CN110850105A - 一种胰岛素及其类似物o-糖基化位点的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种胰岛素及其类似物O‑糖基化位点的鉴定方法。首先对胰岛素及其类似物进行弹性蛋白酶酶切，通过LC‑MS分析肽图谱，初步确定相应的糖基化肽段；然后对糖基化关键肽段进行Q‑TOF‑MS/MS分析，通过优化关键肽段的CID质谱碎裂能量，得到关键的带糖的碎片离子，从而更准确和简便的分析O糖基化位点。本发明在常规CID碎裂技术下即可实现复杂肽段的糖基化位点分析和确认，操作简单，准确度高，实用性强，经济，适用于所有带有CID碎裂技术的质谱仪，为糖基化类的翻译后修饰分析以及在蛋白质组学中的应用提供了一种新的思路。

Description

一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法。
背景技术
重组人胰岛素及其类似物是治疗糖尿病不可替代的产品，但在生物制药大规模生产重组产品的过程中，通常会导致蛋白质的翻译后修饰。胰岛素类似物一般用酵母表达系统，在表达的过程中会形成比较常见的O-糖基化修饰。在工艺开发过程中要尽可能的降低O-糖基化修饰的比例，并对O-糖基化的杂质进行结构鉴定。O糖基化修饰一般发生在苏氨酸(T)或者丝氨酸(S)上，胰岛素类产品的氨基酸序列中含有较多的T和S，而O-糖基化位点的鉴定是一个比较大的难题。质谱碎裂方式对于完整O糖肽的鉴定极为重要，直接决定了O-糖基化位点鉴定的成功与否。通常串联质谱中最常用的碎裂技术是CID(collision-induceddissociation)和HCD(higher energy collision dissociation)，其基于碰撞能量再分配的基本原理，碎裂肽段中的肽键，产生b、y类型的碎片离子，在肽段序列鉴定中具有很大优势。然而，由于糖苷键键能小于肽键，糖基化修饰在CID及HCD碎裂中极易断裂，很难得到含有糖链的碎片离子，因此较难从二级谱图中找到关于多肽糖基化位点的肽段来确定糖基化的位点。电子捕获解离/电子转移解离(ECD/ETD)一般只断裂多肽的骨架，产生c/z离子，与此同时糖链基本保持稳定不断裂，是分析糖基化位点较为便利的手段。VivekanandanKannan等(Vivekanandan Kannan,et al，A tandem mass spectrometric approach tothe identification of O-glycosylated glargine glycoforms in activepharmaceutical ingredient expressed in Pichia pastoris，Rapid Commun.MassSpectrom，2009，23:1035-1042)利用ESI-MS确定了糖基化杂质的分子量，再通过Glu-C对相应的杂质进行还原肽图谱分析，经LC-MS连用确定糖基化发生的肽段(A5-A17)，收集糖基化肽段进行MALDI-TOF/TOF MS/MS分析以及ETD碎裂技术证明O糖基化发生在T8位的苏氨酸上。Nagaraj Govindappa等(Nagaraj Govindappa,et al，PMT1gene plays a major rolein O-mannosylation of insulin precursor in Pichia pastoris，Protein Expressionand Purification，2013，88：164-171)通过制备纯化得到重组人胰岛素的单糖基化和双糖基化的杂质，利用ESI-MS得到相应的分子量，再通过Glu-C对相应的杂质进行还原肽图谱分析，经LC-MS连用确定糖基化发生的肽段(A5-A17)，最后通过ETD碎裂技术对该肽段进行MS/MS分析，证明O糖基化发生在T8位的苏氨酸上。两者均是通过ETD碎裂的方式进行MS/MS分析最终得到O糖基化位点。但ETD技术虽然也可以用于糖基化位点的鉴定，但该技术还不是太稳定，应用也没有CID广泛，对于氨基酸个数较多的肽段需要得到比较全的c/z离子，目前只有thermo公司的orbitrap fusion和waters公司的Synapt G2-S Q-TOF可配备ETD模块，ECD只能在傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)中才能使用，但这两款质谱价格都相当昂贵，价格在500万以上，且购买量相对较少，一般的制药公司或者外包机构都没有这种类型的质谱。而仅仅通过常规的酶切方法，如V8酶酶切肽图，通过LC-MS分析仅能大致确定糖基化在哪个肽段上面，对相关的糖基化肽段进行Q-TOF-MS/MS分析时，因糖基化肽段含有多个潜在的位点且糖苷键容易断裂，所以不能确证糖基化的具体位点。
基于上述传统的质谱碎裂方法如碰撞碎裂(CID)会优先碎裂糖链，产生较少的肽段骨架，ECD和ETD的碎裂方式成本又较昂贵，仅仅采用常规的酶切技术无法确证具体的糖基化位点，因此，急需开发一种准确度高、操作简单、成本低和新型的胰岛素及其类似物产品中O糖基化位点鉴定的方法。
发明内容
本发明提供了一种胰岛素及其类似物产品中O-糖基化位点的鉴定方法，所述方法采用弹性蛋白酶对胰岛素及其类似物进行酶切，通过LC-MS分析肽图谱，初步确定产生O-糖基化的糖基化肽段；然后对糖基化关键肽段进行Q-TOF-MS/MS分析，通过优化关键肽段的CID质谱碎裂能量，得到了关键的带糖的碎片离子，从而更准确和简便的分析O糖基化位点。通过本申请的技术方案，在常规CID碎裂技术下即可实现复杂肽段的糖基化位点分析和确认，操作简单，准确度高，实用性强，经济，适用于所有带有CID碎裂技术的质谱仪，为糖基化类的翻译后修饰分析以及在蛋白质组学中的应用提供了一种新的思路。
本发明的上述技术目的是通过下述技术方案实现：
本发明提供一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)用弹性蛋白酶酶切样品；
(2)通过LC-MS分析肽图谱，确定相应的糖基化肽段；
(3)对糖基化关键肽段进行Q-TOF-MS/MS分析，确证糖基化的位点。
在本发明一些实施方案中，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:20，弹性蛋白酶酶切温度为37±0.5℃，酶切时间为0.5～3h。
在本发明的一些实施方案中，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:20；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:15；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:11～1:13。
在本发明的一些实施方案中，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切温度为37±0.5℃。
在本发明的一些实施方案中，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切时间为0.5～3h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为0.5～3h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为1～1.5h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为1h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为1.5h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为2h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为3h。
在本发明的一些实施方案中，步骤(3)所述的Q-TOF-MS/MS分析采用的是碰撞诱导解离CID的碎裂方式。
在本发明的一些实施方案中，在采用步骤(3)所述的Q-TOF-MS/MS对糖基化样品的关键肽段进行分析时，CID碰撞能量的大小是6～35；在一些实施方案中，碰撞能量的大小是8～30；在一些实施方案中，碰撞能量的大小是10～28；在一些实施方案中，碰撞能量的大小是10；在另一些实施方案中，碰撞能量的大小是12；在又一些实施方案中，碰撞能量的大小是27.6。
在本发明的一些实施方案中，步骤(3)所述的Q-TOF-MS/MS分析采用的色谱条件：色谱柱信息：welch C18，4.6mm×250mm，5μm(编号：20121108)；进样体积：20μl；波长：214nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；紫外检测器后分流进质谱仪；0～4min：to waste；4～50min：to MS；后运行时间：12min；采用梯度洗脱：洗脱时间0～50min，流动相A(0.1％甲酸水溶液)30％～98％，流动相B(乙腈2％～70％)。
在本发明的一些实施方案中，步骤(3)所述的Q-TOF-MS/MS分析采用的质谱条件：正ESI模式，毛细管电压：4000V；雾化气体：45psi；干燥气体：12ml/min；干燥温度：350℃；碎裂电压：175V；扫描范围：350～3200m/z；扫描速率2.00spectra/sec。
在本发明的一些实施方案中，所述的胰岛素及其类似物包含但不限于重组人胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素等结构类似的胰岛素类似物。
糖基化样品可以经过烷基化，也可以不经过烷基化，均可通过本发明的技术方案确定糖基化的位点。
本发明所述的“V8酶”是指丝氨酸蛋白酶，特异水解天门冬氨酸和谷氨酸残基羧基侧肽和酯键，用于蛋白质结构和序列分析(用于胰岛素肽图分析)。本发明中所述的V8酶指Glu C酶。
本发明所述的“弹性蛋白酶(Elastase)”也是指一种丝氨酸蛋白酶，优先酶切丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸的的羧基端。该酶可以单独使用或者其他蛋白酶一起使用，用于蛋白质组学分析。
本发明所述的“流动相”是色谱过程中携带待测组分向前移动的物质称为流动相。与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
1)本发明的分析方法相比传统的直接采用CID碎裂的方式处理样品，采用弹性蛋白酶酶切样品可得到关键酶切肽段；
2)本发明的分析方法可适用于所有带有CID碎裂技术的质谱仪；
3)本发明的分析方法准确度高，操作简单，经济适用。
附图说明
图1胰岛素糖基化杂质制备图
图2糖基化杂质纯度检测色谱图
图3重组人胰岛素标准品、胰岛素糖基化杂质还原后Glu C酶解的TIC图谱
图4GluC酶解糖基化肽段MS/MS分析图
图5重组人胰岛素标准品、糖基化杂质Elastase酶切TIC图谱
图6糖基化肽段CTSIC的MS/MS图谱
图7糖基化杂质Elastase蛋白酶酶切还原肽图谱酶切时间优化TIC图谱
图8糖基化关键肽段CID能量优化MS/MS图谱
图9重组甘精胰岛素标准品、糖基化杂质Elastase酶切TIC图谱
图10重组门冬胰岛素标准品、糖基化杂质Elastase酶切TIC图谱
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本说明书实施例中的溶液配制条件如下：
溶液配制：
0.1％三氟乙酸水溶液：量取三氟醋酸1ml，加水稀释至1000ml，混匀即得。
0.1％甲酸水溶液：量取甲酸1ml，加水稀释至1000ml，混匀即得。
0.1％甲酸乙腈溶液：量取乙腈1000ml，加甲酸1ml，混匀即得。
0.01mol/L HCl溶液：量取盐酸0.9ml，加水稀释至1000ml，过膜即得。
硫酸铵溶液：称取硫酸铵13.2g，加水至50ml，摇匀；
硫酸溶液：量取浓硫酸1.4ml加入到水40ml中，待硫酸溶液冷却后用水定容至50ml；
硫酸盐缓冲液：取上述硫酸铵溶液和硫酸溶液等体积混合，调节pH至2.0后即得。
羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液：称取HEPES 2.38g于100ml容量瓶中，加水90ml溶解，用5mol/L氢氧化钠调节pH值至7.5，然后定容到刻度，摇匀即得。
50mmol/L Tris-HCl pH9.0缓冲液：称取tris 6.5081g加入950ml超纯水溶解，用HCl调pH至9.0，用超纯水定容至1L，然后用0.45μm的水系滤膜过滤即得。
500UN/ml V8酶：根据V8酶包装的标示量加入适量超纯水，溶解混匀，制成500UN/mlV8酶溶液。
Elastase酶：准确称取Elastase冻干粉1mg，加入200μl超纯水溶解，得到浓度为5μg/μl的Elastase酶溶液。
胰岛素糖基化杂质制备：将胰岛素糖基化杂质粗品溶解于0.01mol/L HCl中，用反相色谱法收集制备样品，如图1所示。收集图中的1号峰，将收集到的溶液用氮气浓缩吹干后，用0.01mol/L HCl溶解，进行液相检测。色谱条件如下：色谱柱信息：welch C18，4.6mm×250mm，5μm(编号：20121108)；进样体积：50μl；波长：214nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；后运行时间：10min；采用梯度洗脱方式：洗脱时间(0～30min)，流动相A(0.1％三氟乙酸)40％～70％，流动相B(乙腈)30％～60％。
糖基化杂质纯度检测：氮气浓缩吹干后用0.01mol/L HCl溶解，溶解后的样品进液相检测纯度，如图2所示，经制备后的糖基化杂质纯度大于99％，糖基化杂质分子量为5970，比胰岛素多162，所以为单糖基化。
对比实施例
(1)样品采用常规V8酶酶切进行O糖基化位点的分析
重组人胰岛素标准品还原Glu C酶解肽图谱溶液：取重组人胰岛素标准品适量加0.01mol/L HCl溶液，使配制成2mg/ml，取该溶液50μl于EP管中，加DTT至终浓度20mmol/L，40℃还原2h，然后取还原后的溶液25μl于EP管中，再加HEPES缓冲液(pH7.5)100μl，500UN/ml V8酶溶液20μl，混匀后置37℃水浴中3小时后，加硫酸盐缓冲液(pH2.0)145μl，混匀终止酶切即得；
胰岛素糖基化杂质Glu C酶解还原肽图谱溶液：取制备好的胰岛素糖基化杂质50μl，然后按重组人胰岛素标准品还原Glu C酶解肽图谱溶液制备方法制备胰岛素糖基化杂质Glu C酶解还原肽图谱溶液；
色谱条件：色谱柱信息：welch C18，4.6mm×250mm，5μm(编号：20121108)；进样体积：20μl；波长：214nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min，紫外检测器后分流进质谱仪；0～3.5min：to waste；3.5～50min：to MS；后运行时间：12min；采用梯度洗脱：流动相A(0.1％三氟乙酸水溶液)65％～83％，流动相B(纯乙腈溶液)17％～45％，洗脱时间0～45min。
质谱条件：正ESI模式；Capillary voltage：4000；Nebulizer gas：45psi；Drygas：12ml/min；Dry temperature：350℃；Fragmentor：175V；MS扫描范围：350～3200(m/z)；MS Scan Rate(spectra/sec)1.00；MS/MS Scan Rate(spectra/sec)2.00；
表1还原肽图谱Target MS/MS条件
Figure BDA0002159353150000061
表2重组人胰岛素标准品还原Glu C酶解肽图谱理论序列及分子量
Figure BDA0002159353150000062
重组人胰岛素标准品、胰岛素糖基化杂质还原后Glu C酶解的TIC图谱见图3，由图3可知糖基化发生在A5-A17的肽段上，由于分子量增加162Da，所以为单糖基化(糖基化杂质完整分子量为5970Da，比胰岛素5808Da多162Da)，肽段A5-A17上有三个糖基化位点，确定糖基化位点需要进行进一步的分析。
表3重组人胰岛素标准品、胰岛素糖基化杂质还原Glu C酶解结果
Figure BDA0002159353150000063
Figure BDA0002159353150000071
糖基化发生在A5-A17的肽段上，但A8、A9、A12都有可能形成糖基化，为了确定糖基化位点，对糖基化的肽段1651.67(QCCTSICSLYQLE+G带两个电荷的质荷比为826.8474)进行了MS/MS分析，结果见图4(以不带糖的序列标b、y离子)。
在MS/MS图谱中有看到798.3025(b6+G)的碎片，且没有SLYQLE+G(m/z 914.38)的碎片说明糖基化位点在A8或者A9上(重复实验，结果一致)，但不能确定具体的位点，因此仅通过传统的酶切后，进行CID MS/MS分析无法确定这种富含O糖基化位点样品的糖基化位点。
(2)样品用弹性蛋白酶酶切方法分析O糖基化位点
为了确证糖基化位点，我们使用Elastase酶解法进行肽图谱检测。该方法可以将不同的糖基化位点酶切开，使糖基化肽段进一步变短，然后对其进行MS/MS分析，通过获得丰度较高的带糖的离子来确证糖基化具体修饰位点。
重组人胰岛素标准品还原Elastase酶解肽图谱溶液：取重组人胰岛素标准品适量加0.01mol/L HCl溶液，使配制成2mg/ml，取该溶液100μl于EP管中，加DTT至终浓度20mmol/L，40℃还原2h，然后取还原后的溶液75μl于EP管中，再加50mM Tris-HCL缓冲液(pH9.0)300μl，加入Elastase酶溶液3μl(15μg)，混匀后置37℃中水浴反应，于1.5h取样100μl，取出来的酶解液加10％formic acid使其终浓度为0.5％，混匀终止酶切。
胰岛素糖基化杂质还原Elastase酶解肽图谱溶液：取制备好的胰岛素糖基化杂质100μl，然后按重组人胰岛素标准品还原Elastase酶解肽图谱溶液制备方法制备胰岛素糖基化杂质还原肽图谱溶液。
色谱条件：色谱柱信息：welch C18，4.6mm×250mm，5μm(编号：20121108)；进样体积：20μl；波长：214nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；紫外检测器后分流进质谱仪；0～4min：to waste；4～50min：to MS；后运行时间：12min；采用梯度洗脱：洗脱时间0～50min，流动相A(0.1％甲酸水溶液)30％～98％，流动相B(乙腈)2％～70％。
质谱条件：正ESI模式，毛细管电压：4000V；雾化气体：45psi；干燥气体：12ml/min；干燥温度：350℃；碎裂电压：175V；扫描范围：350～3200m/z；MS扫描速率1.00spectra/sec；Target MS/MS扫描速率2.00spectra/sec。
还原肽图谱Target MS/MS条件：
Figure BDA0002159353150000072
重组人胰岛素糖基化杂质、重组人胰岛素标准品还原后Elastase酶切TIC图谱见图5所示。通过分子特征查找提取化合物以及bioconfirm nonspecific的酶切匹配来分析实验结果。
表4重组人胰岛素标准品和糖基化杂质Elastase酶切还原肽图谱糖基化相关肽段对比
Figure BDA0002159353150000081
a All mono isotopic masses reported as(M+H)+Da.
bThe sequence were confirmed by Auto MS/MS and Target MS/MS
通过对比重组人胰岛素糖基化杂质、重组人胰岛素标准品还原后的Elastase酶解图谱，在糖基化杂质的TIC图谱中找到m/z 482.2351、m/z 585.2433、m/z 688.2518分别为TSI、CTSI或者TSIC、CTSIC或者CCTSI糖基化相关的肽段，其中m/z 688.2518的丰度最高，为了确定糖基化位点，对重组人胰岛素糖基化杂质中的糖基化肽段进行了Target MS/MS分析并且优化碰撞能量，经Target MS/MS鉴定知m/z 688.2518为CTSIC糖基化肽段，由于CTSIC糖基化肽段丰度最高且其他肽段均来源于该肽段，以它的MS/MS数据为例来证明糖基化位点。
糖基化肽段CTSIC(m/z 688.2518)上可能发生糖基化的位点有A8的苏氨酸(T)和A9的丝氨酸(S)，其MS/MS图谱及匹配到的离子列表如图6所示。
结果表明，糖基化在A8位上的b2(m/z 367.1163)，b3(m/z 454.1457)，b4(m/z567.2312)离子丰度较高，而未找到y3+G(m/z 484.1919)的离子，只能找到没有糖基化的y3(m/z322.1419)，说明糖基化不在A9上。综上，进一步证明糖基化修饰位点在A8位的苏氨酸上。
实施例1 Elastase酶还原肽图谱酶切处理时间考察
弹性蛋白酶是丝氨酸类蛋白酶，优先酶切丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的C末端。通过弹性蛋白酶酶切重组人胰岛素理论上可以得到肽段EQCCTS(A3-A9)，但通过预实验结果知没有得到理论上的肽段EQCCTS，可能是由于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸的二肽衍生物为Elastase有效的竞争性抑制剂。
文献有报到Elastase有多个活性中心，可以切很多的位点，只是优先切丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的C末端且Elastase除了具有消解弹性蛋白的活性，还有水解蛋白质的活性。
为了使后续质谱分析能够得到关键碎片离子峰，须在酶切时得到关键糖基化肽段(如理论酶切肽段EQCCTS(A3-A9)或者实际得到的肽段CTSIC(A7-A11))，通过不断摸索酶切条件，最终得到了能够达到目的的关键酶切参数：弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:20，弹性蛋白酶酶切温度为37±0.5℃，酶切时间为0.5～3h。
我们优化了Elastase酶还原肽图谱的酶切时间，分别于0.5h、1h、1.5h、2h、3h、24h取样终止酶切，得到的TIC图谱通过分子特征查找提取化合物以及bioconfirmnonspecific的酶切匹配来分析实验结果。
色谱条件：色谱柱信息：welch C18，4.6mm×250mm，5μm(编号：20121108)；进样体积：20μl；波长：214nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；紫外检测器后分流进质谱仪；0～4min：to waste；4～50min：to MS；后运行时间：12min；采用梯度洗脱：洗脱时间0～50min，流动相A(0.1％甲酸水溶液)30％～98％，流动相B(乙腈2％～70％)。
质谱条件：正ESI模式，毛细管电压：4000V；雾化气体：45psi；干燥气体：12ml/min；干燥温度：350℃；碎裂电压：175V；扫描范围：350～3200m/z；MS扫描速率1.00spectra/sec；重组人胰岛素糖基化杂质还原后Elastase酶切不同时间TIC图谱见图7所示，不同的酶切时间所对应的关键糖基化肽段TIC图的峰高或相应见表5。
表5不同酶切时间所对应的关键糖基化肽段TIC图的峰高
Figure BDA0002159353150000091
备注：基线噪音3*106
由表5和图7结果知，糖基化的关键肽段CTSIC+G(A7-A11)在酶切时间低于1h(0.5h)时，肽段的丰度或响应值相对较低，在酶切时间达到3h及以上时，会完全消失，而在酶切时间为2h时，该肽段的丰度也相对较低，所以选择酶切时间在1～1.5h，酶切效果较好，可以得到较高丰度的关键糖基化肽段，有利于对该肽段进行CID MS/MS分析来鉴定相应的糖基化位点。
实施例2 Q-TOF-MS/MS CID碎裂能量优化
对糖基化杂质Elastase酶切还原肽图谱中糖基化的关键肽段进行MS/MS分析，以m/z688.2518的肽段(CTSIC糖基化)为母离子，对该肽段CID的碎裂能量进行了优化。实验时发现在进行MS/MS分析时，当能量太低时，得不到想要的目标碎片，而当能量太高时，因糖在CID碎裂的过程中容易断裂，也得不到目标的碎片离子。
色谱条件：色谱柱信息：welch C18，4.6mm×250mm，5μm(编号：20121108)；进样体积：20μl；波长：214nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；紫外检测器后分流进质谱仪；0～4min：to waste；4～50min：to MS；后运行时间：12min；采用梯度洗脱：洗脱时间0～50min，流动相A(0.1％甲酸水溶液)30％～98％，流动相B(乙腈)2％～70％。
质谱条件：正ESI模式，毛细管电压：4000V；雾化气体：45psi；干燥气体：12ml/min；干燥温度：350℃；碎裂电压：175V；扫描范围：350～3200m/z；MS扫描速率2.00spectra/sec。
分别选择CID能量为6、10、12、27.6、35来对m/z 688.2518的肽段(CTSIC糖基化)进行MS/MS分析，确证糖基化在A8位T上的关键碎片离子为b2(367.1163)。由实验结果图8知，能量较低时，碎片离子很少；能量越高母离子的量越少，母离子掉糖的峰越高。当能量为6时基本看不到碎片离子；当能量为10时，既存在一定的母离子，也能找到相应的关键碎片离子；当能量为27.6时，已经完全看不到母离子，但能找到相应的关键碎片离子；当能量高于35时能得到相应的关键碎片离子，但丰度较低。因此，在6-35的能量范围内都是可以确证该糖基化位点的。但为了保证鉴定结果的准确性，关键碎片离子b2(367.1163)的丰度在500以上时，结果的可靠性较高，因此选择能量10-28之间较优。
表6不同的碰撞能量所对应的关键碎片离子的丰度大小
Figure BDA0002159353150000101
实施例3 重组甘精胰岛素糖基化杂质糖基化位点确证
通过Elastase酶解法来对重组甘精胰岛素(分子量6063Da)原料药中的糖基化杂质(6225Da)进行糖基化位点确证。
通过对比甘精胰岛素糖基化杂质和甘精胰岛素标准品还原后的Elastase酶解图谱，在糖基化杂质的TIC图谱中找到m/z 688.2532的糖基化肽段丰度较高，可能为CTSIC或者CCTSI糖基化的肽段，而在甘精标准品的图谱中未找到相应的糖基化肽段峰，为了确定糖基化位点，对该糖基化肽段进行了Target MS/MS分析，经Target MS/MS鉴定知m/z688.2532为CTSIC糖基化肽段且糖基化位点在A8位苏氨酸上。
实施例4 重组门冬岛素糖基化杂质糖基化位点确证
通过Elastase酶解法来对重组门冬胰岛素(分子量5826Da)原料药中的糖基化杂质(5988Da)进行糖基化位点确证。
通过对比门冬岛素糖基化杂质和门冬岛素标准品还原后的Elastase酶解图谱，在糖基化杂质的TIC图谱中找到m/z 688.2532的糖基化肽段丰度较高，可能为CTSIC或者CCTSI糖基化的肽段，而在门冬标准品的图谱中未找到相应的糖基化肽段峰，为了确定糖基化位点，对该糖基化肽段进行了Target MS/MS分析，经Target MS/MS鉴定知m/z 688.2532为CTSIC糖基化肽段且糖基化位点在A8位苏氨酸上。
结论：综上，通过采用弹性蛋白酶酶切适当时间，再结合LC-MS和Q-TOF-MS/MS分析，并优化CID碎裂能量，可以简便快速准确的确认出胰岛素及其类似物O糖基化杂质的糖基化位点。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用弹性蛋白酶酶切样品；
(2)通过LC-MS分析肽图谱，确定相应的糖基化肽段；
(3)对糖基化关键肽段进行Q-TOF-MS/MS分析，确证糖基化的位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:20。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:15。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切时间为0.5～3h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切时间为1～1.5h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切温度为37±0.5℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的Q-TOF-MS/MS分析采用的碎裂方式是碰撞诱导解离CID。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的CID碎裂方式的碰撞能量的大小是6～35。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的CID碎裂方式的碰撞能量的大小是8～30。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Q-TOF-MS/MS质谱条件为：正ESI模式，毛细管电压：4000V；雾化气体：45psi；干燥气体：12ml/min；干燥温度：350℃；碎裂电压：175V；扫描范围：350～3200m/z；扫描速率2.00spectra/sec。
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