CN113075184B - 罗丹明b溶液相对荧光发射强度标准物质及其制备方法与应用 - Google Patents

罗丹明b溶液相对荧光发射强度标准物质及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质及其制备方法与应用。本发明提供的罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质可以提供在500‑630nm激发下，发射波长覆盖范围为520‑830nm，波长间隔为1nm的标准相对荧光发射强度值，可以很好地满足相关仪器红光及近红外波段的校准需求。本发明提供的罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质主要是作为量值传递的标准，满足目前研究和检测的需要，可用于荧光仪器(如光谱仪、分光光度计、酶标仪、基因扩增仪、免疫分析仪等)的检测器、检测模块的校准、分析方法评价，以及生物、食品、药品、化工产品及化妆品中的质量控制等方面。

Description

罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于分子荧光分析计量技术领域，具体涉及一种罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质及其制备方法与应用。
背景技术
荧光光谱仪/荧光分光光度计是光谱分析工作中一种重要且有效的分析仪器，荧光检测具有灵敏度高、选择性强、试样量少、无损检测和方法简便等优点。光谱分析不仅在基础研究中是一门重要的学科，在工、农、医、环保、商检、安全和国防等领域也有很多应用。近年荧光光谱的新技术、新器件、新工艺不断涌现，应用面越来越大。光致发光、电致发光、场致发光、激光光谱、时间分辨光谱等方法不断改进完善。而荧光光谱仪的波长校准及相对强度校准是这一切分析和应用的基础。
目前JJG 537-2006《荧光分光光度计检定规程》规定了荧光分光光度计的计量性能要求，包括了波长示值误差与重复性、检出极限、测量线性、荧光光谱峰值强度重复性及稳定性。其中在仪器波长的示值误差与重复性的检定时，采用氙灯/汞灯的谱线，利用其特征原子谱线作为波长标定，或是采用萘-甲醇标准物质，通过测定其最大激发波长290nm及其最大发射波长331nm作为波长标定。而在测定检出极限及荧光光谱峰值强度重复性时，选用的GBW(E)130100硫酸奎宁荧光标准物质的最大激发波长350nm，最大发射波长为450nm，覆盖波长范围为(375～675)nm。
在实际检定校准工作中，近年来遇到较多关于每个波长下发光强度的精确校准需求。然而萘-甲醇标准物质仅仅适用于波长的校准，而对于GBW(E)130100硫酸奎宁荧光标准物质在395nm以下或是在565nm以上，其发光亮度的标准值已经在0.1以下，带来了很大的不确定度，而且标准值的波长间隔长达5nm，限制了其更为精细的应用。由于上述性质的限制，硫酸奎宁标准物质在一些生物体系，特别是荧光标志物的免疫分析上无能为力，主要原因是由于许多生物体及其组织的自发荧光处于紫外和可见光区域，而红光、近红外光的应用需求越来越大，硫酸奎宁荧光标准溶液已经远远无法满足要求。目前NIST(美国国家标准与技术研究院，National Institute ofStandards and Technology)开发了波长间隔为1nm的标准物质SRM2944替代了同为硫酸奎宁成分的标准物质SRM936，在330.8nm的激发光照射下，其发射波长覆盖范围为(350～640)nm；还开发了适用于红光波段的标准物质SRM2944，在515nm的激发光照射下，其发射波长覆盖范围为(530～830)nm，波长间隔为1nm，这很好地满足了红光及近红外波段的校准需求。但国内仍旧欠缺相关标准物质。
罗丹明B，IUPAC命名为：[9-(2-羧基苯基)-6-二乙氨基-3-亚戊基]-二乙基氯化铵，CAS号为81-88-9。是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料。易溶于水、乙醇，微溶于丙酮、氯仿、盐酸和氢氧化钠溶液。水溶液为蓝红色，稀释后有强烈荧光，醇溶液为红色荧光。常用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。目前国内有关罗丹明B标准物质，有GBW(E)100371罗丹明B纯度标准物质及GBW(E)100374罗丹明B溶液标准物质，其量值是纯度和浓度，未涉及有相对荧光发射强度。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质，在500-630nm的激发光照射下，其发射波长覆盖范围可涉及520-830nm，波长间隔为1nm，可以很好地满足相关仪器红光及近红外波段的校准需求。本发明提供的相对荧光发射强度标准物质主要是作为量值传递的标准，满足目前研究和检测的需要，可用于荧光仪器(光谱仪、分光光度计、酶标仪、基因扩增仪、免疫分析仪等)的检测器、检测模块的校准、分析方法评价，以及生物、食品、药品、化工产品及化妆品中的质量控制等方面。
根据本发明的一个方面，提供了一种罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质，该罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质可提供在500-630nm激发下，发射波长覆盖范围为520-830nm，波长间隔为1nm的标准相对荧光发射强度值。
罗丹明B的发光范围覆盖红光及部分近红外区域，且其荧光发射峰在830nm之前具有较为完整的峰型，可以利用国际标准物质进行溯源，此外，罗丹明B的发光强度较大，在极性适中的溶剂中，其荧光量子产率(指光化学反应中光量子的利用率，定义为每吸收一个量子所产生的反应物的分子数，这通常是对于特定的波长而言，即量子产率＝(生成产物的分子数)/(吸收的量子数))高于70％，具有良好的光致发光效率，以罗丹明B作为原料研制相对荧光发射强度标准物质，制得的相对荧光发射强度标准物质发射波长覆盖范围广，性能良好，能够长期稳定，受到光漂白影响小，浓度若在小范围内变化(10-5～10-2)，量值不会发生变化。
在一些实施方式中，罗丹明B溶液的溶剂可以选自水、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中的至少一种。随着溶剂极性的增加，罗丹明B的最大吸收和发射波长红移，而荧光强度降低。因此，本发明优选选择水、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等极性适中的溶剂配置罗丹明B溶液。
在一些实施方式中，罗丹明B溶液的浓度可以为10-7-1mol/L。浓度过低时，荧光强度较低，基线噪声会对仪器测量产生较大影响；浓度过高时，荧光强度较高，一是可能超过仪器测量上限，二是容易产生自吸收自猝灭现象。
选用不同溶剂制得的浓度不同的罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质的激发波长和发射波长覆盖范围(即发射波长范围)不同，具体如表18所示，因此，通过选用不同的溶剂，可以利用罗丹明B制得可提供在500-630nm激发下，发射波长覆盖范围为520-830nm，波长间隔为1nm的标准相对荧光发射强度值的相对荧光发射强度标准物质。
在一些实施方式中，溶剂可以为甲醇。溶剂极性太强则部分荧光发射超过830nm无法溯源，且荧光强度较低需要增加浓度导致荧光自猝灭效应。罗丹明B在甲醇中溶解度最好，荧光发射峰在830nm之前具有较为完整的峰型，用于制备相对荧光发射强度标准物质时，可以利用国际标准物质进行溯源，量值准确。
在一些实施方式中，罗丹明B甲醇溶液的浓度可以为0.100mg/mL。当罗丹明B甲醇溶液的浓度为0.100mg/mL(即约为2.09×10-4mol/L)时，荧光强度适中且稳定，最大发射强度波长位于594nm(橙黄色光)，发射波长覆盖范围为(545～830)nm，同时，其荧光强度与NIST的SRM2944荧光标准物质的荧光强度位于同一量级，基本一致，使得相对荧光发射强度标准物质可以利用国际标准物质进行溯源。
本发明提供的浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质可以提供在515nm激发下，发射波长覆盖范围为(545～830)nm，波长间隔为1nm的标准相对荧光发射强度值，其在545-830nm波长范围内、波长间隔为1nm的标准相对荧光发射强度值如表17所示。
根据本发明的另一个方面，提供了一种罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质的制备方法，包括如下步骤：
将罗丹明B配制成罗丹明B溶液；其中，罗丹明B溶液的发射光谱不含杂质荧光峰(即罗丹明B溶液中，不含有会猝灭荧光或者除罗丹明B以外的具有荧光的杂质，如罗丹明6G、藻胆素、荧光素、DPA、DCM等等物质)；
对配置的罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值进行均匀性检验、稳定性考察、定值和不确定度分析，若罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值均能够满足标准物质的要求，即得罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质；
其中，罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值的测量步骤包括：
(1)在(25.0±0.5)℃的实验温度条件下，利用检定合格的荧光光谱仪，在SRM2943标准物质证书说明要求的激发光照射下，设置激发波长为330.3nm，发射波长检测范围为350-640nm，激发侧狭缝、发射侧狭缝同时设为3nm或者同时设为2.5nm，每间隔1nm采集光谱发射强度数值；然后将每个波长下的光谱发射强度除以SRM2943标准物质的最大光谱发射强度，得到各波长下的相对发射强度；任取3个SRM2943标准物质样品，每个样品平行测定3次，计算各波长下的平均相对发射强度值；最后将SRM2943标准物质证书中给出的各波长下的相对发射强度量值除以对应波长的平均相对发射强度值计算得到SRM2943标准物质在350-640nm波长范围内各波长下的校正因子F值；
(2)在(25.0±0.5)℃的实验温度条件下，利用检定合格的的荧光光谱仪，在SRM2944标准物质证书说明要求的激发光照射下，设置激发波长为515nm，发射波长检测范围为530-830nm，激发侧狭缝、发射侧狭缝同时设为3nm或者同时设为2.5nm，每间隔1nm采集光谱发射强度数值；然后将每个波长下的光谱发射强度除以SRM2944标准物质的最大光谱发射强度，得到各波长下的相对发射强度；任取3个SRM2944标准物质样品，每个样品平行测定3次，计算各波长下的平均相对发射强度值；最后将SRM2944标准物质证书中给出的各波长下的相对发射强度量值除以对应波长的平均相对发射强度值计算得到SRM2944标准物质在530-830nm波长范围内各波长下的校正因子F值；
(3)在(25.0±0.5)℃的实验温度条件下，利用检定合格的的荧光光谱仪，将罗丹明B溶液放置在样品室中，设置对应的激发波长和发射波长检测范围，激发侧狭缝、发射侧狭缝同时设为3nm或者同时设为2.5nm，每间隔1nm采集光谱发射强度数值；然后将每个波长下的光谱发射强度乘以对应波长的校正因子F值后再除以罗丹明B溶液的最大光谱发射强度与其对应波长的校正因子F值的乘积，得到各波长下的相对发射强度，其中，对于520-529nm波长范围内的各波长，选择SRM2943标准物质对应波长的校正因子F值计算罗丹明B溶液相对发射强度，对于530-640nm波长范围内的各波长，可以任意选择SRM2943标准物质对应波长的校正因子F值或者SRM2944标准物质对应波长的校正因子F值去计算罗丹明B溶液相对发射强度，对于641-830nm波长范围内的各波长，选择SRM2944标准物质对应波长的校正因子F值计算罗丹明B溶液相对发射强度；任选3个罗丹明B溶液样品，每个样品平行测定3次，将计算得到的各波长下的平均相对发射强度值作为罗丹明B溶液对应波长下的相对荧光发射强度值的测量结果。
本发明提供的罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质的制备方法中，在520-830nm波长范围内，每次测量罗丹明B溶液的发射强度值时均采用NIST的SRM2943和/或SRM2944标准物质进行强度校准，以保证测量结果和国际标准物质量值具有可比性，可以利用国际标准物质溯源，同时，也可以避免实验室间仪器测量结果差异(如仪器偶然误差，强度波动或检测器灵敏度不同等)，从而使得每家实验室测量结果均可对照。
在一些实施方式中，罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值的定值包括如下步骤：
S1、利用n家实验室分别参照上述罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值的测量步骤(1)-(3)对罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值进行定值；其中，n≥3；
S2、分别对每家实验室定值结果进行组内正态分布分析、可疑值分析；然后对所有实验室的定值结果进行组间等精度分析、组间数据一致性检验；最后合并所有实验室的定值结果进行正态分布分析、数据异常值检验；若同时满足：每家定值实验室组内定值结果符合正态分布、每家定值实验室组内定值结果不存在可疑值、所有定值实验室定值结果组间等精度、所有定值实验室组间数据平均值一致、合并所有定值实验室的定值结果符合正态分布以及合并所有定值实验室的定值结果不存在可疑值，则将所有实验室在对应波长下的定值结果的平均值作为罗丹明B溶液的最终定值量值。
通过多家实验室采用一种相同原理的方法定值、实验大数据统计平均值的联合定值方式对罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质，可以有效提高量值的可信度和准确性。
在一些实施方式中，罗丹明B溶液的溶剂可以选自水、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中的至少一种。
在一些实施方式中，利用不同溶剂配制得到的罗丹明B溶液的激发波长和发射波长覆盖范围如表18所示。
在一些实施方式中，罗丹明B溶液的浓度可以为10-7-1mol/L。
在一些实施方式中，溶剂可以为甲醇；进一步地，罗丹明B甲醇溶液的浓度可以为10-7-1mol/L；更进一步地，罗丹明B甲醇溶液的浓度可以为0.100mg/mL。
在一些实施方式中，浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液在515nm激发下，在545-830nm的发射波长覆盖范围内、波长间隔为1nm的标准相对荧光发射强度值如表17所示。
在一些实施方式中，浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的制备方法可以包括如下步骤：
将罗丹明B纯度标准物质利用色谱纯甲醇配制成浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液；
对配置的罗丹明B甲醇溶液在515nm激发下，在545-830nm波长范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值进行均匀性检验、稳定性考察、8家实验室联合定值和不确定度分析，若罗丹明B甲醇溶液在545-830nm波长范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值均能够满足标准物质的要求，即得罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质。
在一些实施方式中，对罗丹明B甲醇溶液545-830nm波长范围内、每隔1nm的各波长的相对荧光发射强度值进行测量和定值时，均以SRM2944标准物质进行强度校准。
在一些实施方式中，采用8家资质实验室联合定值的定值方式对罗丹明B甲醇溶液进行定值。
本发明提供的相对荧光发射强度标准物质可以用于制备荧光标准物质或直接作为荧光标准物质使用，作为荧光标准物质使用时，其测量结果与国内外现有的荧光标准物质的测量结果在不确定度范围内一致，适用于样品的测量且测量方法稳定、方便、实用。本发明提供的相对荧光发射强度标准物质可满足生物、食品、药品、日化、环境保护及化工产品研究和检测的需要，可用于相关荧光仪器(如光谱仪、分光光度计、酶标仪、基因扩增仪、免疫分析仪等)的检测器、检测模块的校准、分析方法评价，为统一相关量值发挥应有的作用。
附图说明
图1为广东省计量科学研究院利用Nanolog光谱仪测得的所有定值波长下浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质候选物的校正相对发射光谱；
图2为SRM 2941和GBW(E)130100硫酸奎宁荧光标准物质的量值图；
图3为GBW(E)130100的校正相对发射光谱与标准发射光谱对比图；
图4为分别使用SRM2943及SRM2944校准荧光光谱仪在(530～640)nm波长范围的能量校正因子F；
图5为不同仪器3nm光栅狭缝及2.5nm光栅狭缝条件下罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的发射光谱；
图6为不同光源条件下罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的发射光谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例以及附图对本发明作进一步详细的说明。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
本发明提供的相对荧光发射强度标准物质的制备方法中，定值依据及模型方法如下：
1、选用SRM2943及SRM2944标准物质作为校准的依据
相对荧光发射强度标准物质的研制中采用8家资质实验室联合定值，每一家实验室使用的荧光光谱仪均于NIST的SRM2943及SRM2944荧光标准物质在定值的相同发射波长下校准。
选用SRM2943及SRM2944标准物质作为校准依据包括：(1)SRM2943及SRM2944及要研制的相对荧光发射强度标准物质的应用领域都是荧光发射光谱的相对发射强度校准，具有相同的应用前景；(2)SRM2943及SRM2944及要研制的相对荧光发射强度标准物质在使用时，选用的激发波长相近，发射光谱对应的波长范围相同；(3)SRM2943及SRM2944的尺寸为12.5mm×12.5mm×45.0mm的均匀固态晶体，而要研制的相对荧光发射强度标准物质在使用时为均一的溶液的形式填装在尺寸为12.5mm×12.5mm×45.0mm的石英比色皿中，二者尺寸一致；(4)利用同一台荧光光谱仪在测量时，NIST标准物质及要研制的相对荧光发射强度标准物质的荧光强度是一致的，例如SRM2944的荧光发射强度(绝对值)约1.51×106，而0.1mg/mL的罗丹明B甲醇溶液的的荧光发射强度(绝对值)约1.42×106，二者位于同一量级，基本一致；(5)SRM2943及SRM2944为固体晶体，其基质为透射玻璃；而罗丹明B使用石英比色皿，或是选取的甲醇等溶剂，在定值的波长范围内均没有荧光发射，因此不会对定值产生干扰。
2、定值模型及步骤
具体定值步骤如下：
根据NIST《Standard Reference Material 2943Certificate》、《StandardReference Material 2944Certificate》中的使用要求及Derose P C,etal.Characterization ofstandard reference material 2944,Bi-ion-doped glass,spectral correction standard for red fluorescence[J].J.Lumin.,2013,141:9-14的相关描述，保证实验室温度为(25.0±0.5)℃，利用荧光光谱仪，在证书说明要求的激发光照射下，设置对应的激发波长以及激发侧、发射侧狭缝分别为3nm及3nm，测量SRM2943及SRM2944标准物质在证书范围内波长范围内的发射光谱。将每个波长下的光谱强度除以最大光谱发射强度，得到各波长下的相对发射强度。将SRM2943及SRM 2944标准物质证书中给出的相对发射强度量值除以对应波长下的相对发射强度值计算得到的校正因子F值。
能量校正因子：
Figure BDA0002995382740000061
式中：
Figure BDA0002995382740000071
——平均相对发射强度测量值；Er——证书中相对发射强度的参考值；
利用荧光光谱仪，将激发侧波长设定在荧光标准物质候选物的激发波长处，将荧光标准物质候选物放置在样品室中，设置激发侧、发射侧狭缝分别为3nm及3nm，对发射波长范围采集发射光谱，将得到的相对发射光谱乘以校正因子F，即可得到荧光标准物质的相对发射强度值。任意选取3瓶荧光标准物质，每瓶平行测定3次，计算其相对发射强度值。再计算平均相对发射强度值，作为荧光标准物质的定值结果。
以广东省计量科学研究院对浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质在600nm处的定值计算为例进行说明：
①利用Nanolog光谱仪，在515nm激发下测得SRM2944的荧光发射光谱，发现其最大发射波长位于704nm，与证书相符。其中一次测量时704nm处的荧光发射强度为3.136×106，600nm的荧光发射强度为4.065×105，故而600nm处的相对发射强度为4.065×105/3.136×106＝0.1296。
②同理分别计算3个样品3次平行测定，共计9次实验时600nm处的平均相对发射强度为0.1311。
③查找SRM2944证书，600nm处的相对发射强度为0.1418。根据公式(1)，计算得到600nm处的能量校正因子F＝0.1418/0.1311＝1.082。同理可计算得到594nm处的能量校正因子F＝1.011。
④利用Nanolog光谱仪，在515nm激发下罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质候选物的发射光谱，发现其最大发射波长位于594nm，其中一次测量时594nm处的荧光发射强度为2.120×106，600nm的荧光发射强度为1.809×106，故而600nm处的校准后相对发射强度为(1.809×106×1.082)/(2.120×106×1.011)＝0.9132。
同理分别计算3个样品3次平行测定，共计9次实验时600nm处的平均相对发射强度为0.9172，将该数据作为该定值实验室罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质候选物600nm处的相对发射强度的定值结果。
其余波长下的相对发射强度计算过程与上述过程类似。所有定值波长下罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质候选物的校正相对发射光谱如图1所示。
其他定值单位的定值计算过程与上述过程类似。
3、溯源定值结果的合理性评估
3.1相对强度差
在每家单位联合定值时，均采用与NIST的SRM 2943或SRM 2944荧光标准物质在相同发射波长下的相对发射强度进行校准，即校正仪器在相同波长下的测定发射强度。但考虑到由于SRM 2943或SRM2944与本发明中的罗丹明B不是同一物质，因此在相同发射波长下的发射强度相差较大。为了证明上述校准的合理性，选取了几种已有准确量值的荧光标准物质进行实验研究。
选用的荧光标准物质为：①NIST的SRM 2941，其可以提供在427nm的激发下，覆盖(450～650)nm的相对发射强度值，波长间隔为1nm；②GBW(E)130100硫酸奎宁荧光标准物质，其可以提供在350nm的激发下，覆盖(375～675)nm的相对发射强度值，波长间隔为5nm。二者量值如图2所示。
从图2中可以看出，虽然激发波长不同，但二者均能够重复覆盖(450～650)nm这一波长范围。特别是在某些波长下，其相对发射强度量值有较大差别，例如：450nm时，SRM2941的相对发射强度仅为0.0004，而GBW(E)130100为1.000；525nm时，SRM2941的相对发射强度为0.9941，而GBW(E)130100仅为0.303。因此本发明采用和标准物质定值时类似的校准方法，先测定NIST的SRM2941的发射光谱，计算出校正因子F；再测定GBW(E)130100的发射光谱，经过校准后与GBW(E)130100的证书量值比对，结果如图3所示。
从图3中可以看出，采用NIST的SRM2941标准物质校准以后，测量GBW(E)130100的发射光谱与标准光谱的相对发射强度量值吻合程度较好。450nm时测得相对发射强度为0.9977，符合证书规定的1.000±0.004要求；525nm出测得相对发射强度为0.3042，符合证书规定的0.303±0.002要求。说明①不同的激发波长情形，或②参考物质和研究物质的相对发射强度差较大的情形下，仍可采用上述的定值方法，因此本发明采用NIST标准物质用于定值仪器校准是合理的。
3.2SRM2943及SRM2944重复波长范围
对于不同的荧光物质而言，其激发波长、发射波长一般均不相同，因此难以用一种NIST标准物质作为校准参比覆盖全部波长范围。本发明标准物质的定值过程中，选用了两种NIST的标准物质。其中①NIST的SRM 2943，其可以提供在330.3nm的激发下，覆盖(350～640)nm的相对发射强度值，波长间隔为1nm；②NIST的SRM 2944，其可以提供在515nm的激发下，覆盖(530～830)nm的相对发射强度值，波长间隔为1nm。
利用上述两种物质对荧光光谱仪进行校准时，会存在一段重复的波长范围，即(530～640)nm。为了比较两种标准物质对波长校准的一致性，利用荧光光谱仪分别测量两种SRM标准物质的发射光谱，并计算其能量校正因子F值，结果如图4所示。
从图4中可以看出分别使用SRM2943及SRM2944校准荧光光谱仪，得到的能量校正因子F数值基本一致，两种SRM标准物质计算得到的F数值最大偏差不超过1.0％。校正后测量另一标物均落在二者证书给出的不确定度范围内。因此，对于重复的波长范围，可以任意选择SRM2943或SRM2944的相对发射强度作为校准依据。
由于罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质候选物的波长范围仅在SRM2944的覆盖范围内，因此，本发明仅采用SRM2944对荧光光谱仪进行校准。
实施例1罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的研制
1、标准物质样品制备
1.1原料及试剂
原料：GBW(E)100371罗丹明B纯度标准物质，其已经进行过相应的原料表征、均匀性、稳定性实验、严格的8家实验室联合定值分析及不确定度评定。
溶剂：色谱纯甲醇(CAS：67-56-1)，购自百灵威科技(J&K)有限公司，4L包装。
1.2设备
1.2.1标准物质制备用设备：2000mL的A级容量瓶；准确度为十万分之一天平(赛多利斯，德国)；电动移液器(Eppendorf，德国)；百级洁净台等，皆经检定合格。
1.2.2标准物质包装设备：5mL棕色安瓿瓶及安瓿融封机等设备。
1.2.3标准物质分析用设备：
(1)均匀性检验及稳定性考察所用设备：Nanolog荧光光谱仪，法国HORIBA JOBINYVON，配备无色差全反射聚焦光路及机刻平面衍射光栅。激发光源：450W无臭氧连续氙灯、标准低压汞灯；检测器：R928光电倍增管检测器(200～900nm)。
(2)联合定值单位及定值仪器：如表1所示
表1联合定值单位及定值仪器
序号 名称 仪器型号 仪器品牌
1 北京大学分析测试中心 FL3-2iHR HORIBA
2 厦门大学化学化工学院 FLS980 EDINBURGH
3 广东工业大学分析测试中心 Fluorolog3 HORIBA
4 广州万孚生物技术股份有限公司 RF5301PC SHIMADZU
5 中国广州分析测试中心 RF6000 SHIMADZU
6 浙江省计量科学研究院 FluoroMax-4 HORIBA
7 深圳市计量质量检测研究院 F7100 HITACHI
8 广东省计量科学研究院 Nanolog HORIBA
上述标准物质分析用设备均满足JJG 537-2006《荧光分光光度计检定规程》检定合格，已达到JJG 537-2006《荧光分光光度计检定规程》规定的荧光分光光度计的计量性能要求，包括了波长示值误差与重复性、检出极限、测量线性、荧光光谱峰值强度重复性及稳定性等测试。
1.3罗丹明B甲醇溶液的制备
1.3.1配制
准确称取200mg GBW(E)100371罗丹明B纯度标准物质，用色谱级甲醇溶解，并转移至2000mL容量瓶中(经过广东省计量科学研究院检定合格，A级)，甲醇定容至刻度线，混匀。
1.3.2分装
将充分混合好的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质候选物分装于5mL棕色安瓿瓶中，每支4mL，共分装约400支。
1.3.3储存与运输
该标准物质应于常温下(15～35℃)避光保存，运输时避免剧烈碰撞。
2、均匀性检验
分别从已经分装好且编上号码的罗丹明B甲醇溶液中按照头尾、中间编号随机抽取15个样品，用Nanolog荧光光谱仪进行定值测量(具体测量步骤详见下述4.1联合定值过程具体实验步骤的步骤(1)-(2))，设定激发波长515nm，设置激发和发射侧狭缝宽度均为3nm，对(545～830)nm每隔1nm测试荧光发射光谱，计算校正后的相对发射强度，共计286个数据点，每个波长测量3次，取平均值作为均匀性评价的测量结果。
本实施例仅选取其中1个发射波长的校正相对发射强度的考察过程作为代表介绍均匀性检验的过程，取用的代表性发射波长为600nm，其均匀性检验过程如下，其余波长下的均匀性检验结果类似。
2.1发射波长为600nm的相对发射强度均匀性检查
发射波长为600nm的相对发射强度均匀性检查结果列于下表2中：
表2相对发射强度均匀性实验数据(λem＝600nm)
Figure BDA0002995382740000101
在95％的置信概率下采用方差分析考察样品的均匀性，计算结果如下表3所示。
表3相对发射强度均匀性方差分析(λem＝600nm)
差异源 SS df MS F P-value Fcrit
组间 3.23E-05 14 2.31E-06 1.584 0.142 2.037
组内 4.37E-05 30 1.46E-06
总计 7.61E-05 44
由表3数据可得：
Figure BDA0002995382740000102
Figure BDA0002995382740000103
Fα(ν1,ν2)＝2.037,α＝0.05
F<Fα表明样品间不存在明显差异。
从计算可以看出：结果的统计量F值小于均匀性检验临界值Fα(14,30)：2.037，证明该标准物质是均匀的。
Figure BDA0002995382740000111
样品均匀性好，但sH和s2相近，总的不确定度必须把均匀性因素考虑进去，不均匀性所产生的标准偏差需要合成到定值最终不确定度中。
上述结果表明，600nm下的相对发射强度都是均匀的。类似地，测得在(545～830)nm下罗丹明B甲醇溶液的相对发射强度都是均匀的。表4仅列举部分波长下的均匀性计算结果。
表4部分波长下罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质均匀性检验结果
Figure BDA0002995382740000112
3、稳定性考察
标准物质研制过程中，需要用精密度高的分析方法对其进行长时间的定期考察来确定相对的稳定期限。
随机抽取罗丹明B甲醇溶液样品，用Nanolog荧光光谱仪进行定值测量(具体测量步骤详见下述4.1联合定值过程具体实验步骤的步骤(1)-(2))，设定激发波长515nm，设置激发和发射侧狭缝宽度均为3nm，对(545～830)nm每隔1nm测试荧光发射光谱，并计算校正后的相对发射强度，共计286个数据点，每个波长测量3次，取不同时间的平均值作为稳定性评价的测量结果。
本实施例仅选取其中1个发射波长的校正相对发射强度为代表介绍稳定性考察的过程，取用的代表性发射波长分别为600nm，其稳定性性检验过程如下，其余波长下的稳定性实验结果类似。本发明中选取t＝12个月来考察荧光标准物质的稳定性。
3.1发射波长为600nm的相对发射强度长期稳定性检验
发射波长为600nm的相对发射强度稳定性结果列于表5中：
表5相对发射强度稳定性实验数据(λem＝600nm)
时间/月 实验时间 样品1 样品2 样品3 平均值
0 2019.5.21 0.9163 0.9175 0.9174 0.9171
1 2019.6.22 0.9199 0.9157 0.9177 0.9178
3 2019.8.20 0.9135 0.9164 0.9185 0.9161
6 2019.11.19 0.9145 0.9178 0.9193 0.9172
9 2020.2.20 0.9215 0.9207 0.9175 0.9199
12 2020.5.21 0.9174 0.9172 0.9167 0.9171
稳定性方差分析结果如表6所示：
表6稳定性回归方差分析结果(λem＝600nm)
df SS MS F SignificanceF
回归分析 1 7.17E-07 7.17E-07 0.483 0.518
残差 5 7.42E-06 1.48E-06
总计 6 8.14E-06
由于没有一种物理/化学模型能够真实地描述该候选标准样品的降解机理，故采用直线作为经验模型。将表中数据，以x代表时间，以y代表罗丹明B相对荧光发射强度，拟合成一条直线，来判断样品的稳定性。直线的斜率为：
Figure BDA0002995382740000121
截距由下式计算：
Figure BDA0002995382740000122
直线上的点的标准偏差由下式计算：
Figure BDA0002995382740000123
取其平方根s＝1.22×10-3，斜率的不确定度为：
Figure BDA0002995382740000124
自由度f＝n-2＝4和p＝0.95(95％置信水平)的t分布因子等于2.78。
t0.95,n-2·s(b1)＝2.78×1.32×10-4＝3.6×10-4
由于|b1|＜t0.95,n-2·s(b1)，故斜率是不显著的。因而未观测到不稳定性，即表明在12个月内，该回归是不显著的，即罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的量值没有发生明显的趋势性变化，这说明本发明所采取储存条件有效地保证了罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质量值的稳定性。
有效期t＝12个月的长期稳定性的不确定度贡献即为：
u(600nm)Its＝sb·t＝9.32×10-5×12＝0.0016
上述结果表明，600nm下的量值没有发生明显的趋势性变化。类似地，测得在(545～830)nm下的相对发射强度都是稳定的，表7仅列举部分波长下的长期稳定性计算结果。
表7部分波长下罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质长期稳定性考察结果
Figure BDA0002995382740000131
3.2短期稳定性检验
短期稳定性是指在运输条件下标准物质的稳定性。
为了考察运输条件对标准物质的稳定性影响，并综合考虑到南方的高温天气以及北方的低温天气，本发明模拟了运输条件即(50±2)℃。
首先考虑的是溶剂的影响，选取的溶剂为色谱纯甲醇，其熔点为-97℃，沸点为64.7℃，故而在模拟运输条件的温度范围内几乎不会发生凝固或是沸腾等物相改变过程。
短期稳定性检验的具体的操作是随机抽取2组样品，每组6份，分别置于培养箱中，模拟运输条件，即(50±2)℃并选取常规储存条件(25±2)℃作为参照，分别保存一个星期，分别在第1、3、5、7日下午15:00左右从模拟环境中取出，待样品恢复至实验温度25℃时，测定其相对发射强度。分别对比两种不同条件对其稳定性影响，以600nm处的荧光发射强度为例，结果发现(见表8)，运输条件下，罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质量值没有明显变化。
表8罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质短期稳定性实验数据(λem＝600nm)
日数 日期 常规储存条件(25±2)℃ 运输条件(50±2)℃
0 2020.5.23 0.9177 0.9177
1 2020.5.24 0.9189 0.9189
2 2020.5.25 0.9173 0.9181
3 2020.5.26 0.9172 0.9175
5 2020.5.28 0.9175 0.9201
7 2020.5.30 0.9176 0.9176
类似地，计算可得模拟运输条件下|b1|＜t0.95,n-2·s(b1)，因此标准物质量值没有发生显著变化，故斜率是不显著的。因而未观测到不稳定性，即表明在7天的运输条件下，该回归是不显著的，即罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的量值没有发生明显的趋势性变化，这说明运输条件不会影响罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质在600nm处量值的稳定性。有效期t＝7天的短期稳定性的不确定度贡献即为：
u(600nm)Its＝sb·t≈0.0014
类似地，在(545～830)nm下的相对发射强度都是稳定的。表9仅列举部分波长下的运输稳定性计算结果。
表9部分波长下罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质运输稳定性考察结果
Figure BDA0002995382740000141
Figure BDA0002995382740000151
4、定值
4.1联合定值过程具体实验步骤
(1)SRM 2944标准物质的测定：根据NIST《Standard Reference Material2944Certificate》中的使用要求，荧光光谱仪所在实验室温度为(25±0.5)℃，用洁净的擦镜纸清洁SRM2944各表面，置于荧光光谱仪的测量光路中测试，使得激发光光束垂直于并集中于SRM2944一个透光表面上，并且在与激发光光束成90度角的相邻透光表面方向收集发射荧光。设置激发波长为515nm，发射波长检测范围：(530～830)nm，激发侧、发射侧狭缝为3nm、3nm，每间隔1nm采集荧光强度数值，平行测定三次。将每个波长下的光谱强度除以最大光谱发射强度，得到各波长下的相对发射强度。将SRM 2944标准物质证书中给出的相对发射强度量值除以每个相对发射强度值计算得到的校正因子F值。
(2)罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的测定：维持荧光光谱实验室温度为(25±0.5)℃，将不少于3mL罗丹明B溶液转移至12.5mm×12.5mm×45.0mm的洁净石英比色皿中，置于荧光光谱仪的测量光路中测试，使得激发光光束垂直于并集中于比色皿的一个表面上(液面以下)，并且在与激发光光束成90度角的相邻表面方向收集发射荧光。设置激发波长为515nm，发射波长检测范围：(530～830)nm，激发侧、发射侧狭缝为3nm、3nm，每间隔1nm采集荧光强度数值，每个样品平行测定三次，共计9次。将每个波长下的光谱强度乘以其对应的校正因子F值后再除以最大光谱发射强度与其对应波长的校正因子F值的乘积，即可得到各波长下的相对发射强度。
(3)共有8家实验室参与了联合定值(如表1所示)，每家实验室仪器使用前均通过法定计量机构检定合格。参与联合定值的各家实验室均参照上述步骤(1)-(2)测得罗丹明B甲醇溶液各波长下的相对发射强度。
(4)为了判别各家实验室数据的合理性，分别进行：①每家定值实验室组内测量结果正态分布分析；②每家定值实验室组内测量结果可疑值分析；③8家定值实验室测量结果组间等精度分析；④8家定值实验室组间数据一致性检验；⑤8家定值测量结果正态分布分析。具体如下：
4.2每家定值实验室组内测量结果正态分布分析
根据，JJF1343-2012《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》数据分布情况的检查：包括可视化方法，如直方图法、核密度图法(kernel density plot)、Q-Q图、P-P图等；偏离特定分布的统计学检验方法，如用于正态分布检验的偏态系数与峰态系数法(8≤n≤5000)、夏皮罗-威尔克(3≤n≤50)法、达戈斯提诺(50≤n≤1000)法、爱波斯-普利法(n≥8)等。
本发明利用IBM SPSS20软件对总计(286×8)2288组数据(每组9个数据)进行正态分析，首先分别进行每家定值实验室组内所有波长下的测量结果正态分布分析，部分波长的分析结果如表10所示，表10显示了利用Kolmogorov-Smirnov方法计算得到的8家实验室定值结果的渐近显著性(双侧)，所有结果的计算值均大于0.05，则说明数据服从正态分布。
表10每家定值实验室组内测量结果正态分布分析
Figure BDA0002995382740000161
5.3每家定值实验室组内可疑值分析
根据JJF1343-2012《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》离群检验：包括图形检验、格拉布斯(Grubbs)法、狄克逊(Dixon)法、曼德尔H和K统计量(用于离群方差检验)。
从545nm～830nm共计286个数据，一共8家联合定值实验室，合计2288组数据，每组数据内有9个测量值。本实施例以其中一家定值实验室以600nm处的相对荧光发射强度为例介绍每家定值实验室组内可疑值分析过程，其数据从小到大排列如下：
0.9135<0.9154<0.9162<0.9172<0.9175<0.9179<0.9183<0.9192<0.9215。
采用狄克逊准则和格拉布斯准则对所有数据进行可疑值分析，具体分析过程如下，未发现可疑值。
4.3.1采用狄克逊准则判别
采用狄克逊(Dixon)准则来分析上述数据。
因n＝9，则
Figure BDA0002995382740000162
Figure BDA0002995382740000163
查表得：此时的D(α,n)为D(0.05,9)＝0.564，r′11＜r11，而rij＜D(α,n)。说明该组数据无异常值。
4.3.2采用格拉布斯准则判别
上述数据的算数平均值：
Figure BDA0002995382740000171
计算实验标准偏差：s＝0.002286
分别计算各残差
Figure BDA0002995382740000172
其中绝对值最大的残差为0.0041，相应的测定值为0.9215。
Figure BDA0002995382740000173
查格拉布斯准则临界值：G(0.05,9)＝2.215，因此：
Figure BDA0002995382740000174
因此，说明无异常值。
4.3.3所有数据组内异常值判别
对总计(286×8)2288组数据(每组9个数据)进行异常值分析，分别采用狄克逊准则和格拉布斯准则判别是否存在可疑值，计算结果表明，每家联合定值实验室所有组内数据均不存在可疑值。
4.4八家定值实验室测量结果组间等精度分析
根据JJF1343-2012《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》组间数据等精度检验：包括科克伦(Cochran)法检验、F检验、Bartlett法检验、Levene法检验等。利用Excel软件可以对总计(286×8)2288组数据(每组9个数据)进行等精度分析，采用科克伦(Cochran)准则进行判别，具体操作步骤如下：
①将同一波长下8家实验室的的相对发射强度E数据列于Excel同一行中(m为实验室编号，n为测量次数)，排列顺序为：
545nm：E11，E12……E19……Em1，Em2，……Em9……E81，E82……E89
546nm：E11，E12……E19……Em1，Em2，……Em9……E81，E82……E89
…………
830nm：E11，E12……E19……Em1，Em2，……Em9……E81，E82……E89
共计286行，72列。
②每9个数据(即每一家实验室)计算其标准偏差s1，s2……s9；
③计算方差之和
Figure BDA0002995382740000181
④筛选各实验室最大的标准偏差，根据科克伦公式计算统计量C
Figure BDA0002995382740000182
本发明对全部波长下，8家定值实验室测量结果组间等精度均进行了分析，部分波长的分析结果如表11所示，计算得到所有波长下的统计量C值除以C(0.05,8,9)＝0.2926的结果小于1，说明采用科克伦准则判别所有组间数据等精度。
表11八家定值实验室测量结果组间等精度分析的部分结果
Figure BDA0002995382740000183
4.5八家定值实验室组间数据一致性检验
根据JJF1343-2012《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》组间数据一致性检验：包括平均值一致性t检验、相容性检验。选取8家定值实验室定值结果平均值最大的一组和最小的一组进行平均值一致性t-检验。具体操作步骤如下：
将同一波长下平均值最大、最小2家实验室的的相对发射强度E数据列于Excel同一行中(m为实验室编号，n为测量次数)，排列顺序为：
545nm:E11，E12……E19；E21，E22……E29，平均值
Figure BDA0002995382740000184
标准差s1，s2；
546nm:E11，E12……E19；E21，E22……E29，平均值
Figure BDA0002995382740000185
标准差s1，s2；
…………
830nm:E11，E12……E19；E21，E22……E29，平均值
Figure BDA0002995382740000191
标准差s1，s2。
共计286行，18列。
则每一行统计量：
Figure BDA0002995382740000192
式中n1＝n2＝9。
可以证明t服从自由度为n1+n2-2的t分布，根据自由度n1+n2-2及给定的显著性水平α，可由t检验临界值表查得临界的tα值为t(0.05,16)＝2.12。若由公式算出的|t|值小于tα，则认为
Figure BDA0002995382740000193
是一致的。
本发明利用IBM SPSS20软件对所有波长均进行了分析，部分波长的分析结果见表12。计算得到所有统计量t值除以t(0.05,16)＝2.12，得到的结果均小于1，且显著性因子p大于0.05，说明采用t-检验判别所有组间数据是等精度的。
4.6合并8家定值测量结果正态分布分析
本发明利用IBM SPSS20软件对总计(286×8)2288组数据(每组9个数据)对所有波长均进行了正态分析，部分波长的分析结果见表12。表12中第4列为利用Kolmogorov-Smirnov方法计算得到的8家实验室定值合并结果的渐近显著性(双侧)，所有结果的计算值值均大于0.05，则说明数据服从正态分布。
表12 8家定值实验室组间数据一致性检验和合并正态分布分析的部分结果
Figure BDA0002995382740000194
4.7合并8家定值数据异常值检验
利用Excel软件可以对总计(286×8)2288组数据(每组9个数据)进行异常值分析，方法同4.3部分相同(计算时，不再计算r′11及r11而是计算r′22及r22)，结果表明每个波长下合并联合定值实验室组内均不存在可疑值。
因此根据JJF1006-1994《一级标准物质技术规范》，可将全部数据视为一组新的测量数据，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。
根据上述统计结果，将8家实验室定值结果的平均值
Figure BDA0002995382740000201
作为罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的最终定值量值。
5.不确定度分析
5.1不确定度来源
根据JJG 1006-1994《一级标准物质技术规范》的规定，明确标准值的总不确定度由三部分组成。第一部分为定值的标准不确定度分量u定值，第二部分是不均匀产生的不确定度分量u均匀性，和第三部分不稳定产生的不确定度分量u稳定性。
当荧光染料浓度特别大(高于～1mol/L)时，产生的自吸收、自猝灭效应才会对荧光强度比产生影响。因此本发明标准物质研制过程中，不用考虑浓度引入的不确定度影响。
采用8家资质实验室联合定值的方式。每家实验室采用的方法均为使用荧光光谱仪通过与NIST的SRM2944荧光标准物质在相同发射波长下的相对发射强度比对定值。因此定值不确定度来源包括NIST标准物质的不确定度u1定值、8家实验室联合定值重复性的不确定度u2定值及温度变化引入的不确定度uT定值。
稳定性引入的不确定度包括长期稳定性引入的不确定度u1稳定性，运输稳定性引入的不确定度u2稳定性及光照稳定性引入的不确定度u3稳定性。其中，采用高功率450W氙灯照射罗丹明B甲醇溶液48h考察其光稳定性时发现，在光照48h内，罗丹明B甲醇溶液的相对荧光发射强度随时间呈现线性下降趋势，其最大下降的斜率为0.00066％/min。由于罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质为液体形态，为一次性使用，每次用于校准或测试时一般不超过10min，此条件下对荧光发射强度量值变化约为0.0066％，可忽略不计。因此，在最终不确定度评定时不考虑光照这一影响因素。
5.2不确定度分析
对(545～830)nm每隔1nm测试荧光发射光谱，共计286个数据点均进行了不确定分析。本实施例中取用部分波长的计算过程为代表，分析其相对发射强度值的不确定度，其他波长下的不确定度分析过程类似，表16列举了部分波长下的具体不确定分析结果。
5.2.1定值引入的不确定度
根据定值结果，最终不确定度保留小数点后3位，为了准确起见，下面计算过程中保留4位有效数字，最后计算扩展不确定度U时再进行修约。
(1)NIST标准物质的不确定度u1定值
根据SRM2944荧光标准物质证书，6个代表波长下的相对发射强度值的扩展不确定度U95(k＝2)分别列于表13中。
以600nm处的相对荧光发射强度为例，SRM2944给出600nm处的相对发射强度量值为Er＝0.1427，扩展不确定度U95,SRM＝0.0070。因而600nm处的相对扩展不确定度U＝0.0070/0.1427＝4.8798％。依据“4、定值”部分，罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质在600nm处的相对荧光发射强度为0.91728，因此其标准不确定度为：
u(600nm)1，定值＝E·U/k＝(0.91728×0.048798)/2＝0.0224
表13 NIST标准物质引入的不确定度
波长/nm 550 600 650 700 750 800
U<sub>95，SRM</sub> 0.00063 0.00696 0.02633 0.03970 0.02732 0.00705
E<sub>r</sub> 0.00860 0.14271 0.62192 0.99664 0.61068 0.12778
U<sub>1，定值</sub> 7.2670％ 4.8798％ 4.2342％ 3.9833％ 4.4730％ 5.5207％
u<sub>1，定值</sub> 0.0002 0.0224 0.0057 0.0011 0.0003 0.0001
其他波长下的不确定度分析过程类似。部分波长下的具体分析结果见表16。
(2)8家实验室定值重复性引入的不确定度u2定值
对于等精度、平均值一致的多家联合定值数据，可以用样品重复测定的RSD计算。以600nm代表波长下的相对发射强度作为示例，测量结果如表14所示：
表14八家实验室600nm处定值结果汇总
Figure BDA0002995382740000211
根据JJF1006-1994《一级标准物质技术规范》，可将全部数据视为一组新的测量数据，计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。
Figure BDA0002995382740000212
其他波长下的不确定度分析过程类似。部分波长下的具体分析结果见表16。
(3)温度变化引入的不确定度uT定值
本发明计算了10～40℃的温度范围内相对强度的变化，发现各波长下相对发射强度随温度近似线性变化，由此可计算得到温度变化引入的不确定度。
以600nm处的相对荧光发射强度变化为例：分别测定6瓶样品在10.0、20.0、25.0、30.0、40.0摄氏度下的平均相对荧光发射强度，如表15所示：
表15温度变化引入的不确定度
Figure BDA0002995382740000221
在10～40℃温度范围内，600nm处的相对荧光发射强度随温度呈现线性变化，相关系数高达0.999。拟合得到线性变化关系的斜率为-0.00116℃-1。因此考虑温度变化±3℃时，引入的不确定度为
u(600nm)T，定值＝0.00116×3＝0.0035
同理，可以分别得到其他波长在10～40℃温度范围内相对荧光发射强度随温度也呈现线性变化。部分波长下温度变化±3℃时引入的相对荧光发射强度的不确定度贡献见表16。
(4)合成定值引入的不确定度为：
Figure BDA0002995382740000222
其他波长下的合成定值引入的不确定度分析过程类似。
5.2.2均匀性产生的标准不确定度
根据“2、均匀性检验”部分的计算结果分析，不均匀性所产生的标准偏差需要合成到定值最终不确定度中。
当组间均方大于组内均方根据公式(2-5)进行计算。
Figure BDA0002995382740000223
当组间均方小于组内均方根据公式(2-6)进行计算。
Figure BDA0002995382740000224
不同波长下的均匀性引入的不确定度均可利用上述公式进行计算，表16中列出了部分波长下的具体分析结果。
5.2.3稳定性引入的不确定度
稳定性影响分为两部分考察，第一部分是在12个月的有效期的不确定度贡献，第二部分是7天运输条件下的短期稳定性不确定度贡献。
(1)保存条件下的长期稳定性
12个月有效期内，采用评估稳定性的回归方差分析表来进行估计标准不确定度。采用“3、稳定性考察”的方法，有效期t＝12个月的长期稳定性的不确定度贡献即为：u1稳定性＝sβ·t。不同波长下的长期稳定性引入的不确定度计算方法相同，表16中列出了部分波长下的长期稳定性引入的不确定度。
(2)运输条件下的短期稳定性
7天的运输条件下，采用评估稳定性的回归方差分析表来进行估计标准不确定度。采用“3、稳定性考察”的方法，有效期t＝7天的短期稳定性的不确定度贡献即为：u2稳定性＝sβ·t。不同波长下的运输稳定性引入的不确定度计算方法相同，表16中列出了部分波长下的运输稳定性引入的不确定度。
5.2.4合成不确定度
Figure BDA0002995382740000231
其他波长下的合成定值引入的不确定度分析过程类似。部分波长下的具体分析结果见表16。
表16部分波长下的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的不确定度分析结果
Figure BDA0002995382740000232
5.2.5扩展不确定度
取k＝2，则扩展不确定度为:U(600nm)＝0.0228×2＝0.046。
详细的所有波长下的相对发射强度的不确定度见表17。表17为罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物在515nm激发下，发射波长覆盖范围为(545～830)nm，波长间隔为1nm的标准相对荧光发射强度值量值表。
表17罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质量值表
Figure BDA0002995382740000241
Figure BDA0002995382740000251
注：λem：荧光发射波长(nm)；E：相对荧光发射强度；U95：扩展不确定度(k＝2)。
利用浓度为10-7-1mol/L的罗丹明B甲醇溶液、或者利用其他溶剂(如水、乙腈、乙醇、丙酮、氯仿等极性适中的溶剂)配制得到的浓度为10-7-1mol/L的罗丹明B溶液均可用于制备相对荧光发射强度标准物质。不同溶剂配制得到的不同浓度的罗丹明B溶液用于制备相对荧光发射强度标准物质时，制得的相对荧光发射强度标准物质的激发波长范围和发射波长覆盖范围(即发射波长范围)如表18所示。
表18罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质的激发波长和发射波长范围
溶剂 激发波长范围/nm 发射波长范围/nm
氯仿 500～580 520～830
丙酮 500～580 520～830
乙醇 510～600 530～830
甲醇 510～600 530～830
乙腈 530～600 550～830
水 540～630 560～830
不同的罗丹明B溶液用于制备相对荧光发射强度标准物质时需参考实施例1的方法进行重新定值和确认不确定度。
实施例2罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质针对不同仪器部件的使用结果
参考NIST的SRM2944的标准物质研制过程，荧光标准物质在使用时还应当考虑①入射激发光照射在样品的位置变化，造成吸收及内滤效应变化引入的不确定度；②入射及出射光栅狭缝引入的不确定度；③仪器组件如光源、反射器、检测器引入的不确定度；④由于光的各向异性和标准物质的极化引入的不确定度。
1.1入射光位置变化及光的各向异性影响
考察第①④种因素时，由于罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质溶液体系是均匀的，入射光束照射在样品位置的细微变化不会引起吸收或是内滤效应的变化，同时也没有各向异性及极化程度上的变化，因此此处不再考虑。
第②③种因素引入的不确定度是由于不同检测仪器之间产生的，在使用SRM2944的校准过程中，其证书中列出的不确定度范围已经包含了这三种因素的影响，因此，可以认为这两个因素并非标准物质本身对量值的影响，而是取决于测量仪器。针对市面上常见的荧光光谱仪，考虑到可能存在的光栅狭缝等仪器组件不同的常见情况，本发明进行了初步实验。
1.2光栅狭缝不同的影响
市面上常见的荧光光谱仪中，光栅狭缝主要存在连续可调和非连续可调两种类型，其中光栅狭缝连续可调的荧光光谱仪可以将激发、发射两侧光栅狭缝设置为罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质所要求的3nm及3nm。而光栅狭缝非连续可调的荧光光谱仪存在旧款的仪器，仅可以将激发、发射两侧光栅狭缝设置为2.5nm及2.5nm。为探究这一影响因素，选取了10台光栅狭缝连续可调的荧光光谱仪，设置两侧狭缝均为3nm，测定了其经过SRM2944标准物质校准后，罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的荧光发射光谱，并给出了其发射光谱图的平均结果。同时，在10台光栅狭缝非连续可调的荧光光谱仪，设置两侧狭缝均为2.5nm，测定了其经过SRM2944标准物质校准后，罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的荧光发射光谱，并给出了其发射光谱图的平均结果。结果如图5所示。
从图5中可以看出，不论是在10台光栅狭缝连续可调的荧光光谱仪两侧狭缝均为3nm的条件下，还是10台光栅狭缝非连续可调的荧光光谱仪两侧狭缝均为2.5nm条件下，罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质呈现出十分相似的荧光发射光谱图。由于此光谱图中就包含了全部定值数据，且光谱间的偏差不超过0.1％。说明本发明提供的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质同时适用于光栅狭缝连续可调及光栅狭缝非连续可调的荧光光谱仪的校准。
1.3不同光源的影响
市面上常见的荧光光谱仪中，大部分使用的是Xe灯连续光源或LED单波长光源，少部分配备了脉冲光源。而对于罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质所要求的的激发光波长为515nm同样就存在三种情况，就是Xe灯利用分光系统在515nm分光产生，或直接使用515nm的LED光源，或515nm的脉冲光源。图6则给出了三种不同光源下罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的荧光发射光谱，其中脉冲光源选取了与SRM2944标准物质研制过程中相同的脉冲周期80μs。
其中使用Xe灯连续光源或LED单波长光源罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质呈现出十分相似的荧光发射光谱图。由于此光谱图中就包含了全部定值数据，且光谱间的偏差不超过0.1％。说明研制出的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质同时适用于配备有Xe灯连续光源或LED单波长光源的荧光光谱仪的校准。
而对于脉冲光源而言，测量时有较大的噪声，经过计算虽然造成的信号波动最大不超过2.5％，并不超过部分量值的定值不确定度范围，但是对测量光谱中量值变化的连续性造成了较大影响。因此不建议将罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质用于只配备脉冲光源的荧光光谱仪的校准。
实施例3相似标准物质量值比对验证
分别采用：
①NIST的SRM2940标准物质(选取原因是由于其发射波长的范围与罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质基本一致，测量时大小尺寸相同)与实施例1制得的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质进行比对分析。
②GBW(E)130100硫酸奎宁荧光标准物质(选取原因是由于其发射波长的范围与三种相对荧光发射强度标准物质均有重合，且均为液体形态)与实施例1制得的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质进行比对分析。
利用罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质对2台荧光分光光度计(已通过JJG537-2006)进行校准，随后测定SRM2940在(545～800)nm、GBW(E)130100硫酸奎宁荧光标准物质在(545～675)nm这两个与罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质校准波长范围重合的荧光发射光谱，分别取600nm与700nm两个波长下的相对发射强度与SRM2940的证书量值对比，取550nm与650nm两个波长下的相对发射强度与GBW(E)130100的证书量值对比，结果如表19所示，利用罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质测得的不同仪器的测定结果均在SRM2940及GBW(E)130100标准物质量值的不确定范围内。
表19罗丹明B甲醇溶液标准物质与其他标准物质比对结果(25℃)
Figure BDA0002995382740000271
实施例4罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质作为荧光标准物质使用时的使用方法
罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质适用于配备连续可调光源或LED光源的荧光光谱仪或同类荧光仪器的校准。
以浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质为例，使用时维持所在实验室温度为(25±3)℃，将不少于3mL标准物质溶液转移至12.5mm×12.5mm×45.0mm的洁净石英比色皿中，置于荧光光谱仪或同类仪器的测量光路中，使得激发光光束垂直并集中于比色皿的一个表面上(液面以下)，并且在与激发光光束成90度角的相邻表面方向收集发射荧光。设置激发波长(Excitation wavelength)为515nm，发射波长(Emissionwavelength)检测范围为(545～830)nm，激发侧、发射侧狭缝(Slit)为3nm、3nm(光栅狭缝连续可调类仪器)或2.5nm、2.5nm(光栅狭缝非连续可调类仪器)，数据采集步长(Step)建议设置为1nm。
采集罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的荧光发射光谱(Emissionspectrum)，读取每个波长下的荧光发射强度值Eem。如条件允许，则同时采集每个数据点对应的激发光谱强度，将荧光发射强度除以荧光激发强度作为校准荧光发射强度值。将所有波长下的荧光发射强度数值(或校准荧光发射强度值)除以594nm处的最大荧光发射强度值，获取每个波长下的归一化荧光发射强度值Eem,norm。将对应波长下标准物质的相对荧光发射强度特性量值E除以其对应波长下的归一化测量值Eem,norm，以获得每个发射波长下的能量校正因子F。日常发射光谱测定值乘以对应波长下的能量校正因子F或直接导入仪器的能量校准系统文件即可用于发射侧能量/强度校准。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将罗丹明B配制成罗丹明B溶液；其中，所述罗丹明B溶液的发射光谱不含杂质荧光峰；
对配置的罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值进行均匀性检验、稳定性考察、定值和不确定度分析，若罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值均能够满足标准物质的要求，即得罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质；
其中，罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值的测量步骤包括：
(1)在(25.0±0.5)℃的实验温度条件下，利用检定合格的荧光光谱仪，在SRM2943标准物质证书说明要求的激发光照射下，设置激发波长为330.3nm，发射波长检测范围为350-640nm，激发侧狭缝、发射侧狭缝同时设为3nm或者同时设为2.5nm，每间隔1nm采集光谱发射强度数值；然后将每个波长下的光谱发射强度除以SRM2943标准物质的最大光谱发射强度，得到各波长下的相对发射强度；任取3个SRM2943标准物质样品，每个样品平行测定3次，计算各波长下的平均相对发射强度值；最后将SRM2943标准物质证书中给出的各波长下的相对发射强度量值除以对应波长的平均相对发射强度值计算得到SRM2943标准物质在350-640nm波长范围内各波长下的校正因子F值；
(2)在(25.0±0.5)℃的实验温度条件下，利用检定合格的荧光光谱仪，在SRM2944标准物质证书说明要求的激发光照射下，设置激发波长为515nm，发射波长检测范围为530-830nm，激发侧狭缝、发射侧狭缝同时设为3nm或者同时设为2.5nm，每间隔1nm采集光谱发射强度数值；然后将每个波长下的光谱发射强度除以SRM2944标准物质的最大光谱发射强度，得到各波长下的相对发射强度；任取3个SRM2944标准物质样品，每个样品平行测定3次，计算各波长下的平均相对发射强度值；最后将SRM2944标准物质证书中给出的各波长下的相对发射强度量值除以对应波长的平均相对发射强度值计算得到SRM2944标准物质在530-830nm波长范围内各波长下的校正因子F值；
(3)在(25.0±0.5)℃的实验温度条件下，利用检定合格的荧光光谱仪，将罗丹明B溶液放置在样品室中，设置对应的激发波长和发射波长检测范围，激发侧狭缝、发射侧狭缝同时设为3nm或者同时设为2.5nm，每间隔1nm采集光谱发射强度数值；然后将每个波长下的光谱发射强度乘以对应波长的校正因子F值后再除以罗丹明B溶液的最大光谱发射强度与其对应波长的校正因子F值的乘积，得到各波长下的相对发射强度，其中，对于520-529nm波长范围内的各波长，选择SRM2943标准物质对应波长的校正因子F值计算罗丹明B溶液相对发射强度，对于530-640nm波长范围内的各波长，任意选择SRM2943标准物质对应波长的校正因子F值或者SRM2944标准物质对应波长的校正因子F值计算罗丹明B溶液相对发射强度，对于641-830nm波长范围内的各波长，选择SRM2944标准物质对应波长的校正因子F值计算罗丹明B溶液相对发射强度；任选3个罗丹明B溶液样品，每个样品平行测定3次，将计算得到的各波长下的平均相对发射强度值作为罗丹明B溶液对应波长下的相对荧光发射强度值的测量结果。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值的定值包括如下步骤：
S1、利用n家实验室分别参照罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值的测量步骤(1)-(3)对罗丹明B溶液在其对应的发射波长覆盖范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值进行定值；其中，n≥3；
S2、分别对每家实验室定值结果进行组内正态分布分析、可疑值分析；然后对所有实验室的定值结果进行组间等精度分析、组间数据一致性检验；最后合并所有实验室的定值结果进行正态分布分析、数据异常值检验；若同时满足：每家定值实验室组内定值结果符合正态分布、每家定值实验室组内定值结果不存在可疑值、所有定值实验室定值结果组间等精度、所有定值实验室组间数据平均值一致、合并所有定值实验室的定值结果符合正态分布以及合并所有定值实验室的定值结果不存在可疑值，则将所有实验室在对应波长下的定值结果的平均值作为罗丹明B溶液的最终定值量值。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述罗丹明B溶液的溶剂选自水、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述罗丹明B溶液的浓度为10-7-1mol/L。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，当溶剂为水时，所述罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质在540-630nm波长激发下，发射波长覆盖范围为560-830nm；
当溶剂为乙腈时，所述罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质在530-600nm波长激发下，发射波长覆盖范围为550-830nm；
当溶剂为甲醇时，所述罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质在510-600nm波长激发下，发射波长覆盖范围为530-830nm；
当溶剂为乙醇时，所述罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质在510-600nm波长激发下，发射波长覆盖范围为530-830nm；
当溶剂为丙酮时，所述罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质在500-580nm波长激发下，发射波长覆盖范围为520-830nm；
当溶剂为氯仿时，所述罗丹明B溶液相对荧光发射强度标准物质在500-580nm波长激发下，发射波长覆盖范围为520-830nm。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述罗丹明B溶液为浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液，其在515nm激发下，发射波长覆盖范围为545-830nm。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质的制备方法包括如下步骤：
将罗丹明B纯度标准物质利用色谱纯甲醇配制成浓度为0.100mg/mL的罗丹明B甲醇溶液；
对配置的罗丹明B甲醇溶液在545-830nm波长范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值进行均匀性检验、稳定性考察、定值和不确定度分析，若罗丹明B甲醇溶液在545-830nm波长范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值均能够满足标准物质的要求，即得罗丹明B甲醇溶液相对荧光发射强度标准物质；
其中，罗丹明B甲醇溶液在545-830nm波长范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值的测量步骤包括：
1)在(25.0±0.5)℃的实验温度条件下，利用检定合格的荧光光谱仪，在SRM2944标准物质证书说明要求的激发光照射下，设置激发波长为515nm，发射波长检测范围为530-830nm，激发侧狭缝为3nm，发射侧狭缝为3nm，每间隔1nm采集光谱发射强度数值；然后将每个波长下的光谱发射强度除以SRM2944标准物质的最大光谱发射强度，得到各波长下的相对发射强度；任取3个SRM2944标准物质样品，每个样品平行测定3次，计算各波长下的平均相对发射强度值；最后将SRM2944标准物质证书中给出的各波长下的相对发射强度量值除以对应波长的平均相对发射强度值计算得到SRM2944标准物质在530-830nm波长范围内各波长下的校正因子F值；
2)在(25.0±0.5)℃的实验温度条件下，利用检定合格的荧光光谱仪，将罗丹明B溶液放置在样品室中，设置激发波长为515nm，发射波长检测范围为545-830nm，激发侧狭缝为3nm，发射侧狭缝为3nm，每间隔1nm采集光谱发射强度数值；然后将每个波长下的光谱发射强度乘以SRM2944标准物质对应波长的校正因子F值后再除以罗丹明B溶液的最大光谱发射强度与其对应波长的校正因子F值的乘积，得到各波长下的相对发射强度；任选3个罗丹明B溶液样品，每个样品平行测定3次，将计算得到的各波长下的平均相对发射强度值作为罗丹明B溶液对应波长下的相对荧光发射强度值的定值结果；
罗丹明B甲醇溶液在545-830nm波长范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值的定值包括如下步骤：
S1、利用8家实验室分别参照罗丹明B甲醇溶液在545-830nm波长范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值的测量步骤1)-2)对罗丹明B甲醇溶液在545-830nm波长范围内、每隔1nm的相对荧光发射强度值进行定值；
S2、分别对每家实验室定值结果进行组内正态分布分析、可疑值分析；然后对所有实验室的定值结果进行组间等精度分析、组间数据一致性检验；最后合并所有实验室的定值结果进行正态分布分析、数据异常值检验；若所有组内数据均服从正态分布且所有组内数据均不存在可疑值、所有组间数据是等精度的、合并后的所有数据服从正态分布且不存在可疑值，则将所有实验室在对应波长下的定值结果的平均值作为罗丹明B甲醇溶液的最终定值量值。
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