CN104122286B - 一种基于低场nmr实时检测稀有细胞个数的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，包含以下步骤：(1)制备目标稀有细胞悬浮液的标准样本和待测样本；(2)分别加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即分别进行免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测；(3)对标准样本和待检样本进行恒温免疫孵育，每隔相同时间间隔进行核磁共振弛豫时间检测；(4)绘制标准样本的免疫孵育时间‑弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间‑弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数‑弛豫时间改变量最大值曲线；(5)计算待检样本的弛豫时间改变量，依据步骤(4)中绘制的曲线得到待检样本中稀有细胞的浓度。本发明可简便、快速、高特异性、高灵敏度地实时直观检测稀有细胞浓度和个数。

Description

一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，特别涉及一种生物体液样本中稀有细胞的检测方法。

背景技术

稀有细胞是指生物体液样本(包括血液、胸水、腹水、尿液、脑脊液等)中的一些非典型细胞，大量研究表明，对稀有细胞的检测和鉴定对于相关疾病的病理机制及靶向药物开发具有重要指导意义。因此，寻找准确、快速地的稀有细胞检测方法将成为亟待解决的问题。然而稀有细胞在生物体液中的浓度非常低，与非目标细胞的比例大约是1：10⁷，用传统技术无法计数，所以迫切需要一种简单准确快速的方法解决这一难题。

由于稀有细胞在体液中的含量很少，要经过有效的富集步骤才能在后续的实验中识别鉴定。目前市场上广泛应用于稀有细胞检测研究的方法主要有密度梯度离心法、膜过滤法和免疫磁性分离技术。

密度梯度区带离心法又称为区带离心法，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。使用此法可以同时使样品中几个活全部组分分离，具有良好的分辨率。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液。研究中经常利用密度梯度离心的原理，用ficoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞(PBMC)。

膜过滤方法是根据某些稀有细胞体积大于外周血中粒细胞从而使稀有细胞从外周血中分离富集出来，然后利用免疫荧光技术对稀有细胞进行鉴别诊断。该方法中，膜过滤细胞富集过程相对容易，但是并不是所有稀有细胞体积都大于外周血中粒细胞的，很多稀有细胞的体积和粒细胞大小差不多，甚至比粒细胞体积更小。基于以上的认识，膜过滤方法被逐渐抛弃。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可简便、快速、高特异性、高灵敏度地实时直观检测循环稀有细胞的低场核磁共振检测分析方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，包含以下步骤：

(1)样本制备

将纯培养的目标稀有细胞，利用有限稀释法以缓冲液进行细胞个数的梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；

对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心，获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得目标稀有细胞悬浮液待检样本；

(2)免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测

取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T₂ ⁰；

取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T₂ ^0’；

(3)免疫孵育中核磁共振弛豫时间检测

取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T₂ ⁿ，其中，n≥1，且n为整数；

取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T₂ ^n’，其中，n≥1，且n为整数；

(4)标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线的制作

以标准样本的免疫孵育时间t为横坐标，弛豫时间值T₂ ⁿ为纵坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线；

计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T₂ ⁿ-T₂ ⁰，以ΔT2为纵坐标，以免疫孵育时间t为横坐标，对每个细胞梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线。通过此曲线的绘制可获得核磁共振造影剂与检测样本的最佳孵育时间，二者充分孵育；

以标准样本的弛豫时间改变量ΔT2最大值为纵坐标，以标准样本中的稀有细胞数个为横坐标，制作孵育细胞数-弛豫时间改变量ΔT2最大值曲线，以检测本方法的灵敏度；

(5)待检样本浓度得出

绘制最佳孵育时间下各标准样本的细胞数-弛豫时间改变量标准曲线；

计算最佳孵育时间下待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test，所述ΔT2_test＝T₂ ^n’-T₂ ^0’，依据上述绘制的最佳孵育时间下标准样本的孵育细胞数-弛豫时间改变量曲线，从而得出待检样本中目标稀有细胞的浓度/个数。

可选地，上述步骤(3)中，在恒温下进行免疫孵育的恒温温度选自4～8℃，每次测定核磁共振弛豫时间的时间间隔为10～15min。

由上述检测步骤可知，本发明提供了一种简便、快速、高特异性、高灵敏度地实时直观检测循环稀有细胞的低场核磁共振检测分析方法。由于低场NMR的磁体温度一般高于35℃，为了保证测试的特异性和灵敏性，抗原抗体的反应一般低温长时间孵育，我们通过对细胞抗原和免疫磁珠偶联的抗体反应进行实时监控，观察整个反应过程是否完全，进而达到对微量循环稀有细胞精确定量的作用，提高此检测反应的灵敏性。本发明中所述的目标稀有细胞的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间特性参数的变化，所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间T。本发明的方法具有超高灵敏度，可以精确到一个细胞的检测，且快速、便捷，可以用于大规模样本的快速检测。

优选地，本发明的检测方法中，所使用的低场核磁共振分析仪内设有温度控制设备，通过所述的温度控制设备，控制免疫孵育的恒温温度，这样可以方便地实现对系统的自动恒温控制。

优选地，本发明的检测方法中，步骤(2)中所使用的核磁共振造影剂为顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠，且所述的顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠优选为抗EpCAM免疫纳米磁珠、抗CD45免疫纳米磁珠、链霉亲和素纳米磁珠、叶酸修饰的磁性脂质体中的一种或几种。上述的免疫磁珠将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，从而快速地实现从混合细胞群中捕获和分离稀有目标细胞的目的，所得稀有细胞可用于计数或其他方面研究应用。

优选地，本发明的检测方法中，所述步骤(2)和步骤(3)中，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度为20～25MHz，磁体温度为30～35℃，重复时间3～5s。更优选地，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度优选为20.18MHz，磁体温度优选为35℃，重复时间优选为5s。对上述核磁共振体系磁场强度、磁体温度和重复时间的控制，可使检测更加准确，可控性更强，且利于平行实验的比较和质控。

优选地，本发明的检测方法中，所述步骤(4)中，计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2和待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test时，分别取两次以上测量弛豫时间的平均值进行计算，从而能使本发明的检测结果更为准确可靠。

由上面的论述可知，本发明通过使用带温度控制系统的低场核磁共振仪，实时检测细胞抗原和磁珠偶联的特异性抗体反应，大大提高稀有细胞的灵敏度，不仅可用来判断整个反应过程是否完全，而且使整个检验过程更加灵敏。

在本申请提交的同时，申请人还提交了一份名称为“一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR检测稀有细胞的方法”的发明专利申请，该检测方法相对于现有技术的优点是检测时间短、价格低、自动化程度高、灵敏度高，但该方法仍存在不足之处：即无法控制样品温度，对于样品的测量不能做到实时同步直接测量和控制，有时是在实验前对样品进行测温，然后再放到样品试管中；而且，在实验过程中，样品的温度也可能有变化，这造成了实验的误差和灵敏度低的问题。本发明就针对上述不足之处进行了改进：通过控制样品温度,对细胞抗原和免疫磁珠偶联的抗体反应进行实时监控，观察整个反应过程是否完全，提高反应的灵敏度，进而达到对微量稀有细胞精确定量的作用，因此本发明的检测方法更加适用于对生物体液样本中的各种稀有细胞的检测、鉴定和定量分析。

本发明的检测方法适用于所有稀有目标细胞的检测、鉴定和定量分析，操作简单迅捷，可实现样品操作的高通量化；价格低廉，可适宜大规模使用的需求。该方法为首次被提出，目前未见相关报道。

附图说明

图1是实施例1中绘制的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线；

其中，从下至上各条曲线依次为细胞浓度梯度为1,2,3,5,7,10cells/管的标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线；

图2是实施例1中绘制的免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线；

其中，从下至上各条曲线依次为细胞浓度梯度为1,2,3,5,7,10cells/管的标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间改变量曲线；

图3是实施例1中绘制的标准样本的孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线；

图4是实施例1中绘制的标准样本在孵育时间为265分钟时的孵育细胞个数-弛豫时间改变量曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

实施例1

(1)样本制备

待检样本制备

1.1从乳腺癌模式鼠获得抗凝血样(～10ml)，所述样品包含怀疑含有循环稀有细胞的混合细胞群。采集的标本应在当天处理！室温避光保持时间不应超过24小时；

1.2Ficoll密度梯度离心法获取候选混合细胞群

1)加入适量细胞分层液(Ficoll溶液配制而成)至无菌离心管A底部，然后将上述抗凝血测试样以PBS液作适当稀释后(2:1)，沿管壁轻轻加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。

2)400×g水平离心30min(离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，以保证形成清晰的界面)。

3)离心后管内最终可见三层液体，上层为黄色液体，中间层为透明液体，底层为棕红色沉积红细胞(红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状)，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬(300×g10min洗涤两次)于B管中而获得可用于下一步免疫微磁珠富集的细胞悬浮液样本。

标准样本制备

将纯培养小鼠乳腺癌细胞，利用有限稀释法用PBS进行细胞个数的梯度稀释(0,1,2,3,5,7,10cells/管)，从而获得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；

(2)免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测

将超顺磁免疫磁珠加入上述步骤(1)制备的标准样品中(溶于PBS缓冲液中)，充分混合均匀(手动混匀)后立即测定核磁共振的弛豫时间T₂ ⁰，测三遍，取平均值。

仪器参数如下：磁场强度20.18MHz，磁体温度35℃，重复时间5s。所使用的磁性微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞的磁性标记。(以下操作中对核磁共振仪器参数的控制以及所使用的超顺磁免疫磁珠种类、加入量与此处相同)

取上述步骤(1)中制备的待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的超顺磁免疫磁珠，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T₂ ^0’；

(3)免疫孵育中核磁共振弛豫时间检测

取上述加入超顺磁免疫磁珠的标准样本，在4℃温度下恒温免疫孵育，每隔15min用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T₂ ⁿ(n＝1，2，3...n为整数)，每个数值测三遍，取平均值；

取上述加入超顺磁免疫磁珠的待检样本，在4℃温度下恒温免疫孵育，每隔15min用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T₂ ^n’(n＝1，2，3...n为整数)，每个数值测三遍，取平均值；

(4)标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线的制作

若弛豫时间T₂ ⁿ相比弛豫时间T₂ ⁰有显著增加，说明磁珠与细胞有进一步的结合。

根据实时监测的数据，绘制以下几张图：

①磁性微珠免疫孵育时间t---核磁共振(NMR)弛豫时间T₂ ⁿ

以标准样本的孵育时间t为横坐标，弛豫时间变化值T₂ ⁿ为纵坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间T₂ ⁿ标准曲线，该曲线如附图1所示；从图中可以看出，随着孵育的进行，在一定孵育时间范围内，T₂ ⁿ值均在增大。

②磁性微珠免疫孵育时间t---核磁共振(NMR)弛豫时间改变量ΔT2：计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T₂ ⁿ-T₂ ⁰，以孵育时间t为横坐标，弛豫时间改变量ΔT2的值为纵坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间改变量ΔT2标准曲线，该曲线如附图2所示；从图中可以看出，随着孵育的进行，ΔT2均在增大，250min后基本稳定。此实验的最大灵敏度为1个细胞，随着细胞数的增多，ΔT2值增大。

③磁性微珠免疫孵育的细胞数---核磁共振(NMR)弛豫时间改变量ΔT2最大值：

以标准样本的弛豫时间改变量ΔT2最大值为纵坐标，以标准样本中的稀有细胞数个为横坐标，绘制孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线，该曲线如附图3所示，以检测本方法的灵敏度。

为与本发明的效果进行对比，没有采用带温控装置的低场核磁共振仪的测试数据如下:

可以看出，采用带温控装置的低场核磁共振仪对细胞抗原和磁珠偶联的抗体进行实时检测后，我们将最低检测下限从5个细胞提升到到1个细胞，ΔT2的最大值也有大幅度提升，检测灵敏度大幅提高，这是我们的实时监测方法相比之前的方法有所改进的地方，这对于含量少的稀有细胞的检测具有重要意义。

(5)待检样本中稀有细胞个数和浓度得出

计算待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test，所述ΔT2_test＝T₂ ^n’-T₂ ^0’，依据上述的免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线获得的最佳孵育时间，结合获得的孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线，以及待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test，从而得出待检样本中目标稀有细胞的浓度/个数。

将孵育时间为265min的各细胞浓度梯度的标准样本的ΔT2值，对应其所含的细胞个数统计列表如下:

根据上表数据制作标准样本在该特定孵育时间下的孵育细胞个数-弛豫时间改变量曲线，如附图4所示，由附图4结合待检样本的ΔT2_test，得出待检样本细胞个数，具体来说：

ΔT2_test＝T₂ ^n’-T₂ ^0’，测得待测样本在孵育265分钟时的ΔT2_test＝15.87。通过公式y＝2.4951e^(0.4303x)，式中的y值即为15.87，计算获得本实施例中检测到的待检样本中稀有细胞数为4.3个。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (5)

1.一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)样本制备

将纯培养的目标稀有细胞，利用有限稀释法以缓冲液进行细胞个数的梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；

对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心，获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得目标稀有细胞悬浮液待检样本；

(2)免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测

取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T₂ ⁰；

取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T₂ ⁰’；

(3)免疫孵育中核磁共振弛豫时间检测

取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T₂ ⁿ，其中，n≥1，且n为整数；

取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T₂ ⁿ’，其中，n≥1，且n为整数；

(4)标准样本的免疫孵育时间-弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数-弛豫时间改变量最大值曲线的制作

以标准样本的孵育时间t为横坐标，弛豫时间值T₂ ⁿ为纵坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间T₂ ⁿ标准曲线；

计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T₂ ⁿ-T₂ ⁰，以ΔT2为纵坐标，以免疫孵育时间t为横坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间-弛豫时间改变量标准曲线，得到核磁共振造影剂与目标稀有细胞的最佳孵育时间；

以标准样本的弛豫时间改变量ΔT2最大值为纵坐标，以标准样本中的稀有细胞数个为横坐标，制作孵育细胞数-弛豫时间改变量ΔT2最大值曲线，以检测本方法的灵敏度；

(5)待检样本浓度得出

绘制最佳孵育时间下标准样本的细胞数-弛豫时间改变量标准曲线；

计算最佳孵育时间下待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test，所述ΔT2_test＝T₂ ⁿ’-T₂ ⁰’，根据ΔT2_test结合上述绘制的最佳孵育时间下标准样本的细胞数-弛豫时间改变量标准曲线，得出待检样本中目标稀有细胞的个数和浓度；所述的低场核磁共振分析仪内设有温度控制设备，通过所述的温度控制设备，控制免疫孵育的恒温温度；

所述步骤(2)和步骤(3)中，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度为20～25MHz，磁体温度为30～35℃，重复时间3～5s；

所述步骤(3)中，在恒温下进行免疫孵育的恒温温度为4～8℃，每次测定核磁共振弛豫时间的时间间隔为10～15min。

2.根据权利要求1所述的基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，步骤(2)中所使用的核磁共振造影剂为顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠。

3.根据权利要求2所述的基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，所述顺磁性或超顺磁性纳米磁珠为抗EpCAM免疫纳米磁珠、抗CD45免疫纳米磁珠、链霉亲和素纳米磁珠、叶酸修饰的磁性脂质体中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度为20.18MHz，磁体温度为35℃，重复时间为5s。

5.根据权利要求1所述的基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，所述步骤(4)和步骤(5)中，计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2和待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test时，分别取两次以上测量弛豫时间的平均值进行计算。