CN103204900A

CN103204900A - 一种蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法

Info

Publication number: CN103204900A
Application number: CN2013100951360A
Authority: CN
Inventors: 周金慧; 李熠; 吴黎明; 赵静; 薛晓锋
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2013-07-17

Abstract

本发明涉及一种蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法，以键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠为吸附基体，与蜜蜂蜂毒进行混合以吸附其中的蛋白质，然后采用PBS缓冲溶液洗涤除去过量的高丰度蛋白质，最后用洗脱液将所述吸附基体上吸附的蛋白质进行洗脱得低丰度蛋白质富集后的洗脱液。本发明提供了一种高效、稳定、重复性好，特异性强的低丰度蛋白质富集方法，对于加强低丰度蛋白质的研究，探索蜂毒中更多过敏原的信息、以及开发我国传统中医药物，研究疾病诊断标志物和疾病发生机制等具有重要的意义。

Description

一种蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法

技术领域

本发明涉及蛋白质处理领域，具体涉及一种蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法。

背景技术

我国饲养的主要蜂种是生产能力极强的意大利蜜蜂，它具有极强的抗病能力和抗寒能力。蜂毒是由工蜂的毒腺和副腺分泌的一种液体，并储存在毒囊中。意大利蜜蜂蜂毒具有多种药理学活性和生物学活性，主要包括抗炎、降压、镇痛、抗病毒等作用，特别是对于治疗风湿、类风湿性关节炎、肩周炎、心血管疾病、肿瘤和多发性硬化等疾病具有较好的治疗效果（吉林科学技术出版社，2000，1-121）。为了能够全面了解蜂毒中所有低丰度蛋白质的相关信息，应尽可能多的提取全部蛋白质并避免蛋白质的丢失、减少杂质干扰，而且富集方法应具有良好的重现性。

近年来，蜂毒中高丰度蛋白质如蜂毒肽研究的较多，而蜂毒中更多种类的低丰度蛋白质及其类似物报道的较少。已有的蛋白质研究中主要集中于利用简单的沉淀蛋白质方法对研究对象中的全部蛋白质进行研究，但是由于没有去除高丰度蛋白质，造成了低丰度蛋白质被高丰度蛋白质掩盖，致使低丰度蛋白质被忽略而使其研究较少。

目前蛋白质提取方法主要包括超声波提取法、丙酮提取法和水溶液提取法。超声波提取法是将待分析物质置于超声波仪中，利用超声波的振动来提取或者沉淀其中所含的蛋白质，但是由于超声的温度、时间和频率不容易掌握，提取过程中容易造成蛋白质的变性和肽键的断裂。丙酮提取法是将待分析物质在0℃以下加入5-10倍量的冰丙酮（含β-巯基乙醇）同时迅速搅拌均匀，该方法沉淀的蛋白质不用经过脱盐处理，但是有机溶剂易使蛋白质或酶变性，而且使用大量的有机溶剂，对人体以及环境都有很大的毒害作用。由于大部分蛋白质或者多肽均易溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，所以水溶液提取法是常用的提取蛋白质方法，优点是蛋白质提取完全，损失少。

蜜蜂蜂毒中成分复杂，和其他生物组织相比，其蛋白质含量超过蜂毒干重的75%，而且分子量（2000Da-45000Da）覆盖范围较大。在已有的蜂毒中蛋白质富集方法研究中，常用的方法是凝胶过滤法和凝胶渗透层析法，只有通过多次利用不同规格型号的凝胶颗粒才能对不同分子量大小的蛋白质进行粗分离。这两种方法作为传统的蛋白质分离和净化方法其最大的缺点是分离过程繁琐，提取和净化过程中损失很多蛋白质导致蛋白质丢失，从而使一些具有特定生物学功能的蛋白质未被发现和研究；此外，繁琐的试验过程导致方法的重现性差，在实验室建立的方法很难应用于实际生产。这些都是传统的分离富集方法难以克服的技术困难。

发明内容

为了开发一种新型的蜜蜂蜂毒中蛋白质的富集方法，本发明的目的是提供一种蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法。

本发明提供的蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法为：以键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠为吸附基体，与蜜蜂蜂毒进行混合以吸附其中的蛋白质，然后采用PBS缓冲溶液洗涤以除去过量的高丰度蛋白质，最后用洗脱液将所述吸附基体上吸附的蛋白质进行洗脱得低丰度蛋白质富集后的洗脱液。

本发明技术方案利用了微珠固相萃取法，基于在多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒表面通过短的连接臂键合含有20种天然氨基酸的六肽配体作为吸附不同丰度蛋白质的吸附基体。当一个包含不同丰度蛋白质的复杂混合溶液与整个吸附基体的配基进行孵育时，每种蛋白质都可以至少与一个配体进行结合。在过量蛋白质混合物上样的情况下，高丰度蛋白质很快能与它们特异性结合的亲和配体达到饱和，过量部分在后续洗涤阶段被洗去。相反，低丰度蛋白可以继续浓缩在特异性结合的亲和配基上。经过吸附与洗涤处理之后，再用洗脱液将所有特异性结合的蛋白质从所述吸附基体上洗脱下来，形成丰度差别显著减少的蛋白质混合物，从而实现低丰度蛋白质的富集。

上述富集方法中，所述吸附基体和蜜蜂蜂毒的重量比为0.1～1∶1。

优选地，所述吸附基体和蜜蜂蜂毒的重量比为0.3～0.5∶1。

上述富集方法中，所述吸附基体与蜜蜂蜂毒进行混合前，依次用水和PBS缓冲溶液进行洗涤。

上述富集方法中，所述富集方法还包括：在洗脱步骤之前用水洗涤所述吸附基体以除去蛋白质中的盐。

上述富集方法中，所述洗脱步骤中用pH值为2.0～2.5的甲酸或乙酸溶液作为洗脱液；优选用0.1～0.5M的甲酸溶液作为洗脱液。

上述富集方法中，所述蜜蜂蜂毒为意大利蜜蜂的蜂毒。

本发明的富集方法优选包括以下步骤：

（1）将键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠依次用2～5倍重量的纯水和PBS缓冲溶液各洗涤1～3次；

（2）将蜜蜂蜂毒配制成0.5～1.5g/ml的水溶液，并与步骤（1）处理后的所述六肽配体微珠混合20～40min，离心后得吸附后的六肽配体微珠；

（3）将步骤（2）所得吸附后的六肽配体微珠依次用2～5倍重量的PBS缓冲溶液和纯水各洗涤1～3次；

（4）将洗脱液和步骤（3）所得六肽配体微珠混合进行洗脱，离心收集洗脱液得低丰度蛋白质富集后的洗脱液。

其中，步骤（4）中洗脱液的体积为所述微珠体积的1～2倍，重复3～6次，合并收集洗脱液得低丰度蛋白质富集后的洗脱液。

本发明技术方案具有以下特点：

1、首先在吸附蜂毒之前将键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠用水进行洗涤，其中，水洗可以保证六肽配体微珠得到充分的溶胀，防止微珠填料干涸导致吸附能力的下降甚至丧失，为进一步保证溶胀效果，水的体积应为能完全浸没微珠填料。水洗后的微珠填料能得到充分溶胀，每毫克微珠填料至少能吸附0.5mg的蛋白质，最大程度地提高了吸附效率。

2、本发明技术方案根据蜜蜂蜂毒中蛋白质的特点，选用PBS缓冲溶液作为洗涤溶液，PBS缓冲溶液可以有效洗掉吸附基体中具有一定离子强度的杂质，并且不易使蛋白质发生变性。为进一步去除杂质，洗脱之前使用水对吸附基体进行洗涤以除去可能引入的盐类物质和部分杂质。本发明技术方案选用特定pH值的有机酸（主要是甲酸和乙酸）溶液作为洗脱溶液，能最大限度地使结合键断裂，从而可以有效从吸附基上解离已经吸附的蛋白质，并且不会引入其它影响后续试验的离子，如氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子、钠离子和钾离子等。

本发明技术方案利用键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠作为填料可特异性的吸附蛋白质，富集并浓缩低丰度蛋白质，然后采用常规的双向电泳方法和高分辨质谱法即可对蜜蜂蜂毒中的低丰度蛋白质进行分离和鉴定。采用该方法相对于传统的蛋白质沉淀技术、分子排阻色谱技术等具有更高的特异性，同时低丰度蛋白质损失率也较低。采用本发明的富集方法处理之后，后续能够鉴定出多个低丰度的蛋白质或其结构类似物，这些物质在常规富集方法处理后的分析过程中没有被检出或仅有个别被检出。

综上所述，本发明提供了一种操作简单、高效、稳定、重复性好，特异性强的低丰度蛋白质富集方法，对于加强低丰度蛋白质的研究，探索蜂毒中更多过敏原的信息，以及开发我国传统中医药物，研究疾病诊断标志物和疾病发生机制等具有重要的意义。

附图说明

图1是未经富集处理的粗蜂毒的双向电泳图谱；

图2是经实施例1富集处理的蜂毒的双向电泳图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明实施方式使用的PBS缓冲溶液具有以下组成：0.8g NaCl、0.02g KCl、0.36g Na₂HPO₄·12H₂O、0.03g KH₂PO₄，溶于80ml纯水中，用稀酸（如稀盐酸等）调pH值至7.4，加纯水定容至100mL。

本发明实施方式使用的洗脱溶液为0.15M的甲酸溶液，现用现配。

本发明实施方式使用的键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠为美国伯乐太平洋公司（Bio-Rad Pacific Ltd）生产的ProteoMiner Dry Bulk Beads（型号：Catalog#163-3012）。

实施例1意大利蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集

1、在注射器内将500mg键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠与2.0mL纯水浸泡5min，然后在振荡器上混合1min，离心2min，弃掉流出液，重复上述操作1次。

2、加2.0mL PBS缓冲溶液置于上述注射器中，振荡1min，离心2min，弃掉流出液，重复上述操作1次。

3、准确称取1.0g意大利蜜蜂的蜂毒样品置于2.5mL的离心管中，加入1.0mL纯水，涡动使其完全溶解，然后在4℃、10000rpm下高速离心5min，取上清液。

4、将样品上清液置于含有六肽配体微珠的上述注射器中浸泡混合30min，每隔5min在振荡器混合1min，使样品上清液与微珠充分接触，离心2min，弃掉流出液。

5、加2.0mL PBS缓冲溶液置于上述注射器中，振荡5min，离心2min，弃掉流出液，重复离心1次。重复该步骤2次。

6、加2.0mL纯水置于上述注射器中，振荡5min，离心2min，弃掉流出液，重复离心1次。

7、加500μL洗脱溶液溶液至上述注射器中，涡动1min，3000rpm离心5min，收集洗脱液，重复操作该步骤5次，合并收集的洗脱液中含有富集后的蛋白质。

8、将合并的洗脱液贮存于-20℃中。

使用考马斯亮蓝法定量蜂毒中的全部蛋白质以及富集纯化后的全部蛋白质含量，结果显示未经纯化的蜂毒中蛋白质浓度为66.13mg/mL，富集后蜂毒中的蛋白质浓度为1.61mg/mL，由此可以得出采用上述方法已经除去大部分的高丰度蛋白质。

使用双向电泳（谱图如图1、2所示）将富集后的蛋白质在凝胶上进行分离、液相色谱-线性离子肼质谱质谱（LC-LTQ）鉴定和SEQUEST数据库搜索。

从图1、2中可以看到，富集前双向电泳图（图1）中蛋白质点模糊不清，某些低丰度蛋白质可能被高丰度蛋白质点覆盖，从而导致后续分析过程中某些种类的蛋白质不能被检出；经本发明方法富集后，双向电泳图（图2）中蛋白质点清晰看见，便于挖取和后续分析。

通过上述富集过程处理之后，后续鉴定出34个低丰度蛋白质或其结构类似物（gi编号依次157833543、58585172、24418862、16904372、40191003、167325503、144962849、215408593、158476969、158474668、146400061、68150168、5627、94471622、60115688、94471624、126324824、15988108、15988107、15988109、58585182、585279、145579744、155680、110758297、1703332、58585166、999102、229231、224994817、224383703、270006983、154347368、114153140），其中包括19种磷脂酶A2的结构类似物、7种透明质酸酶及其前体和透明质酸酶的高级结构、4种蜂毒明肽的前体和类似物、3种免疫球蛋白E结合蜂毒蛋白或其类似物和1种蜂毒原肽相关的肽类物质，这些低丰度蛋白质在常规富集方法处理的过程中没有被检出或仅有个别被检出（可参见如1）、CN92114271.4；2）、Z.F.Ziyavitdinov,U.K.Inogamov,N.Zh.Sagdiev and Sh.I.Salikhov.Development of amethod for the complex isolation of physiologically active componentsfrom bee venom.Chem.Nat.Compd.31(1995)726-730；3）、Peiren N,Vanrobaeys F,de Graaf DC,Devreese B,Van Beeumen J,Jacobs F.Theprotein composition of honeybee venom reconsidered by a proteomicapproach.Biochim Biophys Acta.2005,31;1752(1):1-5；4）、PacákováV.,

K.,Pham Thi Hau,Jelínek I.,

I.,

D.,Comparisonof high-performance liquid chromatography and capillaryelectrophoresis for the determination of some bee venom components,J.Chromatogr.A700(1995)187-193等）。

实施例2

1、在注射器内将300mg键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠与1.0mL纯水浸泡5min，然后在振荡器上混合1min，离心2min，弃掉流出液，重复上述操作1次。

2、加1.0mL PBS缓冲溶液置于上述注射器中，振荡1min，离心2min，弃掉流出液，重复上述操作1次。

4、将样品上清液置于含有六肽配体微珠的上述注射器中浸泡混合25min，每隔5min在振荡器混合1min，使样品上清液与微珠充分接触，离心2min，弃掉流出液。

5、加1.0mL PBS溶液置于上述注射器中，振荡5min，离心2min，弃掉流出液，重复离心1次，重复该步骤2次。

6、加1.0mL纯水置于上述注射器中，振荡5min，离心2min，弃掉流出液，重复离心1次。

7、加300μL洗脱溶液至上述注射器中，涡动1min，3000rpm离心5min，收集洗脱液，重复操作该步骤5次，合并收集的洗脱液中含有所需要的蛋白质。

8、将合并的洗脱液贮存于-20℃中。

实施例3

1、在注射器内将500mg键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠与2.5mL纯水浸泡5min，然后在振荡器上混合3min，离心5min，弃掉流出液，重复上述操作1次。

2、加2.0mL PBS缓冲溶液置于上述注射器中，振荡3min，离心5min，弃掉流出液，重复上述操作1次。

3、准确称取1.0g意大利蜜蜂的蜂毒样品置于2.5mL的离心管中，加入2.0mL纯水，涡动使其完全溶解，然后在4℃、10000rpm下高速离心5min，取上清液。

4、将样品上清液置于含有六肽配体微珠的上述注射器中浸泡混合40min，每隔5min在振荡器混合1min，使样品上清液与微珠充分接触，离心2min，弃掉流出液。

5、加2.0mL PBS溶液置于上述注射器中，振荡5min，离心5min，弃掉流出液，重复离心1次，重复该步骤2次。

6、加2.0mL纯水置于上述注射器中，振荡5min，离心5min，弃掉流出液，重复离心1次。

7、加500μL洗脱溶液至上述注射器中，涡动5min，3000rpm离心5min，收集洗脱液，重复操作该步骤3次，合并收集的洗脱液中含有所需要的蛋白质。

8、将所得洗脱液贮存于-20℃中。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法，其特征在于，以键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠为吸附基体，与蜜蜂蜂毒进行混合以吸附其中的蛋白质，然后采用PBS缓冲溶液洗涤以除去过量的高丰度蛋白质，最后用洗脱液将所述吸附基体上吸附的蛋白质进行洗脱得低丰度蛋白质富集后的洗脱液。

2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述吸附基体和蜜蜂蜂毒的重量比为0.1～1∶1。

3.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，所述吸附基体和蜜蜂蜂毒的重量比为0.3～0.5∶1。

4.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述吸附基体与蜜蜂蜂毒进行混合前，依次用水和PBS缓冲溶液进行洗涤。

5.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述富集方法还包括：在洗脱步骤之前用水洗涤所述吸附基体以除去蛋白质中的盐。

6.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述洗脱步骤中用pH值为2.0～2.5的甲酸或乙酸溶液作为洗脱液；优选用0.1～0.5M的甲酸溶液作为洗脱液。

7.根据权利要求1-6任一项所述的富集方法，其特征在于，所述蜜蜂蜂毒为意大利蜜蜂的蜂毒。

8.根据权利要求1-7任一项所述的富集方法，其特征在于，所述富集方法包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的富集方法，其特征在于，步骤（4）中洗脱液的体积为所述六肽配体微珠体积的1～2倍，重复3～6次，合并收集洗脱液得低丰度蛋白质富集后的洗脱液。