CN107796934B - 一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法 - Google Patents

一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107796934B
CN107796934B CN201610804112.1A CN201610804112A CN107796934B CN 107796934 B CN107796934 B CN 107796934B CN 201610804112 A CN201610804112 A CN 201610804112A CN 107796934 B CN107796934 B CN 107796934B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
brominated flame
samples
flame retardant
biotoxicity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610804112.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107796934A (zh
Inventor
叶国注
董四君
朱慧敏
林怡
黄乾生
池毓烺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Urban Environment of CAS
Original Assignee
Institute of Urban Environment of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Urban Environment of CAS filed Critical Institute of Urban Environment of CAS
Priority to CN201610804112.1A priority Critical patent/CN107796934B/zh
Publication of CN107796934A publication Critical patent/CN107796934A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107796934B publication Critical patent/CN107796934B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法。受试生物经溴代阻燃剂暴露后，进行样本前处理，由气相色谱质谱联用方法检测样本中多巴和乳酸的含量，基于二元逻辑回归模型，计算上述联合生物指标对样本的分类预测概率值，再根据确定的临界值，评价溴代阻燃剂的生物毒性及其遗传效应，并分析其诊断性能。本发明具有反应条件温和、操作简单、高重复性、高稳定性的特点，可高灵敏、高特异性地评价溴代阻燃剂的生物毒性及其遗传效应，应用前景好。

Description

一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法
技术领域
本发明涉及环境分析化学、环境暴露与毒理学领域，是一种基于受试生物体中多巴和乳酸含量评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法。
技术背景
溴代阻燃剂(BFR)作为目前生产和使用最广泛的阻燃剂，已在大气、粉尘、水体、土壤、食品、人体及其它生物体等样本中广泛检出。人群BFR暴露量与生活习惯、工作环境等因素密切相关。研究表明，胎儿和新生儿在各年龄段人群中BFR暴露量最高。此外，胎儿和新生儿比其它年龄人群更易受到污染物暴露的健康危害。因而，胎儿和新生儿受BFR暴露的潜在健康危害最大，值得关注。
除了生殖和内分泌干扰效应，BFR暴露具有胚胎发育毒性，如：导致斑马鱼胚胎心包水肿、出血、心率紊乱、脊柱畸形、延长孵化时间、降低孵化率，并提高致死率。另外，由于结构相似等原因，BFR暴露可干扰多巴胺通路的胺类代谢物与其转运体、代谢酶、受体的作用，从而诱发多巴胺通路的紊乱。值得注意的是，多巴胺通路的多巴、多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素及其信号通路可通过调控神经系统、心血管系统、生殖系统等的生长发育与功能，影响胚胎发育。此外，多巴胺通路的胺类代谢物紊乱可诱发乳酸累积，而乳酸累积又会加剧神经系统的紊乱。因而，多巴胺通路及其相关的代谢物在胚胎发育中具有重要作用。
代谢物作为上游基因和蛋白表达的终产物，最接近生物体表型，是各种生理活动综合的结果，可直接、灵敏地反映环境污染物暴露诱发的生物毒性。此外，海水青鱂鱼卵具有世代周期短；对染污物暴露敏感；产量高；透明，可观察各个发育阶段的形态变化等特点，已被国际生命科学学会(ILSI)及健康和环境科学学会(HESI)列为胚胎毒性实验的模式生物之一。再者，四溴双酚A(TBBPA)是目前生产和使用最广泛的溴代阻燃剂。因而，本发明将以海水青鱂鱼卵为模型，以TBBPA为列，基于多巴胺通路相关的多巴和乳酸含量信息，评价TBBPA暴露诱发的生物毒性及其遗传效应。首先，亲本鱼卵未经TBBPA暴露，子代鱼卵经TBBPA暴露后，收集子代鱼卵样本进行处理分析，评价TBBPA的生物毒性；亲本鱼卵经TBBPA暴露，而子代鱼卵未经TBBPA暴露，收集子代鱼卵样本进行处理分析，评价TBBPA生物毒性的遗传效应。目前，尚未发现基于受试生物体中乳酸和多巴含量评价BFR生物毒性及其遗传效应的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏、高特异性评价BFR生物毒性及其遗传效应的方法。以世代周期短、产卵量大、对污染物暴露敏感的海水青鱂鱼卵为模型，以TBBPA为例，利用鱼卵样本中多巴和乳酸的含量信息，评价TBBPA生物毒性及其遗传效应；该法操作简单、稳定性和重复性高、评价结果灵敏度和特异性高，可进一步推广。
为实现上述目的，本发明以海水青鱂鱼卵为模型，以TBBPA为例，采用如下技术方案：
亲本鱼卵未经TBBPA暴露，子代鱼卵经TBBPA暴露后，收集子代鱼卵样本进行前处理、气相色谱质谱分析，获得鱼卵样本中多巴和乳酸的含量信息，上述两种代谢物联合使用，基于二元逻辑回归模型，预测鱼卵样本的分类概率值，并将样本分类预测概率的临界值设为0.5，若鱼卵样本分类预测概率值＜0.5，则鱼卵未受TBBPA暴露；若鱼卵样本分类预测概率值≥0.5，则TBBPA暴露诱发了鱼卵的生物毒性；对照组为亲本和子代均未受TBBPA暴露的子代鱼卵。
亲本鱼卵经TBBPA暴露，而子代鱼卵未经TBBPA暴露，收集子代鱼卵样本进行前处理、气相色谱质谱分析，获得鱼卵样本中多巴和乳酸的含量信息，上述两种代谢物联合使用，基于二元逻辑回归模型，预测鱼卵样本的分类概率值，并将样本分类预测概率的临界值设为0.5，若鱼卵样本分类预测概率值＜0.5，则亲本和子代鱼卵均未受TBBPA暴露；若鱼卵样本分类预测概率值≥0.5，则TBBPA暴露诱发了鱼卵的生物毒性，并且此毒性效应可遗传给子代；对照组为亲本和子代均未受TBBPA暴露的子代鱼卵。
具体方法如下：
1.鱼卵TBBPA暴露处理：选择正常发育的受精鱼卵，亲本鱼卵未经TBBPA暴露，子代鱼卵从受精后第2天至第6天进行TBBPA暴露后，收集子代鱼卵进行后续的处理分析，识别TBBPA生物毒性；亲本鱼卵从受精后第2天至第6天进行TBBPA暴露，而子代鱼卵未经TBBPA暴露，于受精后第6天，收集子代鱼卵样本进行后续的处理分析，识别TBBPA生物毒性的遗传效应；亲本和子代均未受TBBPA暴露，于受精后第6天，收集子代鱼卵样本进行后续的处理分析，作为TBBPA生物毒性及其遗传效应评价的对照组。TBBPA暴露浓度为50-200μg/L。
2.样本前处理：①精确称取鱼卵样本于1.5ml Eppendorf离心管中，先后加入氧化锆小球和600μL 80％甲醇提取液(内含5μg/mL十三酸作为内标)，置于研磨仪，在33次/s的频率下破碎1.5min后，于12000rpm，4℃条件下离心15min，取出480μL上清液，于真空冷冻干燥机中冻干；②取出所有待测样本中剩余的上清液混合，制作一个大的质量控制(QC)样本，涡旋5min充分混合后，分成每份480μL上清液的QC样本，每5—10个待测样本插入1个QC样本，在后续的冻干、衍生化与气相色谱质谱分析中，与其它待测样本同样的参数处理；③鱼卵冻干样本中加入50μL甲氧胺吡啶溶液(20mg/mL)，涡旋30s后，于37℃水浴中肟化1.5h；加入40μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，于37℃水浴中硅烷化1.0h；于12000rpm，4℃条件下离心15min后，取上清液进行后续仪器分析。
3.气相色谱质谱联用分析条件：①气相色谱分析条件：色谱柱为DB-5MS毛细管柱，柱长30m，内径250μm，膜厚0.25μm；进样口温度300℃，进样量1μL，分流比10∶1；载气为高纯氦气，其恒定线速度为40cm/s；程序升温程序为初始柱温70℃保持3min后，以5℃/min的速率升至300℃，保持10min；②质谱分析条件：界面温度和离子源温度各为280和230℃，检测电压与调谐电压一致，电离方式为电子轰击，电离电压70eV；溶剂切割时间为6.0min，质荷比扫描范围为33-600，质谱扫描频率为5张谱图/s。
4.质谱数据处理：原始质谱数据导成NetCDF格式后，将XCMS程序导入R2.3.11软件，进行峰匹配和积分，获得鱼卵样本中各个离子峰的面积和保留时间；采用ChromaTOF软件对质谱文件进行重叠峰去卷积、谱库(NIST11，Wiley和Fiehn库)检索和匹配，对代谢物进行定性，并获得每个代谢物的特征离子；再通过标样的保留时间、保留指数、质谱碎片特征，进一步确认定性结果；多巴、乳酸和十三酸内标的特征离子分别为218，117和271，对应的保留时间分别为为32.79，8.07和25.94min，多巴和乳酸的含量由其特征离子峰面积与内标峰特征离子峰面积的比值，除以鱼卵重量，再乘以1×105的数值表示，进行后续的统计分析。
5.检测方法的评价：根据QC样本在主成分分析图的分布情况、QC样本两两间的相关系数、QC样本中离子峰含量的相对标准偏差分布情况，评价检测方法的稳定性、重复性和可靠性。
6.生物毒性的评价方法：亲本鱼卵未经TBBPA暴露，子代鱼卵经TBBPA暴露后，子代鱼卵中多巴和乳酸含量显著升高(p＜0.05，two-tailed Mann-Whitney U test)；将多巴和乳酸的含量代入SPSS软件中二元逻辑回归模块分析，构建二元逻辑回归模型，并得出常数项、多巴和乳酸在回归模型中的系数，获得方程1；根据方程1，即可得各个样本的分类预测概率。构建的二元逻辑回归模型和方程1如下：
二元逻辑回归模型：样本分类预测概率＝1/[1+e-(c+K*a+L*b)]
其中，c为常数项；a为多巴含量；b为乳酸含量；K为多巴在方程中的系数；L为乳酸在方程中的系数。
二元逻辑回归方程1：样本分类预测概率＝1/[1+e-(-88.503+0.098*a+0.026*b)]
其中，a和b分别表示多巴和乳酸含量。
将样本分类预测概率的临界值设为0.5，若鱼卵样本分类预测概率值＜0.5，则鱼卵未受TBBPA暴露；若鱼卵样本分类预测概率值≥0.5，则TBBPA暴露诱发了鱼卵的生物毒性；对照组为亲本和子代均未受TBBPA暴露的子代鱼卵
7.生物毒性遗传效应的评价方法：亲本鱼卵经TBBPA暴露，而子代鱼卵未经TBBPA暴露，子代鱼卵中多巴和乳酸含量显著升高(p＜0.05，two-tailed Mann-Whitney Utest)；将多巴和乳酸的含量代入SPSS软件中二元逻辑回归模块分析，构建二元逻辑回归模型(同上所述)，并得出常数项、多巴和乳酸在回归模型中的系数，获得回归方程2；根据方程2，即可得各个样本的分类预测概率。构建的二元逻辑回归方程2如下：
样本分类预测概率＝1/[1+e-(-78.498+0.102*a+0.021*b)]
其中，a和b分别表示多巴和乳酸含量。
将样本分类预测概率的临界值设为0.5，若鱼卵样本分类预测概率值＜0.5，则亲本和子代鱼卵均未受TBBPA暴露；若鱼卵样本分类预测概率值≥0.5，则TBBPA暴露诱发了鱼卵的生物毒性，并且此毒性效应可遗传给子代；对照组为亲本和子代均未受TBBPA暴露的子代鱼卵。
8.生物毒性及其遗传效应识别结果的评价：由鱼卵样本的分类预测概率值，获得各个样本的分类，进而可得样本分类正确率，以此评价生物毒性及其遗传效应识别结果；以样本分类预测概率为变量，进行受试者工作特征曲线(ROC)分析，评价生物毒性及其遗传效应识别结果的诊断性能，评价指标为灵敏度、特异性和ROC曲线下面积(AUC)。
本发明研究人员利用气相色谱质谱联用的代谢组学技术研究TBBPA暴露诱发的海水青鱂鱼卵发育毒性相关代谢紊乱，发现胺类通路、糖酵解等通路发生显著变化，其中，与神经系统相关的多巴和乳酸含量在TBBPA暴露下显著升高。已有研究表明，TBBPA暴露可诱发多巴胺通路的紊乱，而多巴胺通路上儿茶酚胺的紊乱可诱发乳酸的变化，进而加剧神经系统紊乱。以多巴和乳酸为生物指标，可从神经系统方面评价TBBPA等BFR生物毒性。目前，尚未发现相关报道。
本发明以海水青鱂鱼卵中多巴和乳酸联合作为生物指标，以TBBPA为例，基于二元逻辑回归模型，可高灵敏、高特异性地评价BFR生物毒性及其遗传效应；且反应条件温和，操作简单，重复性高，稳定性高；可为BFR及其它类似结构污染物的分子毒理研究、健康风险评价等提供参考。
附图说明
图1：样本主成分得分图。
图2：QC样本中离子峰含量相对标准偏差分布图。
图3：TBBPA暴露诱发的多巴和乳酸变化示意图。Control：亲本和子代都未受TBBPA暴露的子代鱼卵(对照组)；TBF1-50：亲本未受TBBPA暴露，子代受50μg/L TBBPA暴露的子代鱼卵；TBF1-200：亲本未受TBBPA暴露，子代受200μg/L TBBPA暴露的子代鱼卵；TBF0-50：亲本受50μg/L TBBPA暴露，子代未受TBBPA暴露的子代鱼卵；TBF0-200：亲本受200μg/L TBBPA暴露，子代未受TBBPA暴露的子代鱼卵；*：p＜0.05，two-tailed Mann-Whitney U test。
图4：多巴和乳酸的相关性分析图。
图5：TBBPA暴露诱发的心率紊乱示意图。对照组：未受TBBPA暴露的鱼卵。
图6：TBBPA生物毒性及其遗传效应评价示意图。Control：亲本和子代都未受TBBPA暴露的子代鱼卵；TBF1：亲本未受TBBPA暴露，子代分别受50和200μg/L TBBPA暴露的子代鱼卵；TBF0：亲本分别受50和200μg/L TBBPA暴露，子代未受TBBPA暴露的子代鱼卵；***：p＜0.001，two-tailed Mann-Whitney U test。(A)TBBPA暴露诱发的多巴变化；(B)TBBPA暴露诱发的乳酸变化；(C)多巴和乳酸联合作为生物指标评价TBBPA生物毒性；(D)多巴和乳酸联合作为生物指标评价TBBPA生物毒性的遗传效应；(E)TBBPA生物毒性的诊断性能；(F)TBBPA生物毒性遗传效应的诊断性能。
具体实施方式
实施例
下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明，而不是限制本发明。
1.海水青鱂鱼卵暴露
选取六个月大的海水青鱂鱼，培养于28±1℃的人工海水，盐度为3％。每天喂2次活丰年虾。光周期设为14h光照：10h黑暗。于光周期开始的2h内，收集受精的鱼卵，并在显微镜下确认受精情况。
TBBPA溶解于二甲基亚砜中，配成染毒母液。鱼卵TBBPA暴露浓度设为0(对照)，50和200μg/L。每个实验组设置4个重复。在每一个实验重复中，二甲基亚砜在人工海水的终浓度为0.2％；随机选择35个受精的鱼卵于9cm直径的培养皿中，加20mL人工海水，每天更换暴露液。孵化的小鱼转移至300mL的玻璃瓶中，加入150mL人工海水，并每天更换海水。待小鱼产出子代鱼卵后，收集子代鱼卵，进行后续实验处理。在受精后第六天，显微镜下计数鱼卵的心跳次数。亲本鱼卵未经TBBPA暴露，子代鱼卵于受精后第二至六天进行TBBPA暴露，收集受精后第六天暴露后的子代鱼卵进行处理分析，评价TBBPA生物毒性。此外，将亲本鱼卵于受精后第二至六天进行TBBPA暴露，而子代鱼卵未经TBBPA暴露，于受精后第六天，收集子代鱼卵进行处理分析，评价TBBPA生物毒性的遗传效应。
2.鱼卵样本前处理
精确称取12粒鱼卵样本于1.5ml Eppendorf离心管中，先后加入氧化锆小球和600μL 80％甲醇提取液(内含5μg/mL十三酸作为内标)，置于研磨仪，在33次/s的频率下破碎1.5min后，于12000rpm，4℃条件下离心15min，取出480μL上清液，于真空冷冻干燥机中冻干。
取出所有待测样本中剩余的上清液混合，制作一个大的QC样本，涡旋5min充分混合后，分成每份480μL上清液的QC样本，每5个待测样本中插入1个QC样本，在后续的冻干、衍生化与气相色谱质谱分析中，与其它待测样本同样的参数处理。
往鱼卵冻干样本中加入50μL甲氧胺吡啶溶液(20mg/mL)，涡旋30s后，于37℃水浴中肟化1.5h。之后，加入40μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，于37℃水浴中硅烷化1.0h；于12000rpm，4℃条件下离心15min后，取上清液进行后续仪器分析。
3.气相色谱质谱联用分析
气相色谱分析条件：色谱柱为DB-5MS毛细管柱，柱长30m，内径250μm，膜厚0.25μm。进样口温度300℃，进样量1μL，分流比10∶1。载气为高纯氦气，其恒定线速度为40cm/s。程序升温程序为初始柱温70℃保持3min后，以5℃/min的速率升至300℃，保持10min。
质谱分析条件：界面温度和离子源温度各为280和230℃，检测电压与调谐电压一致，电离方式为电子轰击，电离电压70eV。溶剂切割时间为6.0min，质荷比扫描范围为33—600，质谱扫描频率为5张谱图/s。
4.质谱数据处理
原始质谱数据导成NetCDF格式后，将XCMS程序导入R2.3.11软件，进行峰匹配和积分，获得鱼卵样本中各个离子峰的面积和保留时间。采用ChromaTOF软件对质谱文件进行离子峰识别、重叠峰去卷积、谱库(NIST11，Wiley和Fiehn库)检索和匹配，对代谢物进行定性，并获得每个代谢物的特征离子。在峰识别与去卷积处理中，峰宽和信噪比分别设为4s和20。此次，通过标样的保留时间、保留指数、质谱碎片特征，进一步确认定性结果。多巴、乳酸和十三酸内标的特征离子分别为218，117和271，对应的保留时间分别为为32.79，8.07和25.94min。多巴和乳酸的含量由其特征离子峰面积与内标峰特征离子峰面积的比值，除以鱼卵重量，再乘以1×105的数值表示，进行后续的统计分析。
5.统计分析
在MetaboAnalyst 3.0上进行主成分分析；由two-tailed Mann-Whitney U test评价多巴和乳酸含量的差异水平；应用SPSS软件进行二元逻辑回归分析、ROC曲线分析。
6.检测方法重复性和稳定性评价
将建立的方法用于鱼卵样本的处理分析，由样本主成分分析图上可知，4个QC样本紧密地聚集，各个QC样本间具有显著的线性相关关系，相关系数分布范围为0.999至1.0(附图1和表1)。此外，从QC样本中离子峰含量的相对标准偏差(RSD)分布看，在2860个离子中，2593个离子RSD小于15％，占总离子数的90.7％；2682和2758个离子RSD分别小于20和30％，各占总离子数的93.8和96.4％(附图2)。综合QC样本分布及各个离子峰RSD分布可知，本发明所步及的鱼卵样本代谢物提取、冻干、衍生化、气相色谱质谱分析等检测过程都具有高度的重复性和稳定性，数据是可靠的，适合于鱼卵样本处理分析。
7.TBBPA暴露诱发的多巴和乳酸紊乱
在亲本未受TBBPA暴露时，子代鱼卵在50和200μg/L TBBPA暴露下，多巴和乳酸都显著性上调(p＜0.05)，并且两种代谢物的变化具有显著相关性(p＜0.05)，随着多巴含量的增加，乳酸也增加，表明神经系统在TBBPA暴露下发生了紊乱(附图3和4)。研究表明，神经系统的紊乱可引起心血管功能的异常。在50和200μg/L TBBPA暴露下，鱼卵的心跳显著加快，提示心脏功能受到神经系统紊乱的影响(附图5)。
8.TBBPA生物毒性及其遗传效应的评价
由于TBBPA暴露可引起神经系统相关的多巴和乳酸紊乱，并进而诱发心血管功能异常，而神经和心血管系统在生物体中发挥至关重要的作用。因而，本发明将多巴和乳酸联合作为生物指标，基于二元逻辑回归模型，评价TBBPA生物毒性及其遗传效应，结果表明，本发明采用的方法可正确地识别受TBBPA暴露的鱼卵样本，正确率为100.0％；如果亲本受TBBPA暴露，从子代鱼卵亦可正确识别亲本是否受TBBPA暴露，正确率为100.0％。以上结果显示，本发明提供的方法可正确地评价TBBPA生物毒性及其遗传效应。此外，应用ROC分析评价本发明的诊断性能，结果表明，本发明对TBBPA生物毒性的诊断性能优越，最优灵敏度和特异性都可达到100.0％，AUC为1.0；对TBBPA生物毒性遗传效应的诊断性能亦优越，最优灵敏度和特异性都可达到100.0％，AUC为1.0(附图6)。
9.结论：利用本发明提供的方法可从神经和心血管系统方面，由多巴和乳酸含量信息，基于二元逻辑回归模型，实现高灵敏、高特异性地评价TBBPA生物毒性及其遗传效应的目的；此外，本发明具有反应条件温和，高重复性和稳定性的特点，适合评价TBBPA等溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应。
表1：QC样本两两间皮尔森(Pearson)相关系数。
表1
Pearson r QC1 QC2 QC3 QC4
QC1 1.000 0.999 0.999 0.999
QC2 0.999 1.000 0.999 0.999
QC3 0.999 0.999 1.000 0.999
QC4 0.999 0.999 0.999 1.000

Claims (10)

1.一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法，其特征在于：
受试生物经溴代阻燃剂暴露后，进行样本的前处理，由气相色谱质谱方法检测样本中多巴和乳酸的含量，基于二元逻辑回归模型，计算样本的分类预测概率值，再根据确定的临界值，评价溴代阻燃剂的生物毒性及其遗传效应，并分析其诊断性能；
溴代谢阻燃剂主要包括四溴双酚A、多溴联苯醚或六溴环十二烷中的一种或二种以上；受试生物为海水青鱂鱼或日本青鱂鱼。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
生物毒性的识别方法：亲本受试生物未经溴代阻燃剂暴露，子代受试生物经溴代阻燃剂暴露后，收集子代生物样本进行前处理，采用气相色谱质谱方法检测样本中多巴和乳酸的含量，基于二元逻辑回归模型，预测样本的分类概率值，并将样本分类概率的临界值设为0.5，若样本分类预测概率值＜0.5，则溴代阻燃剂未引起生物毒性；若样本分类预测概率值≥0.5，则溴代阻燃剂暴露诱发了生物毒性；对照组为亲本和子代均未受溴代阻燃剂暴露的子代受试生物；
生物毒性遗传效应的识别方法：亲本受试生物经溴代阻燃剂暴露，而子代受试生物未经溴代阻燃剂暴露，收集子代生物样本，进行样本前处理，采用气相色谱质谱方法检测样本中多巴和乳酸的含量，基于二元逻辑回归模型，预测样本的分类概率值，并将样本分类概率的临界值设为0.5，若样本分类预测概率值＜0.5，则亲本和子代受试生物均未受溴代阻燃剂暴露；若样本分类预测概率值≥0.5，则溴代阻燃剂暴露诱发了生物毒性，并且此毒性效应可遗传给子代；对照组为亲本和子代均未受溴代阻燃剂暴露的子代受试生物。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：
评价生物毒性中二元逻辑回归方程的建立：亲本受试生物未经溴代阻燃剂暴露，子代受试生物经溴代阻燃剂暴露后，子代受试生物中多巴和乳酸含量显著升高，p＜0.05，two-tailed Mann-Whitney U test；所述二元逻辑回归模型为：样本分类预测概率=1/[1+e-(c+K*a+L*b)]，其中，c为常数项；a为多巴含量；b为乳酸含量；K为多巴在方程中的系数；L为乳酸在方程中的系数；将测得的多巴和乳酸含量代入SPSS软件二元逻辑回归模型进行分析，可得c，K和L，即可获得评价生物毒性的二元逻辑回归方程，再由多巴和乳酸含量，计算各个样本的分类预测概率；将样本分类预测概率的临界值设为0.5，若样本分类预测概率值＜0.5，则溴代阻燃剂未引起生物毒性；若样本分类预测概率值≥0.5，则溴代阻燃剂暴露诱发了生物毒性；对照组为亲本和子代均未受溴代阻燃剂暴露的子代受试生物；
评价生物毒性遗传效应中二元逻辑回归方程的建立：亲本受试生物经溴代阻燃剂暴露，而子代受试生物未经溴代阻燃剂暴露，子代样本中多巴和乳酸含量显著升高，p＜0.05，two-tailed Mann-Whitney U
test；所述二元逻辑回归模型为：样本分类预测概率=1/[1+e-(c+K*a+L*b)]，其中，c为常数项；a为多巴含量；b为乳酸含量；K为多巴在方程中的系数；L为乳酸在方程中的系数；将测得的多巴和乳酸含量代入SPSS软件二元逻辑回归模型进行分析，可得c，K和L，即可获得评价生物毒性遗传效应的二元逻辑回归方程，再由多巴和乳酸含量，计算各个样本的分类预测概率；将样本分类预测概率的临界值设为0.5，若样本分类预测概率值＜0.5，则亲本和子代受试生物均未受溴代阻燃剂暴露；若样本分类预测概率值≥0.5，则溴代阻燃剂暴露诱发了生物毒性，并且此毒性效应可遗传给子代；对照组为亲本和子代均未受溴代阻燃剂暴露的子代受试生物。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：受试生物为海水青鱂、日本青鱂；
收集的受试生物样本包括各部分器官、组织或完整个体中的一种或二种以上。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
受试生物溴代阻燃剂暴露处理：亲本受试生物未经溴代阻燃剂暴露，子代受试生物经溴代阻燃剂暴露后，收集子代受试生物样本进行后续的处理分析，识别溴代阻燃剂的生物毒性；亲本受试生物经溴代阻燃剂暴露，而子代受试生物未经溴代阻燃剂暴露，收集子代受试生物样本进行后续的处理分析，识别溴代阻燃剂生物毒性的遗传效应；对照组为亲本和子代均未受溴代阻燃剂暴露的子代受试生物样本；暴露浓度为50-200μg/L。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
受试生物样本前处理步骤：
Figure 992838DEST_PATH_IMAGE001
精确称取对照组和处理组受试生物样本,分别置于离心管中，每组3个或3个以上重复；
Figure 625944DEST_PATH_IMAGE002
于离心管中先后加入氧化锆小球和体积浓度为50-100%的甲醇提取液，内含5-10μg/mL十三酸作为内标，置于研磨仪中破碎后，离心分离，分别取每一待测样本80%上清液；
Figure 726625DEST_PATH_IMAGE003
取出所有待测样本中剩余的上清液混合，制作一个大的质量控制样本，涡旋充分混合后，分成每份与待测样本等体积上清液的质量控制样本；
Figure 657540DEST_PATH_IMAGE004
每5-10个待测样本插入1个质量控制样本，在后续的冻干、衍生化与气相色谱质谱分析中，与其它待测样本同样的参数处理；
Figure 35432DEST_PATH_IMAGE005
冻干样本先经甲氧胺吡啶溶液进行肟化反应，再由N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺进行硅烷化反应后，离心取上清液进行后续的仪器分析。
7.根据权利要求1或6所述方法，其特征在于：仪器分析参数：
Figure 226723DEST_PATH_IMAGE001
气相色谱分析条件：色谱柱为DB-5 MS毛细管柱，柱长30m，内径250μm，膜厚0.25μm；进样口温度300℃，进样量1μL，分流比10：1；载气为高纯氦气，其恒定线速度为40cm/s；程序升温程序为初始柱温70℃保持3min后，以5℃/min的速率升至300℃，保持10min；
Figure 939333DEST_PATH_IMAGE002
质谱分析条件：界面温度和离子源温度各为280和230℃，检测电压与调谐电压一致，电离方式为电子轰击，电离电压70eV；溶剂切割时间为6.0min，质荷比扫描范围为33-600，质谱扫描频率为5张谱图/s。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于：质谱数据处理：原始质谱数据导成NetCDF格式后，将XCMS程序导入R2.3.11软件，进行峰匹配和积分，获得样本中各个离子峰的面积和保留时间；采用ChromaTOF软件对质谱文件进行重叠峰去卷积、谱库检索和匹配，对代谢物进行定性，并获得每个代谢物的特征离子；通过标样的保留时间、保留指数、质谱碎片特征，进一步确认定性结果；多巴和乳酸的含量由其特征离子峰面积与内标峰特征离子峰面积的比值，除以样本重量，再乘以1×105的数值表示，进行后续的统计分析。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于：检测方法的评价：根据质量控制样本在主成分分析图的分布情况、质量控制样本两两间的相关系数、质量控制样本中离子峰含量的相对标准偏差分布情况，评价检测方法的稳定性、重复性和可靠性，主要评价方法如下：
Figure 159093DEST_PATH_IMAGE001
质量控制样本在所有样本的主成分分析图上聚集于一起；
Figure 234234DEST_PATH_IMAGE002
质量控制样本两两间都具有显著的线性相关关系p＜0.05，且相关系数至少0.9；
Figure 943564DEST_PATH_IMAGE003
质量控制样本中离子含量相对标准偏差小于15%的离子数至少占总离子数的60%；若数据同时满足以上3个条件，则所采用的检测方法具有高度的重复性、稳定性和可靠性；若有一项不符合，则所采用的检测方法重复性、稳定性和可靠性不高。
10.根据权利要求1所述方法，其特征包括生物毒性及其遗传效应评价结果的诊断性能分析：由样本的分类预测概率值，获得各个样本的分类，进而可得样本分类正确率，若生物毒性及其遗传效应识别结果的正确率在80%及以上，则相关诊断性能优良；以样本分类预测概率为变量，进行受试者工作特征曲线分析，若生物毒性及其遗传效应评价结果的最优灵敏度、特异性及受试者工作特征曲线下面积分别在80%，80%和0.8及以上，则相关生物毒性及遗传效应评价结果灵敏度和特异性高，诊断性能优良。
CN201610804112.1A 2016-09-06 2016-09-06 一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法 Active CN107796934B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610804112.1A CN107796934B (zh) 2016-09-06 2016-09-06 一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610804112.1A CN107796934B (zh) 2016-09-06 2016-09-06 一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107796934A CN107796934A (zh) 2018-03-13
CN107796934B true CN107796934B (zh) 2020-03-10

Family

ID=61530548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610804112.1A Active CN107796934B (zh) 2016-09-06 2016-09-06 一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107796934B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109164189A (zh) * 2018-10-17 2019-01-08 河北科技大学 γ-六溴环十二烷对映体植物毒性的评价方法
CN110470657A (zh) * 2019-09-06 2019-11-19 淮阴师范学院 一种评价多溴联苯醚发育毒性的方法
CN115618637B (zh) * 2022-10-31 2024-01-23 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7998704B2 (en) * 2002-03-07 2011-08-16 Carnegie Mellon University Methods for magnetic resonance imaging
CN103808815A (zh) * 2012-11-13 2014-05-21 云南健牛生物科技有限公司 一种食品包装材料-聚碳酸酯 （pc）材料中的双酚a（bpa）的快速检测方法
CN105021716A (zh) * 2014-04-21 2015-11-04 中国科学院大连化学物理研究所 一种有机污染物细胞代谢毒性的评估方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107796934A (zh) 2018-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ceja-Navarro et al. Gut anatomical properties and microbial functional assembly promote lignocellulose deconstruction and colony subsistence of a wood-feeding beetle
JP5091861B2 (ja) クロマトグラフィー／マススペクトロメトリーを用いてサンプルを分析する手段と方法
Roessner et al. What is metabolomics all about?
Aliferis et al. Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives
Stensmyr et al. A conserved dedicated olfactory circuit for detecting harmful microbes in Drosophila
CN110366596A (zh) 用于对复杂异质群落中的完整微生物株系进行分析、确定其功能关系及相互作用以及基于此来识别和合成生物活性改性剂的方法、设备和系统
CN107796934B (zh) 一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法
Minard et al. The microbiome of the Melitaea cinxia butterfly shows marked variation but is only little explained by the traits of the butterfly or its host plant
Schuman et al. How does plant chemical diversity contribute to biodiversity at higher trophic levels?
US8263931B2 (en) Method for identifying in particular unknown substances by mass spectrometry
Olinger et al. Sponges with microbial symbionts transform dissolved organic matter and take up organohalides
Tao et al. Haemolymph metabolomic differences in silkworms (Bombyx mori L.) under mulberry leaf and two artificial diet rearing methods
Selander et al. Solid phase extraction and metabolic profiling of exudates from living copepods
Young et al. Metabolic profiling of mussel larvae: effect of handling and culture conditions
Zverev et al. Molecular analysis of the rhizosphere microbial communities from gramineous plants grown on contrasting soils
CN109900884A (zh) 一种基于代谢组学的短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的研究方法
Reveglia et al. Untargeted and targeted LC-MS/MS based metabolomics study on in vitro culture of Phaeoacremonium species
Späth et al. Metabolomics reveals changes in metabolite profiles due to growth and metamorphosis during the ontogeny of the northern damselfly
Geddes-McAlister et al. Examining the impacts of co2 concentration and genetic compatibility on perennial ryegrass—Epichloë festucae var lolii interactions
Bláha et al. Bioassay use in the field of toxic cyanobacteria
Hao et al. Comparative metabolic profiling of four transgenic maize lines and two non-transgenic maize lines using high-performance liquid chromatography mass spectrometry
Smith et al. Spatially mapping the baseline and bisphenol-A exposed Daphnia magna lipidome using desorption electrospray ionization—mass spectrometry
Yang et al. Sublethal exposure to cadmium induces chemosensory dysfunction in Fire Ants
CN107589200B (zh) 一种利用诊断标志物评价微量外源化学物早期毒性的方法及其应用
Gutiérrez et al. The lipidome of an omnivorous insect responds to diet composition and social environment

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant