¹⁸O₃的标记方法，还缺乏这种支持，需要寻找一个精确的，可靠的，具有友好人机界面的配套自动化软件来完成定量的计算，这样才能进行实际复杂生物样本的研究，明确其糖链结构的变化情况，这也是之前的一些研究者所期望的。由于没有专用的配套软件，本发明曾应用一些可自定义的蛋白定量软件，如Trans-Proteomic Pipeline Ver.4.5(TPP，Seattle Proteome Center)中的自定义定量工具XPRESS及ASAP ratio进行了尝试，但是实验结果令人失望，XPRESS在标准蛋白中，对于含有¹⁸O₂标记的非糖肽可以给出线性的结果，而¹⁸O₃标记的糖肽(本发明实验的真正目标)却无法给出线性的结果，ASAP ratio的定量结果较XPRESS更差(见图9A和图9B)。最终本发明应用自建立的定量算法，无论在标准蛋白还是实际样本中均得到了满意的结果，这对于本发明的标记方法及其他各种¹⁸O₃标记方法在实际复杂生物样本中的应用，具有很好的推动作用。 

Claims (1)

1.一种糖蛋白组定量方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将来自不同疾病或者相同疾病不同阶段患者的血清样本分为两组，除去高丰度蛋白，测定蛋白浓度，取等蛋白量样本进行除盐和酶解；

第二步：将第一步所得的酶解产物进行凝集素亲和层析以得到相应的亚糖蛋白组，冻干；

第三步：分别以H₂ ¹⁸O和H₂ ¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合固化胰酶进行C端标记，冻干后,再分别以H₂ ¹⁸O和H₂ ¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合N-糖酰胺酶进行N糖基化位点标记，冻干；

第四步：将两组样本混合上样进行液相色谱-质谱检测，建立基于Mascot Distiller的自定义定量算法进行定量数据处理；所述的自定义定量算法采用的定量协议为前导扫描,所述的自定义定量算法中定义了三个独有修饰组来进行计算，A组定义为2个¹⁸O标记在C端及1个¹⁸O标记在N糖基化位点，B组定义为1个¹⁸O标记在C端及1个¹⁸O标记在N糖基化位点，C组定义为¹⁶O标记在上述位点，相对的丰度比值由以下公式计算得到：

    ratio(¹⁸O/¹⁶O)= (Group A + Group B)/Group C；

其中，ratio(¹⁸O/¹⁶O)代表¹⁸O标记的糖肽与¹⁶O标记糖肽的丰度比值，GroupA、Group B 和Group C分别代表A组、B组和C组的丰度。

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