CN118090950A - 冷藏草鱼肉脂质组成分析方法和劣变判断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品检测，具体涉及冷藏草鱼肉脂质组成分析方法和劣变判断方法。所述冷藏草鱼肉脂质组成分析方法，其包括以下步骤：提取冷藏草鱼肉中的脂质，得到含脂质的样品；对所述含脂质的样品进行UPLC‑MS/MS分析，得到UPLC‑MS/MS原始数据；对所述UPLC‑MS/MS原始数据进行预处理，得到含有脂质名称、保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵；对所述数据矩阵与代谢数据库进行匹配，并进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS‑DA)，得到脂质组分和差异代谢物信息。若所述冷藏草鱼肉的脂质组分与新鲜草鱼肉的脂质组分具有显著性差异，则判断所述冷藏草鱼肉已发生脂质劣变。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测，具体涉及冷藏草鱼肉脂质组成分析方法和劣变判断方法。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodon idella)捕获后在冷藏、运输、加工等过程中，容易发生一系列生化反应，导致质地、风味品质等劣化，严重影响其加工、分销。脂质氧化是造成鱼肉品质变化的一个重要因素。脂质氧化通常由氧化催化剂引发，如不饱和脂肪酸、血红素、过渡金属元素和氧化酶等，诱导活性氧产生自由基链式反应，生成脂质过氧化物，并进一步裂解产生醇类、醛类、酮类和酸类等挥发性化合物影响草鱼肉气味。然而，目前对于草鱼冷藏期间脂质氧化的研究大多局限于基本生化指标测定和脂肪酸组成分析，全面描述草鱼肉在冷藏过程中的脂质分子变化尚未报道，缺乏检测冷藏草鱼是否变质的方法。
发明内容
基于此，本发明提供冷藏草鱼肉脂质组成分析方法和劣变判断方法，至少解决现有技术中的一个问题。
第一方面，本发明提供一种冷藏草鱼肉脂质组成分析方法，其包括以下步骤：
提取冷藏草鱼肉中的脂质，得到含脂质的样品；
对所述含脂质的样品进行UPLC-MS/MS分析，得到UPLC-MS/MS原始数据；
对所述UPLC-MS/MS原始数据进行预处理，得到含有脂质名称、保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵；
对所述数据矩阵与代谢数据库进行匹配，并进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，得到脂质组分和差异代谢物信息。
在本发明中，采用了多元统计学分析结合脂质组学的技术方案，可以快速、准确地分析脂质组分和差异代谢物信息，从而能够鉴定冷藏草鱼肉在保鲜期内、保鲜期过渡阶段、超过保鲜期三个阶段。该方法能丰富充实草鱼肉中脂质分子基础，为冷藏草鱼肉劣变的鉴定提供脂质标记物，为预制草鱼肉脂质成分分析、产地溯源和品质改良提供技术支持。
在一些优选的实施方式中，所述提取冷藏草鱼肉中的脂质包括以下步骤：
将冷藏草鱼肉去骨后与提取液混合，研磨，低温超声提取后静置，离心并取上清液；
将所述上清液与复溶液混合，在冰水浴中超声处理，离心并取上清液，即得到含脂质的样品。
在本发明中，因为采用了低温下研磨加超声辅助提取液萃取的方案提取草鱼肉组织中的脂质，提取率高且极大限度地保持脂质原有结构。
在一些优选的实施方式中，所述提取液为甲醇与水的混合物，所述复溶液为异丙醇与乙腈的混合物。
在一些优选的实施方式中，所述预处理包括使用软件LipidSearch(Thermo，CA)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和鉴定。
在一些优选的实施方式中，所述预处理还包括使用总和归一化法对峰强度进行归一化。
在一些优选的实施方式中，所述代谢数据库为http://www.hmdb.ca/、https://metlin.scripps.edu/等中的公共数据库或LIPID MAPS脂质数据库。
在一些优选的实施方式中，使用R软件包ropls 1.6.2进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，其中置换校验次数为200，进行Student’s t检验和差异倍数分析。置换校验次数为200时模型区分系数最高(因变量拟合指数R2Y(cum)为0.992)，可以达到快速、准确地鉴定和区分冷藏草鱼肉在保鲜期内、保鲜期过渡阶段、超过保鲜期三个阶段效果。
在一些优选的实施方式中，所述冷藏草鱼肉脂质组成分析方法还包括通过KEGG数据库(https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html)对所述差异代谢物信息进行代谢通路注释的步骤。
在一些优选的实施方式中，所述差异代谢物信息基于正交最小偏二乘判别分析分析(OPLS-DA)的变量权重值(VIP)和Student’s t检验的p值来确定，变量权重值(VIP)>1且p<0.05的代谢物为差异代谢物。
第二方面，本发明提供一种冷藏草鱼肉脂质劣变判断方法，其包括以下步骤：
使用所述冷藏草鱼肉脂质组成分析方法获得冷藏草鱼肉的脂质组分和差异代谢物信息；
若所述冷藏草鱼肉的脂质组分与新鲜草鱼肉的脂质组分具有显著性差异，则判断所述冷藏草鱼肉已发生脂质劣变。
在一些优选的实施方式中，采用单因素方差(ANOVA)分析显著性差异，若P<0.05，则具有显著性差异。
在一些优选的实施方式中，所述脂质组分为PE(16:1e/22:6)、TG(4:0/18:0/22:5)、PC(18:1/20:3)和TG(18:0/16:0/20:4)。
在一些优选的实施方式中，所述冷藏草鱼肉是指在4℃下冷藏3天以上的草鱼肉。
由于采用了以上技术方案，本发明的实施例至少具有以下有益效果：采用基于超高效液相色谱/质谱联用(UPLC-MS/MS)的脂质组技术研究4℃冷藏不同时间的草鱼肉脂质谱，通过多元统计分析和单因素方差分析筛选其冷藏过程中的差异脂质，并结合KEGG数据库富集差异脂质分子参与的代谢通路，获得了冷藏草鱼肉脂质劣变标记物和影响冷藏草鱼劣变脂质谱的重要代谢途径。
附图说明
图1为本发明实施例中草鱼块冷藏3天、6天、15天脂质PCA图。
图2为本发明实施例中草鱼块冷藏3天、6天、15天脂质PLS-DA图。
图3为本发明实施例中草鱼块冷藏3天、6天、15天脂质PLS-DA置换校验图。
图4显示了本发明实施例1中草鱼块冷藏3天脂质VIP评分。其中，左侧为代谢物VIP气泡图，Y轴表示代谢物，X轴是VIP值，代谢物按照VIP值大小，从上到下排列；右侧为代谢物表达量热图，每列表示一个样本，下方为样本名称；每行表示一个代谢物，颜色表示该代谢物在该组样本中相对表达量的大小，颜色梯度与数值大小的对应关系见梯度色块。
图5显示了本发明实施例2中草鱼块冷藏6天脂质VIP评分。其中，左侧为代谢物VIP气泡图，Y轴表示代谢物，X轴是VIP值，代谢物按照VIP值大小，从上到下排列；右侧为代谢物表达量热图，每列表示一个样本，下方为样本名称；每行表示一个代谢物，颜色表示该代谢物在该组样本中相对表达量的大小，颜色梯度与数值大小的对应关系见梯度色块。
图6显示了本发明实施例3中草鱼块冷藏15天脂质VIP评分。其中，左侧为代谢物VIP气泡图，Y轴表示代谢物，X轴是VIP值，代谢物按照VIP值大小，从上到下排列；右侧为代谢物表达量热图，每列表示一个样本，下方为样本名称；每行表示一个代谢物，颜色表示该代谢物在该组样本中相对表达量的大小，颜色梯度与数值大小的对应关系见梯度色块。
图7为本发明实施例1中草鱼块冷藏期间脂质组成的火山图。
图8为本发明实施例2中草鱼块冷藏期间脂质组成的火山图。
图9为本发明实施例3中草鱼块冷藏期间脂质组成的火山图。
图10显示了本发明实施例中草鱼块冷藏3天、6天、15天差异脂质。其中，*P<0.05,**P<0.01。
图11为本发明实施例1中KEGG拓扑分析气泡图。图中每一个气泡表示一个KEGGPathway通路；横轴表示通路中代谢物在通路中的相对重要性Impact Value的大小；纵轴表示代谢物参与通路的富集显著性-log10(P value)；气泡大小代表Impact Value值；气泡越大，表示通路重要性越大。
图12为本发明实施例2中KEGG拓扑分析气泡图。图中每一个气泡表示一个KEGGPathway通路；横轴表示通路中代谢物在通路中的相对重要性Impact Value的大小；纵轴表示代谢物参与通路的富集显著性-log10(P value)；气泡大小代表Impact Value值；气泡越大，表示通路重要性越大。
图13为本发明实施例3中KEGG拓扑分析气泡图。图中每一个气泡表示一个KEGGPathway通路；横轴表示通路中代谢物在通路中的相对重要性Impact Value的大小；纵轴表示代谢物参与通路的富集显著性-log10(P value)；气泡大小代表Impact Value值；气泡越大，表示通路重要性越大。
具体实施方式
以下将对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地阐述本发明的目的、方案和效果。
在以下实施例中，以新鲜草鱼块为对象，冷藏不同天数(3天、6天和15天)，采用基于Q Exactive UPLC-MS/MS脂质组技术对冷藏草鱼块的脂质进行鉴定，并结合多元统计学和单因素方差分析筛选差异脂质，通过KEGG富集差异脂质涉及的代谢途径，寻找冷藏草鱼肉脂质劣变的潜在生物标记物及相关代谢途径。
在以下实施例中，新鲜草鱼(1.25-1.50kg/尾)购于南昌市南昌县长胜大市场。将新鲜草鱼屠宰、清洗、打晕，并去除鳞片、内脏、头部、尾部和开放的切片。从背部取出鱼片，用自来水冲洗鱼片表面的杂质和血迹，沥干表面水分，将鱼片分选为约5.0×1.0cm×1.5cm(30±5.0g)的肌肉样品。将样品放置在密封的聚乙烯袋(不透明)中，并在4℃下储存，用于取样(3天、6天和15天，分别命名为D3_0、D6_0、D15_0)和后续分析。整个样品制备过程在10℃的环境温度下进行。
在以下实施例中，按照以下步骤提取草鱼肉样品中的脂质：精确称取50mg样品至2mL离心管中，加入一颗直径6mm的研磨珠；向样品中加入280μL提取液(甲醇:水＝2:5)，再加入400μL MTBE，冷冻组织研磨仪研磨6min(-10℃，50Hz)；低温超声提取30min(5℃，40KHz)后将样品静置于-20℃，30min；高速离心15min(13000g，4℃)后，移取350μL上清于EP管中，氮气吹干，加入100μL复溶液(异丙醇：乙腈＝1:1)复溶；涡旋混匀30s后，冰水浴中40KHz超声5min；高速离心10min(13000g，4℃)后，移取上清液至带内插管的进样小瓶中，得到含脂质的样品。
实施例1
按照以下步骤进行冷藏草鱼肉脂质组成分析：
提取冷藏3天的草鱼肉(命名为D3_0)中的脂质，得到含脂质的样品；
采用赛默飞公司的超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱系统UHPLC-QExactiveHF-X对含脂质的样品进行UPLC-MS/MS分析，得到UPLC-MS/MS原始数据；
将UPLC-MS/MS原始数据导入脂质组学处理软件LipidSearch(Thermo，CA)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和鉴定，得到一个脂质名称、保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵；其后采用该软件进行特征峰搜库鉴定，将MS和MS/MS质谱信息与代谢数据库(LIPID MAPS脂质数据库)进行匹配，MS质量误差设置为小于10ppm，同时根据二级质谱匹配得分鉴定代谢物；
搜库后的矩阵数据上传至美吉生物云平台上(https://cloud.majorbio.com)进行数据分析，首先进行数据清洗，数据矩阵用80％规则来去除缺失值，即保留至少一组样品中非零值80％以上的变量，再进行填补空缺值(原始矩阵中最小值填补空缺值)；为减小样品制备及仪器不稳定带来的误差，用总和归一化法对样本质谱峰的响应强度进行归一化，得到归一化后的数据矩阵；同时删除QC样本相对标准偏差(RSD)>30％的变量，并进行log10对数化处理，得到最终用于后续分析的数据矩阵；
用R软件包ropls 1.6.2进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，置换校验次数为200，进行Student’st检验和差异倍数分析，并使用7次循环交互验证来评估模型的稳定性；差异代谢物的选择基于OPLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)和student’s t检验p值来确定，VIP>1、p<0.05的代谢物为差异代谢物；
差异代谢物通过KEGG数据库(https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html)进行的代谢通路注释，获得差异代谢物参与的通路；Python软件包scipy.stats进行通路富集分析，并通过Fisher精确检验获得与实验处理最相关的生物学途径。
其中，色谱条件为：2μL样本经Accucore C30柱(100mm×2.1mm i.d.,2.6μm；Thermo)分离后进入质谱检测。流动相A为10mM乙酸铵50％乙腈水溶液(含0.1％甲酸)，流动相B为2mM乙酸铵乙腈/异丙醇/水(体积比为10/88/2，含0.02％甲酸)。分离梯度：0-4min，流动相B从35％升至60％；4-12min，流动相B从60％升至85％；12-15min，流动相B从85％升至100％；15-17min，流动相B维持100％；17-18min，流动相B从100％降至35％；18-20min，流动相B维持35％。流速为0.40mL/min，柱温为40℃。
质谱条件为：样品质谱信号采集采用正负离子扫描模式，质量扫描范围m/z：200-2000。正模式离子喷雾电压为3000V，负模式离子喷雾电压为-3000V，鞘气60psi，辅助加热气20psi，离子源加热温度370℃，20-40-60V循环碰撞能，采用DDA模式采集数据。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于冷藏草鱼肉为冷藏6天的草鱼肉(命名为D6_0)。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于冷藏草鱼肉为冷藏15天的草鱼肉(命名为D15_0)。
对比例1
本对比例与实施例1基本相同，区别仅在于将冷藏草鱼肉替换为新鲜草鱼肉(命名为con)。
实施例1-实施例3和对比例1均平行执行3次，分别称为D3_0组、D6_0组、D15_0组和con组。使用SPSS26.0软件进行数据统计分析。采用单因素方差分析显著性差异(ANOVA)，若P<0.05，则差异有统计学意义，结果表示为mean±sd。
当QC样本RSD<0.3时，峰所占的累积比例接近80％，说明UPLC-MS/MS仪器在整个样品检测和分析过程中具有良好的校准信号，实施例中获得的脂质谱差异可以反映样本间自身的生物学信息学差异。
草鱼肌肉中共检测到1265种脂质分子，分属5大类和33个亚类。依据LIPID MAPS(Lipid Metabolites and Pathways Strategy，LIPID MAPS)的脂质分类法，将鉴定到的脂质分为脂肪酰(FA，占1.41％)、甘油酯(GL，占33.41％)、甘油磷脂(GP，占62.60％)、鞘脂类(SP，占2.56％)和固醇脂(ST，占0.02％)，GP是草鱼肉脂质的主要组分，其次为GL和SP。
图1显示了不同冷藏草鱼肉样品(D3_0、D6_0和D15_0)和新鲜草鱼肉样品(con)的脂质谱差异。PC1贡献率为48.60％，PC2贡献率为18.10％。D3_0组与D6_0组较为聚集，与con组在PC1存在部分重叠，但与con组在PC2显著分离。D15_0组与con组在PC1和PC2显著分离。结果表明冷藏3天后草鱼脂质变化较小；继续冷藏至6天，草鱼脂质组成与第3天差异不显著；当冷藏15天时，草鱼肉脂质组成发生显著变化，与新鲜草鱼、冷藏3天、冷藏6天的草鱼脂质均有显著差异。脂质组PCA分析结果表明草鱼肉的脂质谱变化可以初步反映冷藏期限。
图2为不同组别草鱼块脂质组的PLS-DA得分图。PC1(Component1)与PC2(Component2)的贡献率分别为53.6％和17.2％；因变量拟合指数R2Y(cum)为0.992，拟合指数Q2(cum)为0.857，均接近1.0，回归线性良好，说明模型可靠。
如图3所示，con组、D3_0组和D6_0组在X轴上有重叠，而D15_0组与con组、D3_0组和D6_0组在X轴上显著分离(P<0.05)，说明冷藏3天和6天的草鱼肉脂质组成和新鲜鱼肉差异不显著(P>0.05)；而冷藏15天后的草鱼肉脂质组成明显变化，与新鲜组、冷藏3天和6天的草鱼肉脂质组成均存在明显差异，研究与PCA分析结果一致。
依据变量投影重要性(VIP>1)结合显著性分析(P<0.05)筛选草鱼块冷藏3天、6天、15天时的差异脂质分子(TOP代谢物＝30)，VIP评分结果如图4-图6所示。
相比于con组，D3_0组中，18种脂质上调，包括6种FA：AEA(22:5，16:0，20:1，18:2，18:0，18:1)；3种SP：Cer(18:0/20:4，18:1/20:4，d18:0/18:1)；2种GL：TG(20:4e/18:1/20:4，18:0/16:0/20:4)；6种GP：PE(33:0/18:2，32:1/22:6)、PEt(14:1e/22:6)、MePC(17:1/20:4，17:0/20:4)、LPE(18:3)和1种ST：ZyE(22:5)。12种脂质下调，包括7种GL：TG(14:0/12:1/14:1，18:1/22:6/24:1，16:0/16:1/18:1，16:0/20:5/22:6，19:1/18:2/18:3，18:1/18:1/24:1)和DG(16:2e/18:1)；4种GP：PE(36:0/20:1，18:3/20:5，12:1e/10:4)和dMePE(4:0/16:0)和1种FA：AcCa(18:1)。
D6_0组中，12种脂质上调，包括6种FA：AEA(22:5，20:1，16:0，18:1，18:2，18:0)；3种SP：Cer(18:0/20:4，18:1/20:4，d18:0/18:1)；2种GL：TG(20:4e/18:1/20:4，18:0/16:0/20:4)和1种GP：PEt(14:1e/22:6)。18种脂质下调，包括17种GP：LPE(20:5，20:1e，20:2e)；TG(14:0/12:1/14:1，19:1/16:0/18:1)；PS(16:1/18:3)；PE(26:1/11:2)；MLCL(14:2/15:0/15:0，11:2/16:1/22:5，18:2/15:0/20:4)；PE(12:1e/10:4)；dMePE(4:0/16:0)；LdMePE(18:1e)；LPC(18:2e、18:1e、20:5、16:1)和1种FA：AcCa(18:1)。
D15_0组中，17种脂质上调，包括14种GP：PMe(16:1/18:1)、PS(16:1/18:3，16:1/18:2)、PE(20:4e/13:0、16:0/16:1、16:1/18:1、16:1/16:1、16:1/14:0、33:0/18:2)、PC(16:1/13:0)，dMePE(16:1/14:0)、PEt(14:1e/22:6)、PG(16:0/16:1，16:1/18:2)；1种GL：TG(20:4e/18:1/20:4)；1种FA：AEA(22:5)和1种SP：Cer(18:0/20:4)。13种脂质下调，均为GP：LPC(22:1，16:0)、LdMePE(16:0)、LPE(17:0，20:0，22:2)、MLCL(14:2/16:0/16:0，19:0/15:1/18:1，18:2/15:0/20:4，10:3/20:1/22:6)、LPC(20:1，17:1，17:0)。
可以看出，GP在差异脂质分子中占比较高，为主要差异脂质。随冷藏时间的延长，差异脂质的种类逐渐趋于单一，冷藏至15天时，GP是主要的差异脂质。30个差异代谢物中，14种GP上调，13种GP下调。N-酰基乙醇胺(AEA)和神经酰胺(Cer)在草鱼冷藏过程中仅表现为上调，且在冷藏前期(3天、6天)是主要的上调脂质，而溶血磷脂在冷藏过程中主要表现为下调。其他脂质分子如TG、PE等在冷藏过程中存在上调同时存在下调。
通过比较正负离子模式下脂质的峰面积对脂质分子进行相对定量，并对冷藏鱼肉的单个脂质进行含量分析。依据丰度显著不同(P<0.05)，分析冷藏3、6和15天后鱼肉中显著变化的脂质分子，绘制火山图(图7-图9)。图中横轴为差异倍数(FC)的Log2 FC值，纵坐标轴为p值的对数值。横坐标的绝对值越大，两个样本之间表达量的FC越大；纵坐标值越大，差异表达越显著，筛选出的分子越可靠。灰色表示无显著差异的脂质分子，红色圆点为显著增多的脂质，蓝色圆点为显著减少的脂质(P<0.05)。草鱼肉在冷藏3、6和15天后，分别检测到104种(65种上调，39种下调)、169种(106种上调，63种下调)和287种(152种上调，135种下调)丰度差异脂质(P<0.05)。结果表明，随着冷藏时间的延长，草鱼肉中发生变化的脂质逐渐增加，冷藏鱼肉脂质变化主要表现为上调。
结合三种分析方式(VIP>1，P<0.05，FC<0.8或FC>1.2)筛选冷藏草鱼肉中重要的差异脂质分子作为脂质代谢的潜在代谢劣变标记物，结果如表1所示。冷藏草鱼肉中共检测出57个目标脂质分子，其中D3_0/con与D6_0/con获得2个上调的脂质分子：AEA(22:5)和Cer(d18:0/20:4)，分别属于FA和SP。D15_0/con获得55个目标脂质分子，分属于GP、GL、FA和SP，下调脂质均为GP，LPC(22:1)下调最为显著，FC达0.0964；而PMe(16:1/18:1)是上调最显著的脂质分子，FC达33.2762。结果表明，单因素方差分析结果与多元统计学分析结果类似，草鱼肉冷藏过程中脂质的下调主要发生在冷藏6天后，到冷藏15天时，PC、TG和PE均存在明显下调，PC是主要的下调的脂质。
表1冷藏草鱼肉中潜在的脂质代谢标记物
采用单因素方差(Post-hoc检验，scheffe>0.95)分析冷藏草鱼肉con、D3_0、D6_0与D15_0组的脂质谱，差异test bar plot分析结果如图10所示。由图可知，草鱼肉在冷藏期间共筛选出20种脂质差异分子(P<0.05，FC<0.8或FC>1.25)，包括7种PC(18:1/20:3，16:0/20:4，10:0e/10:4，14:0e/20:2，18:0/18:1，14:0e/22:5，16:2e/18:0)，5种TG(4:0/18:0/22:5，18:0/18:0/18:2，16:0/16:0/20:4，18:0/16:0/20:4，16:0/18:1/18:2)，5种MePC(19:0/18:2，16:2e/19:0，17:0/22:6，16:2e/17:0，16:1/19:0)和3种PE(16:1e/22:6，16:0p/22:6，20:4e/19:0)。共检测到4种显著性差异脂质(P<0.05)，分别为2种TG(4:0/18:0/22:5和18:0/16:0/20:4)，1种PE(16:1e/22:6)和1种PC(16:0/20:4)。其中PE(16:1e/22:6)呈极显著差异(P<0.01)，其余三种脂质呈显著差异(P<0.05)。
为进一步分析冷藏草鱼脂质的变化，从KEGG数据库获取冷藏草鱼肉差异脂质代谢途径，结合p值和通路相对重要性(Impact Value)通过拓扑分析识别显著富集的通路。草鱼块冷藏3天、6天、15天差异脂质分子KEGG富集途径如表2所示，对应的KEGG拓扑分析气泡图如图11-图13所示。可以发现，从D3_0、D6_0和D15_0中分别富集到3、7和6条脂质代谢通路，包括鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、乙醚脂质代谢、甘油酯代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢。其中，鞘脂代谢和甘油磷脂代谢在冷藏3天时即发生，并参与了整个实验过程中的脂质代谢。冷藏6天后，乙醚脂质代谢、甘油酯代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢发生。由表2中参与代谢途径的脂质分子数目可知，在冷藏过程中，参与代谢的脂质分子逐渐增多，表明随冷藏时间延长，脂质代谢加剧；由p值和Impact Value可知，鞘脂代谢是参与冷藏草鱼脂质代谢的最重要的代谢途径，此外，乙醚脂质代谢、甘油磷酯代谢、甘油酯代谢、也对冷藏草鱼的脂质谱产生了重要影响。综上所述，脂质代谢随冷藏时间延长而加剧，鞘脂代谢、甘油磷脂代谢参与了整个冷藏期间(15天)的脂质代谢，是影响冷藏草鱼脂质劣变的重要代谢途径。
表2草鱼块冷藏3天、6天、15天差异脂质分子KEGG途径富集
综上所述，草鱼肉含有丰富的脂质，GP是主要的脂质分子，其次是GL和SP。长期冷藏会导致草鱼肉脂质谱发生明显变化，而短期冷藏(3-6天)时，草鱼肉脂质谱与新鲜草鱼肉脂质图谱差异不明显。草鱼肉冷藏过程中主要的差异脂类为GP、GL、SP和FA，其中GP(Cer)及FA(AEA)在冷藏初期(3天)显著增加，在冷藏后期(6-15天)，GP是主要的差异脂类。与新鲜草鱼肉相比，冷藏15天时，胆碱及溶血磷脂等显著下调。草鱼肉冷藏不同时间丰度度前20的脂质分子存在4种显著差异分子：PE(16:1e/22:6)、TG(4:0/18:0/22:5)、PC(18:1/20:3)和TG(18:0/16:0/20:4)，可作为冷藏草鱼肉脂质劣变潜在的生物标记物。差异脂质的代谢途径富集分析表明，鞘脂代谢、甘油磷脂代谢参与了整个冷藏期间的脂质代谢，是影响冷藏草鱼脂质谱的重要代谢途径，乙醚脂质代谢、甘油磷酯代谢和甘油酯代谢对冷藏草鱼的脂质谱产生了重要影响。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同或等同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内，其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
Claims (10)
1.一种冷藏草鱼肉脂质组成分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取冷藏草鱼肉中的脂质，得到含脂质的样品；
对所述含脂质的样品进行UPLC-MS/MS分析，得到UPLC-MS/MS原始数据；
对所述UPLC-MS/MS原始数据进行预处理，得到含有脂质名称、保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵；
对所述数据矩阵与代谢数据库进行匹配，并进行主成分分析和偏最小二乘法判别分析，得到脂质组分和差异代谢物信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取冷藏草鱼肉中的脂质包括以下步骤：
将冷藏草鱼肉与提取液混合，研磨，低温超声提取后静置，离心并取上清液；
将所述上清液与复溶液混合，在冰水浴中超声处理，离心并取上清液，即得到含脂质的样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括使用软件LipidSearch进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和鉴定。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用R软件包ropls 1.6.2进行主成分分析和偏最小二乘法判别分析，其中置换校验次数为200，进行Student’s t检验和差异倍数分析。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述差异代谢物信息基于正交最小偏二乘判别分析分析的变量权重值和Student’s t检验的p值来确定，变量权重值>1且p<0.05的代谢物为差异代谢物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷藏草鱼肉脂质组成分析方法还包括通过KEGG数据库对所述差异代谢物信息进行代谢通路注释的步骤。
7.一种冷藏草鱼肉脂质劣变判断方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用权利要求1-6中任一权利要求所述冷藏草鱼肉脂质组成分析方法获得冷藏草鱼肉的脂质组分和差异代谢物信息；
若所述冷藏草鱼肉的脂质组分与新鲜草鱼肉的脂质组分具有显著性差异，则判断所述冷藏草鱼肉已发生脂质劣变。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用单因素方差分析显著性差异，若P<0.05，则具有显著性差异。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述脂质组分为PE(16:1e/22:6)、TG(4:0/18:0/22:5)、PC(18:1/20:3)和TG(18:0/16:0/20:4)。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述冷藏草鱼肉是指在4℃下冷藏3天以上的草鱼肉。
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