CN104101586B - 一种微球荧光强度标准物质的定值方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微球荧光强度标准物质的定值方法，其包括如下步骤：(1)制备微球荧光强度标准物质；(2)测定荧光素粉末纯度，以备计算配制荧光素标准母液；(3)校准荧光分光光度计，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线；(4)测定微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度；(5)测量样品荧光响应值，计算样品中的荧光素浓度和每个微球荧光强度标准物质颗粒所携带的荧光分子数MESF。本发明定值方法具有良好的准确性、可靠性和量值溯源性。

Description

一种微球荧光强度标准物质的定值方法

技术领域

本发明涉及一种标准物质的定值方法，特别是涉及一种微球荧光强度标准物质的定值方法。

背景技术

流式细胞分析(Flow cytometry，FCM)是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，可对单个细胞准确的定量分析和分类。

流式细胞分析在医学基础、临床及科学研究中有着广泛的应用前景。在流式细胞仪的绝对定量分析中，采用了定量荧光素分子微球法，在该方法中需要特制的包含有荧光素分子的微球标准物质，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同数量荧光素分子的混合微球；在流式细胞仪仪器设置相同的条件下测定此微球标准物质及待测细胞的荧光响应值，根据微球上的荧光素分子数和与之对应的对数荧光响应值计算回归方程，得到待测细胞的生理参数。可以看到，具有特定荧光响应值的微球标准物质是实现此项测量的关键技术标准。目前流式细胞仪被广泛应用于国内外的临床医学检验、生物科学研究等重要领域中，其主要计量性能包括仪器荧光分辨率、灵敏度、光路及液流准直行、光电倍增管稳定性等。上述计量性能的好坏直接影响仪器测量结果的准确与否，在一些临床实验室需要对上述性能参数进行必要的质量控制和评价。目前国内没有相关的计量标准和检定规程，无法保证仪器量值的准确性和可靠性。

发明内容

本发明的目的是提供一种微球荧光强度标准物质的定值方法。

一种微球荧光强度标准物质的定值方法，包括如下步骤：

(1)制备微球荧光强度标准物质；

(2)测定荧光素粉末纯度，以备计算配制荧光素标准母液；

(3)校准荧光分光光度计，配制荧光素标准母液，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线；

(4)测定微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度：用PBS溶液将微球荧光强度标准物质稀释得到悬浊液，用移液器吸取所述悬浊液置于网格滤膜上，并进行抽滤，将所述悬浊液中的颗粒物全部截留于所述网格滤膜上，然后对所述网格滤膜上的颗粒物进行计数，利用公式Ⅰ计算得到标准物质的颗粒数量浓度C_N：

$C_N=\frac{N}{V}\×f$ 公式Ⅰ

C_N：微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，ml^-1；

N：颗粒数量计数值；

V：移液器吸取悬浊液的体积，ml；

f：稀释倍数；

(5)测量样品荧光响应值，根据荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线得到样品中的荧光素浓度，再根据标准物质的颗粒数量浓度C_N计算得到每个微球荧光强度标准物质颗粒所携带的荧光分子数MESF。

本发明所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其中，所述步骤(1)具体步骤如下：

将异丙醇和蒸馏水按照重量比为0.2～2.0的比例配制成异丙醇水溶液，然后向100g所述异丙醇水溶液中加入5g～15g醋酸乙烯酯单体，0.5g～2.0g聚苯乙烯基吡咯烷酮和0.1g～0.3g过硫酸钾，在40℃～80℃条件下反应10h后，在80℃下烘干得到微球；称取1g～10g的所述微球，将其悬浮于300g质量分数为5％～20％的NaOH甲醇溶液中，在20℃～80℃条件下水解5h，然后用蒸馏水洗涤，再在80℃下烘干得到标称值为7μm的表面携带羟基的微球；量取0.1g～5g的所述表面携带羟基的微球加入到50ml～1000ml的异硫氰酸荧光素FITC缓冲液中，在20℃～50℃下培养3h后用浓度为20mmol/L的PBS溶液离心洗涤，得到荧光微球，所述离心转速为5000r/min～15000r/min；最后将所述荧光微球分散于100ml～500ml浓度为20mmol/L的PBS缓冲液中，得到微球荧光强度标准物质，并用显微镜检验微球荧光强度标准物质上羟基携带情况。

本发明所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其中，所述步骤(2)具体步骤如下：

采用定量核磁共振法测定荧光素粉末纯度，所述定量核磁共振法的内标为尼泊金乙酯国家标准物质，测定参数为：激发脉冲角度30°,时间域数据点为32k,扫描宽度为9615.385Hz,弛豫延迟32s,累计采样16次,探头温度为298K,滤波宽带为125kHz,频率域数据点为16k。

本发明所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其中，所述步骤(3)具体步骤如下：

所述校准荧光分光光度计的主要步骤为重量法配置、缓冲溶液稀释；在25℃条件下配制pH为9.54，浓度为0.1mol/L的硼酸缓冲液，准确称取5.796mg荧光素粉末溶解于271.34g所述的硼酸缓冲液中，得到浓度为58～61μmol/kg的荧光素标准母液，再用浓度为20mmol/L的PBS缓冲液将所述荧光素标准母液稀释得到6种不同浓度的荧光素标准液，所述6种不同浓度的荧光标准液浓度分别为：2×10^-8mol/kg、1×10^-8mol/kg、5×10^-9mol/kg、2×10^-9mol/kg、1×10^-9mol/kg、5×10^-10mol/kg，用荧光分光光度计分别测量所述6种不同浓度的荧光标准液的仪器荧光响应值，以荧光标准液浓度值和仪器荧光响应值分别为X轴和Y轴，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线。

本发明所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其中，所述步骤(4)具体步骤如下：

用浓度为20mmol/L的PBS溶液将微球荧光强度标准物质稀释10～1000倍，得到悬浊液，用移液器吸取体积为0.2ml～5ml的所述悬浊液置于0.1μm的网格滤膜上，并进行抽滤，所述抽滤抽气流速为1L/min～10L/min，将所述悬浊液中的颗粒物全部截留于所述网格滤膜上，然后将带有颗粒物的网格滤膜置于光学显微镜载物台上，逐格进行成像，并对颗粒数量进行计数，利用公式Ⅰ计算得到标准物质的颗粒数量浓度C_N：

本发明所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其中，所述步骤(5)具体步骤如下：用20mmol/L的PBS缓冲液将所述微球荧光强度标准物质稀释至2×10⁵个/ml～2×10⁶个/ml，用校准后的荧光分光光度计测量所述稀释后微球荧光强度标准物质的荧光响应值，再根据仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线，得到所述微球荧光强度标准物质的荧光素浓度C_E；最后根据公式Ⅱ计算出所述微球荧光强度标准物质中每个颗粒携带的荧光分子数MESF：

$\mathrm{MESF}=\frac{6.0221\×{10}^{23}}{1000}\×\frac{C_E}{C_N}$ 公式Ⅱ

C_E：根据校准曲线，得到的微球荧光强度标准物质的荧光素浓度，mol/kg；

C_N：微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，ml^-1。

本发明与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

步骤(1)制备微球荧光强度标准物质中通过控制异硫氰酸荧光素FITC缓冲液的加入量，可以得到具有不同荧光响应值的微球，采用可控的分散聚合法制备得到粒径分布标准偏差较小(<1.0％)的单分散聚苯乙烯微球，保证微球荧光响应值的均匀性，且异硫氰酸荧光素FITC分子通过化学键和的方式牢固结合于微球表面，具有很好的稳定性。

步骤(2)采用定量核磁共振法测定荧光素粉末纯度可实现荧光素纯度的定量检测，检测结果可溯源至国家计量标准，且具有较小的测量不确定度。

步骤(4)测定微球荧光强度标准物质数量浓度中，通过将颗粒截留于所述网格滤膜技术，可避免由于颗粒运动、不同景深等问题而造成的颗粒重复测量或被遗漏测量的问题，保证测量结果的可靠性。

步骤(3)和步骤(5)中，荧光标准液浓度和微球荧光强度标准物质均采用PBS液进行稀释，可有效避免荧光素所处微环境变化造成的荧光量子效应差异，保证标准物质定值结果的可靠性。

在标准物质定值中，采用光学显微镜法测量标准物质中微球浓度，采用重量法配置、核磁定量分析等技术测量得到标准物质中每个颗粒携带的荧光分子数，提高定值结果的准确性和可靠性，标准物质定值结果可最终溯源至SI单位。

下面结合附图对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中标称值为7μm的微球荧光强度标准物质的荧光显微镜检验结果；

图2为本发明中荧光素粉末的定量核磁共振谱；

图3为本发明中仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线。

具体实施方式

实施例1：

一种微球荧光强度标准物质的定值方法，其包括如下步骤：

(1)制备微球荧光强度标准物质；

(2)测定荧光素粉末纯度，以备计算配制荧光素标准母液；

(3)校准荧光分光光度计，配制荧光素标准母液，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线；

(4)测定微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度：用PBS溶液将微球荧光强度标准物质稀释得到悬浊液，用移液器吸取所述悬浊液置于网格滤膜上，并进行抽滤，将所述悬浊液中的颗粒物全部截留于所述网格滤膜上，然后对所述网格滤膜上的颗粒物进行计数，利用公式Ⅰ计算得到标准物质的颗粒数量浓度C_N：

$C_N=\frac{N}{V}\&times;f$ 公式Ⅰ

C_N：微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，ml^-1；

N：颗粒数量计数值；

V：移液器吸取悬浊液的体积，ml；

f：稀释倍数；

(5)测量样品荧光响应值，根据荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线得到样品中的荧光素浓度，再根据标准物质的颗粒数量浓度C_N计算得到每个微球荧光强度标准物质颗粒所携带的荧光分子数MESF。

实施例2

一种微球荧光强度标准物质的定值方法，其包括如下步骤：

(1)制备微球荧光强度标准物质：

将异丙醇和蒸馏水按照重量比为0.2～2.0的比例配制成异丙醇水溶液，然后向100g所述异丙醇水溶液中加入5g～15g醋酸乙烯酯单体，0.5g～2.0g聚苯乙烯基吡咯烷酮和0.1g～0.3g过硫酸钾，在40℃～80℃条件下反应10h后，在80℃下烘干得到微球；称取1g～10g的所述微球，将其悬浮于300g质量分数为5％～20％的NaOH甲醇溶液中，在20℃～80℃条件下水解5h，然后用蒸馏水洗涤，再在80℃下烘干得到标称值为7μm的表面携带羟基的微球；量取0.1g～5g的所述表面携带羟基的微球加入到50ml～1000ml的异硫氰酸荧光素FITC缓冲液中，在20℃～50℃下培养3h后用浓度为20mmol/L的PBS溶液离心洗涤，得到荧光微球，所述离心转速为5000r/min～15000r/min；最后将所述荧光微球分散于100ml～500ml浓度为20mmol/L的PBS缓冲液中，得到微球荧光强度标准物质，并用显微镜检验微球荧光强度标准物质上羟基携带情况，测得的荧光强度标准物质的荧光显微镜检验结果如图1所示；

(2)测定荧光素粉末纯度，以备计算配制荧光素标准母液：

采用定量核磁共振法测定荧光素粉末纯度，所述定量核磁共振法的内标为尼泊金乙酯国家标准物质，测定参数为：激发脉冲角度30°,时间域数据点为32k,扫描宽度为9615.385Hz,弛豫延迟32s,累计采样16次,探头温度为298K,滤波宽带为125kHz,频率域数据点为16k，得到的荧光素粉末的定量核磁共振谱如图2所示，其中图2中横坐标为化学位移，单位：ppm；纵坐标为信号强度，无单位量纲；

(3)校准荧光分光光度计，配制荧光素标准母液，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线：

校准荧光分光光度计的主要步骤为重量法配置、缓冲溶液稀释；在25℃条件下配制pH为9.54，浓度为0.1mol/L的硼酸缓冲液，准确称取5.796mg荧光素粉末溶解于271.34g所述的硼酸缓冲液中，得到浓度为58～61μmol/kg的荧光素标准母液，再用浓度为20mmol/L的PBS缓冲液将所述荧光素标准母液稀释得到6种不同浓度的荧光素标准液，所述6种不同浓度的荧光标准液浓度分别为：2×10^-8mol/kg、1×10^-8mol/kg、5×10^-9mol/kg、2×10^-9mol/kg、1×10^-9mol/kg、5×10^-10mol/kg，用荧光分光光度计分别测量所述6种不同浓度的荧光标准液的仪器荧光响应值，以荧光标准液浓度值和仪器荧光响应值分别为X轴和Y轴，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线，所述标准曲线如图3所示；

(4)测定微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度：

用浓度为20mmol/L的PBS溶液将微球荧光强度标准物质稀释10～1000倍，得到悬浊液，用移液器吸取体积为0.2ml～5ml的所述悬浊液置于0.1μm的网格滤膜上，并进行抽滤，所述抽滤抽气流速为1L/min～10L/min，将所述悬浊液中的颗粒物全部截留于所述网格滤膜上，然后将带有颗粒物的网格滤膜置于光学显微镜载物台上，逐格进行成像，并对颗粒数量进行计数，利用公式Ⅰ计算得到标准物质的颗粒数量浓度C_N：

$C_N=\frac{N}{V}\&times;f$ 公式Ⅰ

C_N：微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，ml^-1；

N：颗粒数量计数值；

V：移液器吸取悬浊液的体积，ml；

f：稀释倍数；

(5)测量样品荧光响应值，

根据荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线得到样品中的荧光素浓度，再根据标准物质的颗粒数量浓度C_N计算得到每个微球荧光强度标准物质颗粒所携带的荧光分子数MESF：

用20mmol/L的PBS缓冲液将所述微球荧光强度标准物质稀释至2×10⁵个/ml～2×10⁶个/ml，用校准后的荧光分光光度计测量所述稀释后微球荧光强度标准物质的荧光响应值，再根据仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线，得到所述微球荧光强度标准物质的荧光素浓度C_E；最后根据公式Ⅱ计算出所述微球荧光强度标准物质中每个颗粒携带的荧光分子数MESF：

$\mathrm{MESF}=\frac{6.0221\&times;{10}^{23}}{1000}\&times;\frac{C_E}{C_N}$ 公式Ⅱ

C_E：根据校准曲线，得到的微球荧光强度标准物质的荧光素浓度，mol/kg；

C_N：微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，ml^-1

本实施例中所涉及到的参数数值如下：N＝4000，V＝0.2ml，f＝1000，带入公式Ⅰ中计算得到C_N＝2×10⁷ml^-1，根据图3所示校准曲线得到C_E＝2×10^-9mol/kg，将C_N和C_E带入公式Ⅱ计算出每个颗粒携带的荧光分子数为：MESF＝6.0221×10⁴。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备微球荧光强度标准物质：将异丙醇和蒸馏水按照重量比为0.2～2.0的比例配制成异丙醇水溶液，然后向100g所述异丙醇水溶液中加入5g～15g醋酸乙烯酯单体，0.5g～2.0g聚苯乙烯基吡咯烷酮和0.1g～0.3g过硫酸钾，在40℃～80℃条件下反应10h后，在80℃下烘干得到微球；称取1g～10g的所述微球，将其悬浮于300g质量分数为5％～20％的NaOH甲醇溶液中，在20℃～80℃条件下水解5h，然后用蒸馏水洗涤，再在80℃下烘干得到标称值为7μm的表面携带羟基的微球；量取0.1g～5g的所述表面携带羟基的微球加入到50ml～1000ml的异硫氰酸荧光素FITC缓冲液中，在20℃～50℃下培养3h后用浓度为20mmol/L的PBS溶液离心洗涤，得到荧光微球，所述离心转速为5000r/min～15000r/min；最后将所述荧光微球分散于100ml～500ml浓度为20mmol/L的PBS缓冲液中，得到微球荧光强度标准物质，并用显微镜检验微球荧光强度标准物质上羟基携带情况；

(2)测定荧光素粉末纯度，以备计算配制荧光素标准母液；

(3)校准荧光分光光度计，配制荧光素标准母液，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线；

(4)测定微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度：用PBS溶液将微球荧光强度标准物质稀释得到悬浊液，用移液器吸取所述悬浊液置于网格滤膜上，并进行抽滤，将所述悬浊液中的颗粒物全部截留于所述网格滤膜上，然后对所述网格滤膜上的颗粒物进行计数，利用公式Ⅰ计算得到标准物质的颗粒数量浓度C_N：

$C_N=\frac{N}{V}\&times;f$ 公式Ⅰ

C_N：微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，ml^-1；

N：颗粒数量计数值；

V：移液器吸取悬浊液的体积，ml；

f：稀释倍数；

(5)测量样品荧光响应值，根据荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线得到样品中的荧光素浓度，再根据标准物质的颗粒数量浓度C_N计算得到每个微球荧光强度标准物质颗粒所携带的荧光分子数MESF。

2.根据权利要求1所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，所述步骤(2)具体步骤如下：

采用定量核磁共振法测定荧光素粉末纯度，所述定量核磁共振法的内标为尼泊金乙酯国家标准物质，测定参数为：激发脉冲角度30°,时间域数据点为32k,扫描宽度为9615.385Hz,弛豫延迟32s,累计采样16次,探头温度为298K,滤波宽带为125kHz,频率域数据点为16k。

3.根据权利要求2所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，所述步骤(3)具体步骤如下：校准荧光分光光度计；在25℃条件下配制pH为9.54，浓度为0.1mol/L的硼酸缓冲液，准确称取5.796mg荧光素粉末溶解于271.34g所述的硼酸缓冲液中，得到浓度为58～61μmol/kg的荧光素标准母液，再用浓度为20mmol/L的PBS缓冲液将所述荧光素标准母液稀释得到6种不同浓度的荧光素标准液，所述6种不同浓度的荧光标准液浓度分别为：2×10^-8mol/kg、1×10^-8mol/kg、5×10^-9mol/kg、2×10^-9mol/kg、1×10^-9mol/kg、5×10^-10mol/kg，用荧光分光光度计分别测量所述6种不同浓度的荧光标准液的仪器荧光响应值，以荧光标准液浓度值和仪器荧光响应值分别为X轴和Y轴，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线。

4.根据权利要求1所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，所述步骤

(4)具体步骤如下：用浓度为20mmol/L的PBS溶液将微球荧光强度标准物质稀释10～1000倍，得到悬浊液，用移液器吸取体积为0.2ml～5ml的所述悬浊液置于0.1μm的网格滤膜上，并进行抽滤，所述抽滤抽气流速为1L/min～10L/min，将所述悬浊液中的颗粒物全部截留于所述网格滤膜上，然后将带有颗粒物的网格滤膜置于光学显微镜载物台上，逐格进行成像，并对颗粒数量进行计数，利用公式Ⅰ计算得到标准物质的颗粒数量浓度C_N。

5.根据权利要求4所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其特征在于，所述步骤(5)具体步骤如下：用20mmol/L的PBS缓冲液将所述微球荧光强度标准物质稀释至2×10⁵个/ml～2×10⁶个/ml，用校准后的荧光分光光度计测量所述稀释后微球荧光强度标准物质的荧光响应值，再根据仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线，得到所述微球荧光强度标准物质的荧光素浓度C_E；最后根据公式Ⅱ计算出所述微球荧光强度标准物质中每个颗粒携带的荧光分子数MESF：

$MESF=\frac{6.0221\&times;{10}^{23}}{1000}\&times;\frac{C_E}{C_N}$ 公式Ⅱ

C_E：根据校准曲线，得到的微球荧光强度标准物质的荧光素浓度，mol/kg；C_N：微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，ml^-1。