CN103149280B - 一种应用代谢组学技术评价动物个体营养状况的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用代谢组学技术评价动物个体营养状况的方法。该方法通过建立动物日粮中粗蛋白含量和消化能含量与动物体液中的代谢物种类及含量的回归模型，对待测动物所饲喂的日粮的蛋白和能量水平进行预测。使用本发明所提供的方法，可确定生长猪的日粮中蛋白和能量两方面的营养水平是否与正常营养水平不同，并确定其营养类型，正确率可达100％。同时，本发明还找到了与日粮中蛋白水平相关的生物标志物11种，与日粮中能量水平相关的生物标志物9种，其中，有5种生物标志物与二者均相关。本发明对评价猪的营养状况以及优化配方，提高猪的生产效率具有重要的理论与实践意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种评价动物个体营养状况的方法，特别涉及一种应用代谢组学技术评价动物个体营养状况的方法。
背景技术
目前粮食压力的增加，饲料原料的紧缺以及人类环保意识的增强，提高饲料转化率与利用率，减少N、P的排放，实现健康高效、高产、生态、安全的养殖模式，将具有非常重要意义。目前，动物营养学研究日益精细化，精确确定营养素的需要量以调控动物生长已成为国内外研究热点。为克服现行标准中指标的表观性、静态性的缺陷，以期帮助养殖场优化饲养模式，饲养标准必须向模型化、动态化的方向转变。
代谢组学是定量分析生物体内源代谢产物种类、数量及其变化规律的科学，是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。代谢组学可从测定的代谢终产物，来了解生物整体、系统或器官的状况及内外因素引发的变化结果。例如：血液和尿液中含有近千种的代谢物，它们都是营养代谢的产物，代表了机体的代谢状况，且合适的代谢组学检测工具可以检测生物样本中数百甚至上千个分子量小于1000的各类小分子化合物，其中LC/GC TOF MS对很多化合物灵敏度高，这些化合物包括几乎所有的氨基酸、糖醇类化合物、脂肪酸类、脂类、小分子有机酸类、核苷和嘌呤化合物、氨类化合物、神经递质等，它们既是生命活动必需的原料，也是机体代谢产物/中间体，还是机体生长、发育、生物信号传导和代谢循环的重要物质基础。对血液、尿液等体液内代谢物进行系统的分离与分析，结合模式识别等信息学手段，可对由于营养引起的代谢应答进行分类、判别和预测，从而为营养需求量的制定、生物安全评价等领域提供全新的技术手段。
在动物营养学方面，随着代谢组学分析技术平台和模式识别技术的逐步完善，以及猪营养研究中日粮配方、群体环境和行为等方面的可控性，为代谢组学技术在动物营养方面实现奠定了坚实基础。
迄今为止，还没有利用代谢组学数据建立数学模型，确定生物标志物进行动物能量和蛋白摄入量定量评价的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测或辅助检测动物日粮中蛋白水平和能量水平或所述两种水平之一的方法，该方法包括如下步骤：
1)用动物样本各个体的离体的体液进行试验；
所述动物样本是根据所饲喂日粮的粗蛋白含量和/或消化能含量进行如下a)-c)中任一分组的动物群体：
a)对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组；
b)对照组、高蛋白组和低蛋白组；
c)对照组、高能量组和低能量组；
饲喂所述对照组的日粮中所述粗蛋白含量和所述消化能含量为正常水平；
饲喂所述高蛋白高能量组的日粮中所述粗蛋白含量和消化能含量高于所述对照组；
饲喂所述高蛋白低能量组的日粮中所述粗蛋白含量高于所述对照组、且所述消化能含量低于所述对照组；
饲喂所述低蛋白高能量组的日粮中所述粗蛋白含量低于所述对照组、且所述消化能含量高于所述对照组；
饲喂所述低蛋白低能量组的日粮中所述粗蛋白含量和消化能含量低于所述对照组；
饲喂所述高蛋白组的日粮中所述粗蛋白含量高于所述对照组；
饲喂所述低蛋白组的日粮中所述粗蛋白含量低于所述对照组；
饲喂所述高能量组的日粮中所述消化能含量高于所述对照组；
饲喂所述低能量组的日粮中所述消化能含量低于所述对照组；
饲喂所述对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组、低蛋白低能量组、高蛋白组、低蛋白组、高能量组和低能量组的日粮中，除粗蛋白含量和/或消化能含量有差别外，其它物质的营养水平均相同并为正常水平；所述动物群体除日粮外的饲养条件均相同；
对所述动物群体中每个个体的体液中的代谢物进行检测，获得所述每个个体的所述体液的代谢物种类及含量的数据，将所述数据按所述动物样本的分组统计为对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组的数据集，或对照组、高蛋白组和低蛋白组的数据集，或对照组、高能量组和低能量组的数据集，将所述对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组这五组的数据集命名为训练集a，将所述对照组、高蛋白组和低蛋白组这三组的数据集命名为训练集b，将所述对照组、高能量组和低能量组这三组的数据集命名为训练集c；
3)对所述训练集a、训练集b或训练集c进行多变量数据统计，建立所述日粮中的粗蛋白含量和/或消化能含量与所述代谢物的种类及含量的回归模型；
4)将待测动物的离体的体液按照步骤2)的方法获得所述待测动物的所述体液的代谢物种类及含量的数据，命名为测试集，所述回归模型根据所述测试集的数据预测出饲喂所述待测动物的日粮的营养类型；
所述待测动物的日粮的营养类型为如下A)-C)中的一种和/或D)-F)中的一种：
A)所述待测动物的日粮的蛋白含量高于所述饲喂所述对照组的日粮中的蛋白含量或候选高于所述饲喂所述对照组的日粮中的蛋白含量；
B)所述待测动物的日粮的蛋白含量低于所述饲喂所述对照组的日粮中的蛋白含量或候选低于所述饲喂所述对照组的日粮中的蛋白含量；
C)所述待测动物的日粮为蛋白含量正常的日粮或候选为蛋白含量正常的日粮；
D)所述待测动物的日粮的能量含量高于所述饲喂所述对照组的日粮中的能量含量或候选高于所述饲喂所述对照组的日粮中的能量含量；
E)所述待测动物的日粮的能量含量低于所述饲喂所述对照组的日粮中的能量含量或候选低于所述饲喂所述对照组的日粮中的能量含量；
F)所述待测动物的日粮为能量含量正常的日粮或候选为能量含量正常的日粮；
所述代谢物为所述体液中的分子量小于1000的小分子化合物。
在上述方法中，步骤2)所述检测包括使用液相色谱-质谱联用的方法对所述体液中的代谢物进行检测；所述代谢物种类及含量的数据包括所述体液的代谢物的保留时间、质荷比和离子强度的数据。
在上述方法中，所述体液为血液。
在上述方法中，所述血液在进行所述检测前还进行包括如下步骤的处理：取所述血液的血浆按1∶4的体积比加入提取液A中进行提取，获得上清液A，在所述上清液A中按1∶1的体积比加入提取液B，获得上清液B，将所述上清液B进行所述检测；
所述提取液A为甲醇与乙腈按1∶1的体积比混合后的溶液；
所述提取液B为乙腈与水按1∶19的体积比混合后的溶液。
在上述方法中，步骤4)所述多变量数据统计的方法具体可为偏最小二乘法；所述回归模型为偏最小二乘回归模型。
在上述方法中，所述偏最小二乘法判别分析可使用安捷伦公司的Mass ProfilerProfessional软件，所述Mass Profiler Professional软件的版本号为B.02.00。
在上述方法中，所述Mass Profiler Professional软件给出的所述回归模型按照如下方法预测出饲喂所述待测动物的日粮的营养类型：计算所述测试集的分类变量的值Yp，按照如下条件确定所述待测动物样本的日粮是所述对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组这五组动物所饲喂的日粮中哪一种日粮，或确定所述待测动物样本的日粮是所述对照组、高蛋白组和低蛋白组这三组动物所饲喂的日粮中哪一种日粮，或确定所述待测动物样本的日粮是所述对照组、高能量组和低能量组这三组动物所饲喂的日粮中哪一种日粮：将所述测试集与所述训练集a的五组数据集、所述训练集b的三组数据集或所述训练集c的三组数据集分别进行比较，当所述测试集与所述训练集a、所述训练集b或所述训练集c中的某一组的数据集相比，Yp＞0.5，且偏差＜0.5，则确定所述待测样本的日粮属于所述数据集来源的那组动物样本所饲喂的日粮；当Yp＜0.5，且偏差＜0.5，则确定所述待测样本的日粮不属于所述数据集来源的那组动物样本所饲喂的日粮；当Yp的偏差≥0.5，无法确定。
在上述方法中，所述动物具体可为猪。
在上述方法中，当所述动物为猪时，所述对照组的日粮中粗蛋白的质量百分含量具体可为17％，消化能的含量具体可为每千克日粮中含消化能3400k cal。
在上述方法中，当所述动物为猪时，所述高蛋白组、高蛋白高能量组和高蛋白低能量组的日粮中粗蛋白的质量百分含量具体可为21％；所述低蛋白组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组的日粮中粗蛋白的质量百分含量具体可为13％；所述高能量组、高蛋白高能量组和低蛋白高能量组的日粮中消化能的含量具体可为每千克日粮中含消化能3600k cal；所述低能量组、高蛋白低能量组和低蛋白低能量组的日粮中消化能的含量具体可为每千克日粮中含消化能3200k cal。
所述饲喂所述对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组的日粮具体可为实施例1的表1中的MEMP、HEHP、LEHP、HELP和LELP所示的日粮，其中，MEMP所示的日粮为所述正常水平的日粮。
在养猪生产中，由于个体差异以及环境等因素的影响，相同营养状况下会产生不同的代谢物谱系及生产性能；同样，不同的营养供给也会产生特异的代谢物谱以及不同的生产性能。血液中的这些代谢物谱的变化可以充分反映营养、环境和个体等方面的综合影响，可及时、灵敏地反映个体的营养及其代谢状况与生产性能之间的相关性。
使用本发明所提供的方法，可确定生长猪的日粮中蛋白和能量两方面的营养水平是否与正常营养水平不同，并确定其营养类型，正确率可达100％。同时，本发明还找到了与日粮中蛋白水平相关的生物标志物11种，与日粮中能量水平相关的生物标志物9种，其中，有5种生物标志物与二者均相关。本发明对评价猪的营养状况以及优化配方，提高猪的生产效率具有重要的理论与实践意义。
附图说明
图1为采食五种日粮生长猪的典型血浆LC/MS基峰离子流色谱图(BPC)的比较。
图2为采食不同蛋白水平日粮生长猪的血浆代谢组主成分分析得分图。
图3为采食不同消化能水平日粮生长猪的血浆代谢组主成分分析得分图。
图4为采食不同蛋白和消化能水平日粮生长猪的血浆代谢组主成分分析得分图，其中，A为应用2个主成分进行分析，B为应用3个主成分进行分析。
图5为采食五种不同日粮生长猪的血浆代谢组偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)得分图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、不同能量和蛋白含量的日粮进行动物能量蛋白摄入量评价数据模型的建立
一、材料与方法
1.试验动物
试验选用健康的杜洛克×长白×大白三元生长猪50头，体重21.7±0.5kg。按体重相近和遗传基础相似的原则，随机分成5组，每组10头，公母各半，单栏饲养。
2.试验日粮
试验分为5个处理，即对照组(正常能量蛋白水平日粮MEMP)、高能高蛋白组(HEHP)、低能低蛋白组(LELP)、高能低蛋白组(HELP)和低能高蛋白组(LEHP)。对照组日粮营养水平参照《猪饲养标准》(2004)推荐值设计，其它日粮在对照组的基础上进行调整。其中，日粮粗蛋白水平上下浮动4个百分点，日粮消化能上下浮动200kcal/kg。五种日粮的原料组成及营养成分见表1。
3.饲养管理
于河北涿州中国农业大学动物实验基地进行。试验猪饲养在封闭式猪舍内，水泥地面，通风良好，舍内温度为22℃，相对湿度55％。每栏配有单独的食槽和饮水器，试验期间自由采食和饮水，按猪场常规程序进行消毒、驱虫和免疫。适应3天对照组日粮后，生长猪自由采食5种试验日粮，饲养期为10天。试验结束后，所有猪禁饲12h，采集前腔静脉血液，3000rpm离心10min获得血浆，并分装保存于-80℃冰箱内。
4.试验方法
在试验的开始和结束，动物个体空腹称重，并以个体为单位记录采食量，计算平均日增重、平均日采食量、平均日蛋白、消化能采食量和饲料转化效率。
二、实验结果
应用SAS 8.2统计软件对各项数据进行方差分析和多重比较，P≤0.05为差异有显著性统计学意义。不同日粮蛋白水平和消化能水平对生长猪生长性能的影响见表2。在整个试验期间，采食不同日粮对生长猪的最终体重无显著差异(P＞0.05)。尽管日粮蛋白和消化能水平不影响生长猪的平均日采食量，但平均日蛋白采食和平均日消化能采食却分别受到日粮蛋白水平和日粮消化能水平的影响。与低蛋白组相比，高蛋白组的生长猪采食更多的蛋白且与其他处理组相比差异显著(P＜0.01)；而高能量组与低能量组相比采食更多的能量(P＝0.01)。同时日粮蛋白水平和消化能水平的互作对平均日采食量(包括总采食量、蛋白和消化能采食量)有作用的趋势(0.05＜P＜0.10)。日粮消化能水平对平均日增重和饲料转化效率均无显著影响，但是随着日粮蛋白水平的增加，生长猪的平均日增重也随着增加(P＝0.01)，饲料转化效率却呈现相反的趋势。其中，中蛋白组和高蛋白组的差异不显著。
表1五种试验日粮原料组成和营养成分1
1猪预混料在日粮中按日粮的1％添加，为每千克日粮提供：6000IU维生素A；1500IU维生素D3；15IU维生素E；1.5mg维生素K3；1.0mg维生素B1；3.5mg维生素B2；18mg烟酸；2.0mg维生素B6；10mg泛酸；0.5mg叶酸；0.02mg生物素；0.02mg维生素B12；350mg氯化胆碱；90mg铁；80mg铜；100mg锌；20mg锰；0.32mg碘；0.35mg硒。
表1中的“％”均表示质量百分含量。
表2不同日粮蛋白和消化能水平对生长猪生长性能的影响1，2
1每组10头猪，试验期为10天。
2蛋白水平：HP＝21％，MP＝17％，LP＝13％；消化能水平：HE＝3600kcal/kg，ME＝3400kcal/kg，LE＝3200kcal/kg。
3kg/d，蛋白摄入量＝平均日采食量×日粮蛋白含量(分析值)。
4Mcal/d，消化能摄入量＝平均日采食量×日粮消化能水平(计算值)。
小结：通过本试验可以看出日粮蛋白水平和能量水平能够影响猪的蛋白和能量的摄入量，平均日增重和饲料转化效率等，日粮蛋白水平和能量水平对生长猪的生长性能有显著性影响。
实施例2、基于液相色谱-质谱联用的代谢组学技术评价动物蛋白和能量摄入量
一、数据采集及处理
1.样品的处理
将实施例1的50个血浆样品从-80℃冰箱取出后于冰上解冻。各取100μL血浆，分别进行如下处理：加入400μL提取液(甲醇与乙腈以1∶1的体积比混合)中，涡旋震荡5min后，在4℃、13000rpm下离心10min。小心吸取上清200μL置于新的离心管内，常温下用氮气吹干，并复溶于200μL初始有机相溶液(乙腈与水以5∶95的体积比混合)中。震荡5s后，再在4℃、13000rpm下离心10min，取上清液2μL置于进样瓶内，进行高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(HPLC Q-TOF MS)检测。
2.HPLC Q-TOF MS检测的条件
仪器：HPLC Q-TOF MS检测系统(HPLC(1290系列，安捷伦公司)，Q-TOF MS(6520系列，安捷伦公司)。
高效液相色谱的条件：色谱柱为安捷伦ZORBAX超高压快速高分离度色谱柱(C-18，3.0×100mm，1.8μm)，流动相分别为A相超纯水(0.1％甲酸)，B相乙腈(0.1％甲酸)，流速0.5mL/min，温度45℃，从5％-95％的B相梯度洗脱，分析时间为18min。
质谱的条件：离子源为电喷雾正模式ESI+，干燥气温度350℃，干燥气流速12L/min，毛细管电压3800V，碎裂电压150V，采集质量范围60-1000m/z，采集速率2spectra/s。
3.HPLC Q-TOF MS检测的重复性
按照上述检测条件，随机取10个样品，分别对同一样品连续6批次进样，来考察仪器和方法的重复性。以同一样品在24小时内分析6次(每次间隔4小时)来考察日内重复性和样品24小时稳定性，以当日和连续6日重复制样6份进行分析来考察制样的稳定性和日间的重复性。结果表明，多次进样的谱图均无明显的时间和质量数的漂移，一致性良好，而且各主要色谱峰的峰高和峰面积波动也非常小(相对标准偏差RSD＜5％)。这些数据的一致性和良好的重复性保证了后续代谢组学分析的准确性和结果的可靠性。
4.HPLC Q-TOF MS检测的结果
经HPLC Q-TOF MS检测，可得到样品的代谢物色谱图(图1)。图1表明，采食不同能量和蛋白含量日粮的生长猪，其血浆样品的代谢物质谱有明显差异，但是仅凭肉眼观察对图谱的差别进行鉴定比较是很困难的，同时受到生长猪个体差异的影响，这种目测判断的方法只能作为一种主观的、粗略的鉴别，无法实现定量和定性评价。
使用仪器自带的MassHunter Qualitative Analysis软件(version B.03.01，安捷伦公司)，对所有样品的质谱图进行背景扣除、谱峰精确质量数和保留时间的校准，提取各样品的保留时间、质荷比和离子强度值的特征数据，归一化处理，得到校正后代谢物分子特征的数据集。
二、数据分析及数学模型的建立
1.数据的预处理
将步骤一中4得到的数据导入数据分析软件Mass Profiler Professional(简称MPP，版本号B.02.00，安捷伦公司)，参数设置按照软件的默认设置，进行数据分组和筛选、统计分析、变化倍数分析，得到差异的生物标志物后，再对数据进行提取离子色谱图(EIC)的检查，排除假阳(阴)性的结果。
2.主成分分析(PCA)
使用MPP软件中的多元统计分析，将步骤1得到的数据进行主成分分析，PCA的得分图如图2、3、4所示。从得分图我们可以看到，即使只考虑一个因素(日粮粗蛋白水平或者日粮消化能水平)，三组血浆均能被明显区分开，以CP(图2)和DE(图3)为主要变量进行PCA，前两个主成分分别代表总变量的76.29％和79.97％。如果不考虑日粮粗蛋白和消化能水平，仅以五种不同日粮为变量，无论是两个主成分(图4A)还是三个主成分(图4B)进行分析，五组血浆均表现出明显的聚类。前三个主成分分别能解释所有变量的54.67％，20.04％和13.84％，合计88.55％。从代谢谱数据对五组样本的区分能力可以看出，采食不同日粮的生长猪血浆代谢组存在显著性差异。同时，非正常的日粮组(HEHP、LELP、HELP和LEHP)与正常日粮组(MEMP)分类尤其明显，这为进行下一步的营养评价与推荐提供了有利的基础。
3.偏最小二乘回归模型的建立和预测
使用MPP软件中的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，建立多参数模型对样品进行预测。
上述偏最小二乘回归模型建立的具体过程如下：
作为一个多元线性回归方法，偏最小二乘回归的主要目的是要建立一个线性模型：Y＝XB+E，其中Y是具有m个变量、n个样本点的响应矩阵，X是具有p个变量、n个样本点的预测矩阵，B是回归系数矩阵，E为噪音校正模型，与Y具有相同的维数。在通常情况下，变量X和Y被标准化后再用于计算，即减去它们的平均值并除以标准偏差。
偏最小二乘(PLS)的一般原理：偏最小二乘回归是对多元线性回归模型的一种扩展，在其最简单的形式中，只用一个线性模型来描述独立变量Y与预测变量组X之间的关系：Y＝b0+b1X1+b2X2+…+bPXP，在该方程中，b0是截距，bi的值是数据点1到P的回归系数。
偏最小二乘回归采用得分因子作为原始预测变量线性组合的依据，所以用于建立预测模型的得分因子之间必须线性无关。例如：假如现在有一组响应变量Y(矩阵形式)和大量的预测变量x(矩阵形式)，其中有些变量严重线性相关，使用提取因子的方法从这组数据中提取因子，用于计算得分因子矩阵；T＝xw，最后再求出合适的权重矩阵W，并建立线性回归模型：Y＝TQ+E，其中Q是矩阵T的回归系数矩阵，E为误差矩阵。一旦Q计算出来后，前面的方程就等价于Y＝XB+E，其中B＝WQ，它可直接作为预测回归模型。
偏最小二乘回归产生的权重矩阵W反映的是预测变量X与响应变量Y之间的协方差。在建模当中，偏最小二乘回归产生了pxc的权重矩阵W，矩阵W的列向量用于计算变量X的列向量的nxc的得分矩阵T。不断的计算这些权重使得响应与其相应的得分因子之间的协方差达到最大。普通最小二乘回归在计算Y在T上的回归时产生矩阵Q，即矩阵Y的载荷因子(或称权重)，用于建立回归方程：Y＝TQ+E。一旦计算出Q，就可以得出方程：Y＝XB+E，其中B＝WQ，最终的预测模型也就建立起来了。
PLS-DA是一种有监督的分析方法。这类方法用于建立类别间的数学模型，使各类样品间达到最大的分离，并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测。在这种方法中经常需要建立用来确认样品归类(防止过拟合)的训练集(validation Set)和用来测试模型性能的测试集(test set)。在MPP软件中，直接输出PLS-DA的结果，判别两组间的分组情况。所有血浆(每组10个)的代谢谱数据作为训练样本，经过log转化等步骤，进行建模，选择对样本分类具有显著影响的变量，利用七重交叉验证方法对模型进行验证和预测，最终得到可靠稳定的模式识别模型。由五组血浆PLS-DA得分图(图5)可见，采食五种不同蛋白和消化能水平的日粮，生长猪的血浆代谢谱能够完全区分开，分别聚集在不同的空间位置。模型的识别和预测能力如表3所示，建立的模型对分组具有较强的识别能力，没有错误识别的分组出现。随后，利用相同的数据进行模型的验证和预测，该模型能够对分组的进行准确预测，预测准确率为100％。
表3利用PLS-DA建模后模型的识别能力和预测能力
将步骤1得到的数据以待测动物的数据(命名为测试集)导入PLS回归模型，该回归模型以loadings plot的形式输出分析结果，软件给出导致其区别(或相似性)的有贡献变量及其贡献程度。这些变量是色谱中的保留时间(代谢物或其色谱特性)、质谱中的质荷比(分子量或其分数)。计算测试集(未知样本)的分类变量的值(Predictedcategory variable Y，Yp)，具体判别方法是，①当Yp＞0.5，且偏差(Deviation)＜0.5，判定样本属于该类；②当Yp＜0.5，偏差＜0.5，判定样本不属于该类；③当Yp的偏差≥0.5，判别不稳定。最后综合判断，给出待测动物所饲喂的日粮的粗蛋白含量和消化能含量类型，结果与待测动物实际所饲喂的日粮的粗蛋白含量和消化能含量类型一致，准确率100％。
4.生物标志物的获得及鉴定
根据上述偏最小二乘回归模型，得到共15种生物标志物：与日粮中的粗蛋白水平相关的生物标志物有11种，与日粮中的消化能水平相关的生物标志物有9种，其中二者共同的生物标志物5种，生物标志物的详细鉴定信息见表4。
上述偏最小二乘回归模型判断生物标志物的标准如下：
日粮中的粗蛋白含量的生物标志物的确定标准：①MPP软件中指明的对蛋白分组有贡献的变量；②P＜0.05，变化倍数FC＞1.5倍；③利用二级质谱或标准品进行确证。
日粮中的消化能含量的生物标志物的确定标准：①MPP软件中指明的对消化能分组有贡献的变量；②P＜0.05，变化倍数FC＞1.5倍；③利用二级质谱或标准品进行确证。
上述生物标志物的鉴定方法如下：
通过数据库检索(METLIN、Massbank、Chemspider、HMDB、KEGG等)、分子式生成以及二级质谱和标准品(购自Sigma-Aldrich公司)的比对，最终鉴定出以下几种与日粮蛋白水平和消化能水平相关的化合物(表4)：这些化合物主要是有机酸、碳水化合物、脂肪酸和氨基酸。只与日粮蛋白水平相关的生物标志物有6种，分别是缬氨酸、脯氨酸、乙酰鸟氨酸、焦谷氨酸、亮氨酸和植物鞘氨醇；只对日粮消化能水平敏感的生物标志物有4种，分别是甲基马尿酸、二氢神经鞘氨醇C16、甘油磷酸胆碱和十八碳烯酸；同时对日粮能量和蛋白水平有贡献的标志物有5种，分别是马尿酸、二氢神经鞘氨醇C17、磷脂酰胆碱、硬脂酰肉碱、和胆红素。这些物质在在能量代谢、脂类代谢、蛋白代谢、氨基酸代谢过程中起到重要的作用。
表4对生长猪分组有贡献的血浆中内源性代谢物鉴定结果
Claims (9)
1.一种检测或辅助检测动物日粮中蛋白水平和能量水平或所述两种水平之一的方法，包括如下步骤：
1）用动物样本各个体的离体的体液进行试验；
所述动物样本是根据饲喂日粮的粗蛋白含量和/或消化能含量进行如下a）-c）中任一分组的动物群体：
a) 对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组；
b) 对照组、高蛋白组和低蛋白组；
c) 对照组、高能量组和低能量组；
饲喂所述对照组的日粮中所述粗蛋白含量和所述消化能含量为正常水平；
饲喂所述高蛋白高能量组的日粮中所述粗蛋白含量和消化能含量高于所述对照组；
饲喂所述高蛋白低能量组的日粮中所述粗蛋白含量高于所述对照组、且所述消化能含量低于所述对照组；
饲喂所述低蛋白高能量组的日粮中所述粗蛋白含量低于所述对照组、且所述消化能含量高于所述对照组；
饲喂所述低蛋白低能量组的日粮中所述粗蛋白含量和消化能含量低于所述对照组；
饲喂所述高蛋白组的日粮中所述粗蛋白含量高于所述对照组；
饲喂所述低蛋白组的日粮中所述粗蛋白含量低于所述对照组；
饲喂所述高能量组的日粮中所述消化能含量高于所述对照组；
饲喂所述低能量组的日粮中所述消化能含量低于所述对照组；
饲喂所述对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组、低蛋白低能量组、高蛋白组、低蛋白组、高能量组和低能量组的日粮中，除粗蛋白含量和/或消化能含量有差别外，其它物质的营养水平均相同并为正常水平；所述动物群体除日粮外的饲养条件均相同；
2）对所述动物群体中每个个体的体液中的代谢物进行检测，获得所述每个个体的所述体液的代谢物种类及含量的数据，将所述数据按所述动物样本的分组统计为对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组的数据集，或对照组、高蛋白组和低蛋白组的数据集，或对照组、高能量组和低能量组的数据集，将所述对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组这五组的数据集命名为训练集a，将所述对照组、高蛋白组和低蛋白组这三组的数据集命名为训练集b，将所述对照组、高能量组和低能量组这三组的数据集命名为训练集c；
3）对所述训练集a、训练集b或训练集c进行多变量数据统计，建立所述日粮中的粗蛋白含量和/或消化能含量与所述代谢物的种类及含量的回归模型；所述多变量数据统计的方法为偏最小二乘法；所述回归模型为偏最小二乘回归模型；
4）将待测动物的离体的体液按照步骤2）的方法获得所述待测动物的所述体液的代谢物种类及含量的数据，命名为测试集，所述回归模型根据所述测试集的数据预测出饲喂所述待测动物的日粮的营养类型；
所述待测动物的日粮的营养类型为如下A）-C）中的一种和/或D）-F）中的一种：
A)所述待测动物的日粮的蛋白含量高于所述饲喂所述对照组的日粮中的蛋白含量或候选高于所述饲喂所述对照组的日粮中的蛋白含量；
B）所述待测动物的日粮的蛋白含量低于所述饲喂所述对照组的日粮中的蛋白含量或候选低于所述饲喂所述对照组的日粮中的蛋白含量；
C）所述待测动物的日粮为蛋白含量正常的日粮或候选为蛋白含量正常的日粮；
D）所述待测动物的日粮的能量含量高于所述饲喂所述对照组的日粮中的能量含量或候选高于所述饲喂所述对照组的日粮中的能量含量；
E）所述待测动物的日粮的能量含量低于所述饲喂所述对照组的日粮中的能量含量或候选低于所述饲喂所述对照组的日粮中的能量含量；
F）所述待测动物的日粮为能量含量正常的日粮或候选为能量含量正常的日粮；
所述代谢物为所述体液中的分子量小于1000的小分子化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述检测包括使用液相色谱-质谱联用的方法对所述体液中的代谢物进行检测；所述体液的代谢物种类及含量的数据为所述体液的代谢物的保留时间、质荷比和离子强度的数据。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述体液为血液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述血液在进行所述检测前还进行包括如下步骤的处理：取所述血液的血浆按1:4的体积比加入提取液A中进行提取，获得上清液A，在所述上清液A中按1:1的体积比加入提取液B，获得上清液B，将所述上清液B进行所述检测；
所述提取液A为甲醇与乙腈按1:1的体积比混合后的溶液；
所述提取液B为乙腈与水按1:19的体积比混合后的溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述偏最小二乘法判别分析所使用的软件为安捷伦公司的Mass Profiler Professional软件，所述Mass Profiler Professional软件的版本号为B.02.00。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述回归模型按照如下方法预测出饲喂所述待测动物的日粮的营养类型：计算所述测试集的分类变量的值Yp，按照Yp值和偏差值确定所述待测动物样本的日粮是所述对照组、高蛋白高能量组、高蛋白低能量组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组这五组动物所饲喂的日粮中哪一种日粮，或确定所述待测动物样本的日粮是所述对照组、高蛋白组和低蛋白组这三组动物所饲喂的日粮中哪一种日粮，或确定所述待测动物样本的日粮是所述对照组、高能量组和低能量组这三组动物所饲喂的日粮中哪一种日粮。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述动物为猪。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述对照组的日粮中粗蛋白的质量百分含量为17%，消化能的含量为每千克日粮中含消化能3400 k cal。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述高蛋白组、高蛋白高能量组和高蛋白低能量组的日粮中粗蛋白的质量百分含量为21%；所述低蛋白组、低蛋白高能量组和低蛋白低能量组的日粮中粗蛋白的质量百分含量为13%；所述高能量组、高蛋白高能量组和低蛋白高能量组的日粮中消化能的含量为每千克日粮中含消化能3600 k cal；所述低能量组、高蛋白低能量组和低蛋白低能量组的日粮中消化能的含量为每千克日粮中含消化能3200 kcal。
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