CN108508125B - 一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法，该方法在保持活性状态下对蛋白质进行体外共价化学标记，通过蛋白质上特定氨基酸位点在与小分子相互作用前后标记效率的差异情况，判断小分子与蛋白质相互作用的位点和强度。本发明能对蛋白质抑制剂候选小分子进行高通量筛选和对特定小分子的潜在蛋白质靶点进行规模化鉴定分析。通过对儿茶酚甲基转移化酶(Catechol‑O‑methyltransferase,COMT)‑小分子相互作用和复杂体系生物体系中ATP结合蛋白质的规模化鉴定分析，证明了该方法的准确性和高效性。

Description

一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法
技术领域
本发明属于活性蛋白质与小分子相互作用检测技术领域，具体涉及一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法。
背景技术
在细胞的生长发育过程中，蛋白质作为生命活动的主要执行者会与很多的内源性或者外源性小分子发生相互作用。蛋白质通过与小分子结合可以提高蛋白质结构的稳定性，改变蛋白质的三维结构和蛋白质生物学功能的执行和抑制。如何有效地检测小分子与蛋白质的相互作用在生物化学研究和药物开发中具有重要的作用。通过对小分子与蛋白质的相互作用的规模化分析检测可以有效地确认小分子药物与靶点蛋白质的结合情况以及强弱；同时可以发现小分子药物与其他非靶蛋白质的结合，从而预测药物潜在的副作用。此外，小分子代谢产物与蛋白质的相互作用研究对理解细胞生命活动也具有重要的意义。在确认小分子是否与蛋白质发生相互作用时，通常采用的方法需要对该蛋白质进行纯化；并对小分子在蛋白质中可能的的相互作用位点进行单点或者多点的氨基酸突变进行确认。以上方法费时费力、分析方法周期长，同时很多蛋白质特别是膜蛋白质都存在纯化困难的问题。
还原二甲基化反应是常用的一种多肽赖氨酸侧链氨基的化学修饰方法。该方法被广泛用于提高蛋白质的结晶效率，并结合晶体衍射方法(XRD)测定蛋白质结构。二甲基化标记后的蛋白质能够保持了原有蛋白质的结构，并且在大多数情况下依然能执行蛋白质原有的生物学功能。在基于核磁共振的蛋白质与小分子配基的相互作用检测过程中，利用碳13标记的还原二甲基化反应通过小分子配基与蛋白质相互作用前后碳13所在的赖氨酸微环境的变化导致的化学位移变化可以确认小分子配基是否与蛋白质发生相互作用并确定发生相互作用的位点(Lund-Katz,S.；Ibdah,J.；Letizia,J.；Thomas,M.；Phillips,M.,A 13CNMR characterization of lysine residues in apolipoprotein B and their role inbinding to the low density lipoprotein receptor.J.Biol.Chem.1988,263(27),13831-13838；Abraham,S.J.；Hoheisel,S.；Gaponenko,V.,Detection of protein–ligandinteractions by NMR using reductive methylation of lysineresidues.J.Biomol.NMR 2008,42(2),143-148.)。本检测方法将还原二甲基化标记用于活性体系下蛋白质的标记，同时应用同位素标记策略结合质谱的高分辨和高灵敏度检测，对蛋白质与小分子相互作用进行定性和定量分析检测。通过小分子与蛋白质作用前后，赖氨酸侧链氨基标记效率的变化情况确认小分子与蛋白质相互作用和相互作用位点。同时基于标记效率变化的差值，本方法可以给出不同小分子与蛋白质相互作用的强弱。
发明内容
本发明提出一种快速、高效和简便的活性蛋白质-小分子相互作用质谱检测方法。本发明提出的蛋白质与小分子相互作用检测方法利用了活性体系下还原二甲基化化学标记对不同微观环境中赖氨酸侧链伯胺基团的标记效率不同，实现对小分子与活性蛋白质相互作用的检测，作用位点的确认以及作用强度的定量分析。
一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法，在保持蛋白质活性的情况下对蛋白质进行共价化学标记，通过质谱检测小分子相互作用前后蛋白质上特定氨基酸位点的化学标记效率变化情况确定小分子结合位点和强度。
该方法具体为：采用二甲基化标记方法对蛋白质赖氨酸残基侧链伯胺或者仲胺基团进行特异性的活性标记，在完成活性标记后，采用蛋白质水解酶将标记后的蛋白质酶解成多肽片段，然后通过液相色谱-质谱联用定量分析得到特定标记多肽的标记效率。其流程如图1所示。
所述采用二甲基化标记方法对蛋白质赖氨酸残基侧链伯胺或者仲胺基团进行特异性的活性标记，具体步骤如下：
(1)将蛋白质分散在5～500mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)缓冲体系中，pH为5.5～8.5；蛋白质浓度保持在0.01～10mg/mL之间；
(2)将上述步骤(1)得到的蛋白质溶液体系中加入小分子，在20～30℃孵育30～90min；
(3)将上述步骤(2)中小分子处理的蛋白质溶液体系中加入10～100标记试剂1,涡旋震荡10-100s；
(4)在上述步骤(3)中处理的蛋白质溶液体系中加入10～100m标记试剂2,涡旋震荡10-100s；
(5)将上述步骤(4)中处理的蛋白质溶液体系置于25～30℃的恒温摇床中，反应时间控制在5～30min；
(6)使用蛋白质沉淀法快速终止上述步骤(5)中二甲基化处理的蛋白质溶液体系，同时加入50mM醋酸铵；沉淀液加入量与蛋白质溶液体系体积比为5～8：1；
(7)将上诉步骤(6)中处理的蛋白质置于-20℃沉淀过夜；使用高速离心得到二甲基化标记的蛋白质。
所述标记试剂1为氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠；所述的标记试剂2为甲醛、氘代甲醛或C13氘代甲醛。
所述蛋白质为：蛋白质序列中包含有赖氨酸的蛋白质。
所述小分子为：可以和蛋白质发生相互作用的小分子蛋白质抑制剂或促进剂，小分子的相对分子量在100～3000之间。
所述标记缓冲液为：5～500mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)缓冲体系或5～500mM磷酸盐缓冲体系(PBS)pH 6.8～7.5。
所述所述蛋白质沉淀液为纯丙酮，或者配方为：乙醇：丙酮：乙酸＝50：50：0.1的溶液。
在完成活性标记后，采用蛋白质水解酶将标记后的蛋白质酶解成多肽片段，然后通过液相色谱-质谱联用定量分析得到特定标记多肽的标记效率，具体步骤为：
(8)将上述步骤(7)中得到的蛋白质复溶于8M尿素50mM Hepes缓冲液，pH 5.5～8.5；蛋白质浓度控制在0.01～10mg/mL；
(9)在上述步骤(8)中得到蛋白质溶液体系中加入10～100mM NaCNBH3,涡旋震荡10-100s；
(10)在上述步骤(9)中处理的蛋白质溶液体系中加入10～100mM 13CD2O,涡旋震荡10-100s；
(11)将上述步骤(10)中处理的蛋白质溶液体系置于25～37℃的恒温摇床中，反应时间控制在0.5-2h。
(12)将上述步骤(11)中处理的二甲基化标记体系，用蛋白质沉淀法终止反应，并去除标记试剂，沉淀方法与上述步骤(6)中提到的一致。
(13)将在上述步骤(12)中得到的蛋白质沉淀复溶于8M urea 50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.8～8.2)中，加入5mM TCEP，室温反应25min。
(14)在上述步骤(13)的蛋白质溶液体系中加入10mM碘代乙酰胺(IAA),避光处理25min。
(15)使用50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.8～8.2)稀释上述步骤(14)中处理的蛋白质溶液体系，至Urea浓度低于2M；使用Glu-C或者chemotrypsin对蛋白质进行酶解处理，蛋白质与酶的比例保持在1：25～100之间；
如果使用Glu-C，酶解温度控制20～25℃，酶解时间9～14h；
如果使用Chemtrypsin，酶解温度控制在37℃，酶解时间5～10h。
(16)对上述步骤(15)处理得到的蛋白质酶解肽，用C18脱盐柱除盐后，使用液相质谱联用进行分析。
小分子对于质谱检测的结果经过数据检索，可以基于不同同位素标记状态赖氨酸所在肽段的质谱响应值给出该赖氨酸的活性状态的二甲基化标记效率值。基于该值在小分子与蛋白质作用前后的差异可以确认小分子是否与蛋白质发生相互作用、小分子与蛋白质的作用位点以及作用强度。
本发明样品预处理方法具有明显的优点：简便，快速，高效，高通量；小分子与蛋白质相互作用的研究通常需要纯化蛋白质以及氨基酸的单点突变去确认小分子与蛋白质相互作用以及作用位点，该方法操作繁琐，费时费力，实验周期长。本发明中我们提出的基于保持蛋白质活性化学标记的小分子与蛋白质相互作用分析方法，可以用于纯化的单一蛋白质也可以用于复杂的细胞裂解液，结合质谱的高灵敏度和高通量分析无需蛋白质的纯化也可以确认小分子在细胞中的靶蛋白质，极大地降低了分析的难度并提高了分析通量。利用该方法可以在1～2天内就实现对小分子与蛋白质相互作用的确认以及相关的作用位点和作用强度分析。通过对儿茶酚甲基转移化酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)与小分子托卡朋(Tolcapone，TCW)相互作用的检测，该方法准确地确认了COMT与TCW的相互作用，同时确认了TCW与COMT的作用位点，该结果与文献报道的一致，体现了本方法的高效准确。同时将该方法用于复杂生物样品中ATP结合蛋白质的分析，准确鉴定了多个文献报道的ATP结合蛋白质，对其中有晶体结构的蛋白质进行结合位点的确认，所得到的作用赖氨酸位点与文献报道的高度一致，体现了该方法高的样品兼容性。
附图说明
图1基于活性共价化学标记反应的蛋白质与小分子相互作用分析检测方法流程图。
图2 COMT蛋白第144位赖氨酸(K144)与周围氨基酸及小分子作用的晶体结构图。
图3 P63261蛋白第213位赖氨酸(K213)与周围氨基酸及小分子作用的晶体结构图。
图4 BSA与ANS作用前后其各个赖氨酸活性标记的标记效率(Occupy)。
具体实施方式
实施例1
儿茶酚甲基转移化酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)与小分子托卡朋(Tolcapone，TCW)相互作用的检测
各取纯化的儿茶酚甲基转移化酶溶解在以下三种反应体系中，保持其蛋白质浓度为1mg/mL,反应体系分别为：1)50mM磷酸盐缓冲液(PBS buffer),1.6mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT),pH 7.4；2)50mM PBS buffer,1.6mM DTT,pH 7.4，5mM MgCl2and200μM S-adenosyl methionine(SAM)；3)50mM PBS buffer,1.6mM DTT,pH 7.4，5mMMgCl2and 200μM S-adenosyl methionine(SAM)和10μM TCW，在25度控温摇床上孵育30min.在上述三个样品中加入10mM C13D2O和15mM NaCNBD3进行活性状态下的二甲基化标记反应，温度为室温，反应时间控制在30min。反应结束后加入5倍体积的蛋白质沉淀液和50mM醋酸铵，在-20度冰箱中沉淀COMT蛋白4h。通过采用25000g 4度高速离心30min分离沉淀的蛋白质，并用80％丙酮和纯丙酮洗涤沉淀的蛋白质各一次。将三个不同处理的COMT蛋白样品重新分散在6M盐酸胍50mM Hepes(pH 7.4)缓冲液中，蛋白质浓度为1mg/ml。然后，分别加入20mM CH2O和30mM NaCNBH3在37度控温摇床上反应2h。反应结束后加入5倍体积的蛋白质沉淀液和50mM醋酸铵，在-20度冰箱中沉淀COMT蛋白4h。通过采用25000g 4度高速离心30min分离沉淀的蛋白质，并用80％丙酮和纯丙酮洗涤沉淀的蛋白质各一次。将三个样品复溶于8M尿素50mM Tris pH 8.2缓冲溶液中，加入5mM TCEP，室温反应25min。加入10mM碘代乙酰胺(IAA),避光处理25min。使用50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.8～8.2)稀释蛋白质溶液，至Urea浓度低于2M。使用Glu-C对蛋白质进行酶解处理，蛋白质与酶的比例为1：25之间，酶解温度为25℃，酶解时间12h。
用C18脱盐柱对得到的肽段样品除盐后，复溶在100μL 0.1％(v/v)甲酸中进行RPLC-MS/MS分析，使用COMT数据库进行谱图搜索和数据处理后得到定性和定量结果，从而得到各个赖氨酸在活性标记下的占有率。
结果表明，K144仅在含有TCW的体系中，活性标记效率明显降低，测得的占有率低于0.1，表明其与TCW存在强相互作用。对比COMT已报道的晶体结构(PDB Code:3BWM)，该结构显示了COMT与TCW类似物DNC的结合(图2)。对K144的微观结构进行分析，表明其与DNC存在强的静电相互作用，两者之间的距离为2.7A；而K144与儿茶酚(SAM)在结构上并没有相互作用，这也与实验结果相一致，实验组1)与实验组2)之间赖氨酸的占有率并没有发生明显变化。
实施例2
复杂生物样品中ATP结合蛋白质的分析
取10，000，000个细胞，分散在1mL活性裂解液中，活性裂解液成份为50mM Hepe缓冲液，1mM EDTA，150mM NaCl，5％Glycerol，1％NP-40，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)。在冰浴条件下，使用超声辅助进行细胞破碎，超声功率为200W，超声程序设置为超声时间3S，间隔时间5S，超声30次。超声破碎的细胞，使用4度控温高速离心去除细胞碎片以及其他不溶物，离心力为10000g，离心时间为10min。使用BCA蛋白质浓度测定法确定提取的蛋白质浓度，分别取6份200μg提取的蛋白质，分为2组(实验组和对照组)，每组为3个样品。使用活性裂解液将每个样品的蛋白质浓度稀释至0.01mg/mL。在实验组中加入2mM ATP,将对照组和实验组均置于25度控温摇床上，孵育30min。在两组样品中加入100mM C13D2O和100mM NaCNBD3进行活性状态下的二甲基化标记反应，温度为室温，反应时间控制在5min。反应结束后加入8倍体积的蛋白质沉淀液和50mM醋酸铵，在-20度冰箱中沉淀蛋白质4h。通过采用25000g 4度高速离心30min分离沉淀的蛋白质，并用80％丙酮和纯丙酮洗涤沉淀的蛋白质各一次。将两组蛋白质样品重新分散在6M盐酸胍50mM Hepes(pH 7.4)缓冲液中，蛋白质浓度为1mg/ml。然后，分别加入20mM CH2O和30mM NaCNBH3在37度控温摇床上反应2h。反应结束后加入5倍体积的蛋白质沉淀液和50mM醋酸铵，在-20度冰箱中沉淀蛋白4h。通过采用25000g 4度高速离心30min分离沉淀的蛋白质，并用80％丙酮和纯丙酮洗涤沉淀的蛋白质各一次。将三个样品复溶于8M尿素50mM Tris pH 8.2缓冲溶液中，加入5mM TCEP，室温反应25min。加入10mM碘代乙酰胺(IAA),避光处理25min。使用100mM NH4HCO3缓冲溶液(pH 7.8～8.2)稀释蛋白质溶液，至Urea浓度低于2M。使用Glu-C对蛋白质进行酶解处理，蛋白质与酶的比例为1：25之间，酶解温度为25℃，酶解时间12h。使用C18脱盐柱对各组样品进行脱盐纯化，然后复溶于100μL 0.1％(v/v)甲酸中进行RP LC-MS/MS分析，上样量为2μg。
对通过质谱采集的数据使用人库进行数据检索和定量分析。每组样品中，每组样品中3个样品测定的赖氨酸占有率相对标准偏差小于10％才被认为是可信的定量结果。通过对比实验组和对照组中相同蛋白质相同位点赖氨酸的占有率的变化，对照组中的赖氨酸占有率普遍大于实验组但是差异不大。我们设定0.1的偏差属于随机误差，大于0.1的偏差的蛋白质赖氨酸位点我们认为是由于ATP与蛋白质结合造成的。408个可靠定量的赖氨酸占有率中，14个赖氨酸位点的占有率在对照组与实验组之间的差距大于0.1。通过比对Uniprot中这些蛋白质的配基信息，其中11个赖氨酸所在的蛋白质均被报道存在与ATP的相互作用，表明本发明中所提出的方法具有很高的可靠性。这11个赖氨酸所在的蛋白质，其中只有P63261(Actin,cytoplasmic 2)具有报道的晶体结构(PDB Code:5JLH)，配基为ATP类似物ADP。图3显示的是K213在晶体结构中的微观结构图，ADP的羟基与赖氨酸的伯胺距离为2.7A，表明两者之间存在氢键相互作用。其中有4个赖氨酸位点占有率在实验组中相对于对照组有明显提高，这可能是ATP的结合，导致了蛋白质结构的调整，使得该位点与周围氨基酸的相互作用减弱导致的。
实施例3
牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)与8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalene sulfonate，ANS)的相互作用检测
各取BSA溶解在以下三种反应体系中，保持其蛋白质浓度为10mg/mL,反应体系分别为：1)100mM磷酸盐缓冲液(PBS buffer),0.15mM ANS,pH 6.8；2)100mM PBS buffer,0.6mM ANS,pH 6.8；3)100mM PBS buffer,pH 6.8，在37度控温摇床上孵育60min.在上述三个样品中加入50mM C13D2O和50mM NaCNBD3进行活性状态下的二甲基化标记反应，温度为37度，反应时间控制在15min。反应结束后加入4倍体积的蛋白质沉淀液和50mM醋酸铵，在-20度冰箱中沉淀BSA蛋白10h。通过采用25000g 4度高速离心30min分离沉淀的蛋白质，并用80％丙酮和纯丙酮洗涤沉淀的蛋白质各一次。将三个不同处理的BSA蛋白样品重新分散在6M盐酸胍50mM Hepes(pH 7.4)缓冲液中，蛋白质浓度为1mg/ml。然后，分别加入50mM CH2O和50mM NaCNBH3在30度控温摇床上反应1h。反应结束后加入5倍体积的蛋白质沉淀液和50mM醋酸铵，在-20度冰箱中沉淀BSA蛋白12h。通过采用25000g 4度高速离心30min分离沉淀的蛋白质，并用80％丙酮和纯丙酮洗涤沉淀的蛋白质各一次。将三个样品复溶于8M尿素50mM Tris pH 8.2缓冲溶液中，加入5mM TCEP，室温反应25min。加入10mM碘代乙酰胺(IAA),避光处理25min。使用50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.8～8.2)稀释蛋白质溶液，至Urea浓度低于2M。使用Glu-C对蛋白进行酶解处理，蛋白质与酶的比例为1：25之间，酶解温度为25℃，酶解时间12h。用C18脱盐柱对得到的肽段样品除盐后，复溶在100μL 0.1％(v/v)甲酸中进行RPLC-MS/MS分析，使用BSA数据库进行谱图搜索和数据处理后得到定性和定量结果，从而得到各个赖氨酸在活性标记下的占有率。
图4为BSA与ANS作用前后其序列中的各个赖氨酸的活性标记效率，标记效率以第一步活性标记量相对与总量进行表示，用占有率(Occupy)来表示，Occupy越高，表示活性标记效率越高。BSA与ANS作用前后，有多个赖氨酸的活性标记效率发生了明显变化，如K44、K304、K412、K455等，而且这种变化与ANS浓度正相关，表明BSA与ANS存在明显的相互作用，且这些发生明显活性标记效率变化的赖氨酸参与了该作用过程。

Claims (6)

1.一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法，其特征在于：在保持蛋白质活性的情况下对蛋白质进行共价化学标记，通过质谱检测小分子相互作用前后蛋白质上特定氨基酸位点的化学标记效率变化情况确定小分子结合位点和强度；
该方法具体为：采用二甲基化标记方法对蛋白质赖氨酸残基侧链伯胺或者仲胺基团进行特异性的活性标记，在完成活性标记后，采用蛋白质水解酶将标记后的蛋白质酶解成多肽片段，然后通过液相色谱-质谱联用定量分析得到特定标记多肽的标记效率；具体步骤如下：
(1)将蛋白质分散在标记缓冲液中，pH为5.5～8.5；蛋白质浓度保持在0.01～10mg/mL之间；
(2)将上述步骤(1)得到的蛋白质溶液体系中加入小分子，在20～30℃孵育30～90min；
(3)将上述步骤(2)中小分子处理的蛋白质溶液体系中加入10～100mM标记试剂1,涡旋震荡10-100s；
(4)在上述步骤(3)中处理的蛋白质溶液体系中加入10～100mM标记试剂2,涡旋震荡10-100s；
(5)将上述步骤(4)中处理的蛋白质溶液体系置于25～30℃的恒温摇床中，反应时间控制在5～30min；
(6)使用蛋白质沉淀法快速终止上述步骤(5)中二甲基化处理的蛋白质溶液体系，同时加入50mM醋酸铵；蛋白质沉淀液加入量与蛋白质溶液体系体积比为4～8：1；
(7)将上诉步骤(6)中处理的蛋白质置于-20℃沉淀过夜；使用高速离心得到二甲基化标记的蛋白质；然后，缓冲液稀释二甲基化标记的蛋白质浓度为1mg/ml，加入标记试剂1和标记试剂2在37度反应2h，处理后的蛋白质置于-20℃沉淀4h，高速离心得到最终的二甲基化标记的蛋白质；
所述标记试剂1为氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠；所述的标记试剂2为甲醛、氘代甲醛或C13氘代甲醛；
所述小分子为：可以和蛋白质发生相互作用的小分子蛋白质抑制剂或促进剂，小分子的相对分子量在100～3000之间。
2.根据权利要求1所述一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法，其特征在于：所述蛋白质为：蛋白质序列中包含有赖氨酸的蛋白质。
3.根据权利要求1所述一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法，其特征在于：所述标记缓冲液为：5～500mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)缓冲体系或5～500mM磷酸盐缓冲体系(PBS)pH 6.8～7.5。
4.根据权利要求1所述一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法，其特征在于：所述蛋白质沉淀液为纯丙酮，或者配方为：乙醇：丙酮：乙酸＝50：50：0.1的溶液。
5.根据权利1所述的一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法，其特征在于：所采用的蛋白质水解酶为proteinase K，Glu-C，Trypsin，Chymotrypsin，Lys-C中的一种或多种。
6.根据权利1所述的一种活性蛋白质与小分子相互作用的质谱检测方法，其特征在于：特定氨基酸位点的标记效率通过所在多肽的峰面积或质谱鉴定谱图数计算得到；标记效率变化程度代表小分子与特定氨基酸位点的作用强度。
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