CN107589200B - 一种利用诊断标志物评价微量外源化学物早期毒性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测领域，特别涉及一种利用诊断标志物评价微量外源化学物早期毒性的方法及其应用。一种利用诊断标志物评价微量外源化学物早期毒性的方法，检测诊断标志物包括：L‑缬氨酸、N‑乙酰‑L‑天门冬氨酸、溶血卵磷脂、肌酐、2‑磷酸甘油酸中的任一种或多种。在研究外源化学物的过程中，发现外源化学物能够破坏斑马鱼体内的氨基酸平衡，影响蛋白质的分解代谢，这种在发育阶段的扰动与其毒性机制相关联，发明人发现，将斑马鱼模型和代谢组学技术结合起来，能够大大提高毒性预测方法的灵敏度。因此，可应用上述斑马鱼代谢物指标的消长变化对外源性化学物早期毒性进行判别。

Description

一种利用诊断标志物评价微量外源化学物早期毒性的方法及 其应用

技术领域

本发明涉及检测领域，具体而言，涉及一种利用诊断标志物评价微量外源化学物早期毒性的方法及其应用。

背景技术

污染物的不断排放给世界带来了巨大的环境问题。农药、重金属等是主要的环境污染源，其通过工业或城市的流出物到达水生态系统，蓄积到动植物体内，经食物链对人类身体健康造成严重危害。

污染物暴露对机体危害的早期表现不明显，传统的症状预警方式可能不能表述毒性的发生，尤其是在初期或轻度毒性阶段。一旦临床上出现明显的毒性症状，如某些癌症、组织功能损伤和神经障碍，将可能成为不可逆转的损伤，最终造成难以弥补的后果。因此，对毒性的早期检测和及时预警至关重要。

毒性产生的基本原理是毒性反应破坏正常细胞的结构和功能，改变细胞代谢途径中内源性代谢物的稳态，通过直接或间接效应造成靶组织内源性代谢产物、基因或蛋白的扰动。体内生物分子或代谢物的动态变化可以作为毒性损伤的标志物，其比传统病理学指标具有更好的一致性和预见性，可为中毒早期诊断提供依据，及时监测健康损害的发生、发展，并及时预防和治疗。

代谢组学方法通过测定小分子量的内源性代谢物质的整体状态及变化规律，建立内在和外在因素影响下代谢整体的变化轨迹，从而反映某种病理过程中所发生的一系列生物事件。代谢组学技术评价化学物暴露带来的毒性效应，并进一步推断其毒性作用的分子机制具有快速、灵敏度高、选择性强等特点，特别是在低剂量或环境剂量污染物的毒性效应评估方面具有很大的优势。

斑马鱼与人类基因的相似度高达87％，其遗传性状稳定，胚胎和遗传学背景及操作技术较为完善。同体外模型相比，斑马鱼能有效地模拟在体完整代谢体系，可以体现化学物作用的整体观；而与哺乳动物体内模型相比，它克服了在体动物繁殖速度慢、实验周期长、样品处理分析困难、费用昂贵、受到法律限制等缺陷。近年来，斑马鱼模式动物在国内江、河水体污染监测和控制等方面的应用逐渐受到研究机构重视。利用斑马鱼的形态学表型的发育变化可以方便的观察外源性毒物引起的毒性，在实验的便利性方面显著优于小鼠等哺乳动物。但是对于水体中的污染物，往往到达一定剂量才能引起斑马鱼的表型异常。在现有的研究中，实验者为了突出生物学上的异常反应，常用的方法就是加大剂量，这样虽然能否观察到毒性反应，但是所谓的环境剂量也往往是污染集中的水域样本。但是对于外源性的化学物的毒性的预测，尤其是水环境中的微量化学物的预测，现有的方法存在灵敏度不够高的缺陷。利用先进的模型和技术建立灵敏度高的预警方法对于生态环境的保护、人类健康的保障是十分重要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种利用诊断标志物评价微量外源化学物早期毒性的方法，以斑马鱼作为动物模型，利用代谢组学技术，以诊断标志物为核心指标，对毒性化学物进行早期、初步的检测，该方法操作简单，具有客观、灵敏、可靠的特点。

本发明的第二目的在于提供一种所述的方法在环境或临床医学标准化检测中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种利用诊断标志物评价微量外源化学物早期毒性的方法，检测诊断标志物包括：L-缬氨酸、N-乙酰-L-天门冬氨酸、溶血卵磷脂、肌酐、2-磷酸甘油酸中的任一种或多种。

在研究外源化学物的过程中，发明人发现，将斑马鱼模型和代谢组学技术结合起来，能够大大提高毒性预测方法的灵敏度。经过大量斑马鱼模型试验研究，利用LC-MS/TOF检测技术建立斑马鱼代谢组学技术，通过斑马鱼组织样本二维数据矩阵模型与差异代谢物分析，发明人发现外源化学物能够破坏斑马鱼体内的氨基酸平衡，影响蛋白质的分解代谢，这种在发育阶段的扰动与其毒性机制相关联，尤其是组织代谢物中L-缬氨酸、N-乙酰-L-天门冬氨酸、溶血卵磷脂、肌酐、2-磷酸甘油酸的含量会出现显著改变。因此，可应用上述斑马鱼代谢物指标的消长变化对环境重金属化学物早期毒性进行判别。

进一步地，相对于正常样品，所述诊断标志物出现以下变化：L-缬氨酸、N-乙酰-L-天门冬氨酸、溶血卵磷脂降低，肌酐、2-磷酸甘油酸升高，则判断为外源化学物会引起发育毒性。

诊断标志物通过与已有标准品、代谢物数据库对比和二级离子碎片匹配来确认。

更进一步地，相对于正常样品，所述诊断标志物出现以下变化：DM(L-缬氨酸)≤0.9、DM(N-乙酰-L-天门冬氨酸)≤0.9)、DM(溶血卵磷脂)≤0.6；DM(肌酐)≥1.5、DM(2-磷酸甘油酸)≥2，则判定为外源化学物引起发育毒性，其中，DM值为某一诊断标志物在待测样品中含量与正常样品中含量的比值。

正常样品与待测样品相比不同的是，不含有外源化学物，其他均相同。

进一步地，斑马鱼受精后2-8h的胚胎作为处理对象，处理90-120h后，提取仔鱼的代谢物即为检测所述标志物的对象。即检测标志物的对象为全组织提取物。

进一步地，所述处理为将所述胚胎暴露在含有低浓度的外源化学物的溶液中。即外源化学物主要为农药、重金属或化工中间体等。这里的低浓度是依据外源化学物对人体的影响大小而言，一般在0.001-0.05μM之间。

进一步地，所述重金属包括镉、铅、铜、汞、锡。

进一步地，所述农药包括阿特拉津，西玛津，乐果。

进一步地，所述处理的过程中，温度保持在28-29℃。

进一步地，提取仔鱼的代谢物的步骤具体为：收集仔鱼，纯水清洗，吸干水分；

加入低温的体积百分数为80％±2％的甲醇水溶液，低温破碎；

低温放置30±5min，低温离心，去上清液，吹干，加体积百分数为50％±1％的甲醇水溶液复溶样品，即得。

这里的低温是指10℃以下，一般为0-4℃。

本发明中，诊断标志物的检测可采用现有技术的检测方法进行。

如，所述标志物检测采用超高效液相色谱仪-四级杆飞行时间串联质谱仪进行；

色谱检测条件：超高效液相色谱系统，色谱柱为C18柱，进样量2～8μL，柱温30～50℃，流动相为溶液A-溶液B，梯度洗脱程序为0～1min，2％溶液B；1～11min，2％～50％溶液B；11～17min，50％～98％溶液B；17～18min，98％溶液B；18～18.5min，98％～2％溶液B；18.5～21min，2％溶液B；

溶液A为体积浓度0.1％±0.02％的甲酸水溶液，溶液B为体积浓度0.1％±0.02％的甲酸乙腈；

质谱检测条件：Thermo LTQ Orbitrap XL，ESI电喷雾离子源，正负离子模式，正离子喷雾电压4.80kV，负离子喷雾电压4.50kV；鞘气及辅助气为氮气，鞘气流速40±2arb，辅助气流速15±1arb，毛细管温度325±5℃，电压35V/－15V，管透镜电压50V/-50V，分辨率60000进行全扫描，扫描范围50～1000m/z，二级质谱碰撞能量ESI⁺45eV/ESI^－35eV。

超高效液相色谱系统可采用日本岛津公司超高效液相色谱系统。

进一步地，色谱柱为(BEH)C18柱，进样量4μL，柱温40℃。

本发明毒性预测方法首先对数据进行主成分分析(PCA)，考察是否存在异常样本数据。为了进一步关注斑马鱼组织中代谢物的变化趋势，采用了正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)对各组斑马鱼样本建模，得到了与非监督PCA模型相同的结果。通过有监督两组之间的OPLS-DA模型，可以鉴别区分各组代谢轮廓贡献较大的代谢物，寻找最相关的诊断标志物。通过诊断标志物检测外源化学物的早期毒性，操作简便，灵敏度高，对预测早期毒性意义重大，并且易于推广使用。

进一步地，所述的方法在环境或临床医学标准化检测中的应用。

代谢物的变化可灵敏地指示和确定外来干扰物在组织和器官水平的毒性效应，某种特定代谢物的蓄积可能标志着某通路的缺陷或某信号响应的激活，而代谢物的动态变化可以作为毒性损伤的标志物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明以斑马鱼为毒性评价模型，结合代谢组学，利用斑马鱼代谢物指标的消长变化对外源性化合物早期毒性进行判别，操作简单，具有客观、灵敏、可靠的特点。

(2)在一般毒性指标和行为学指标均未发生明显异常的情况下，LC-TOF/MS的技术手段能够灵敏检测微量外源性化学物对生物代谢物指纹图谱的影响，并可以通过现有的二维数据矩阵分析技术确立对毒性有贡献的相关差异代谢组分，以此对外源化学物的危险效果进行判别。该方法拓展了致毒剂量的检测下限，在监测和诊断实验动物、水产养殖动物乃至临床人体健康状况方面将发挥常规病理(生理)学技术不可替代的作用。

(3)本发明筛选得到用于外源化学物早期毒性检测的诊断标志物包括：L-缬氨酸、N-乙酰-L-天门冬氨酸、溶血卵磷脂、肌酐、2-磷酸甘油酸，并建立了检测标准，操作规范有序、结果准确可靠，有利于作为安全应急检测技术标准进行推广。

(4)斑马鱼具有繁殖力强、遗传背景稳定等特点，在多种外源化学物长期暴露毒性效应评估方面可发挥快速、选择性强的优势，由于其与人类基因的相似度高达87％，因此，可利用其作为模型在环境或临床医学标准化检测中应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中本发明的代谢组学的方法氯化镉暴露组的斑马鱼与正常组斑马鱼的差异代谢物的示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本发明方法与常规的一般毒性方法比较：

(1)斑马鱼一般毒性实验样品处理方法

收集正常发育的斑马鱼2hpf受精卵，置6孔板中，每孔加入30个，设置0，0.01、0.05、0.1、0.25，1，4，10，40，100μM的浓度的氯化镉暴露组，每组浓度平行3次。将微孔板置于28.5℃恒温光照培养箱中至96hpf，每隔24h观察一次，记录死亡数。

(2)代谢组实验加药处理

取健康2hpf(受精后小时数)的斑马鱼胚胎，设置空白组(正常样品)和0.05、0.1、0.25μM氯化镉暴露组，给药后28.5℃孵箱中继续孵化。

(3)代谢组样品处理

96hpf时收集各组仔鱼，每组50条斑马鱼，转移至1.5mL EP管，纯水清洗三次，吸干水分，加入800μL甲醇水混合溶液(体积比为4:1，-20℃)，加入钢珠，放置高通量组织研磨仪中在70Hz下处理1min；放入超声仪室温处理30min，冰上放置30min；在14000rpm 4℃离心10min，取上清液转移到一个新的1.5mL离心管中，样品用氮吹仪吹干；200μL甲醇水溶液(1:1，4℃)复溶样品。

(4)代谢组实验分析检测

采用日本岛津超高效液相色谱系统，色谱柱为(BEH)C18柱，进样量4μL，柱温40℃，流动相为0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)。梯度洗脱程序为0～1min，2％B；1～11min，2％～50％B；11～17min，50％～98％B；17～18min，98％B；18～18.5min，98％～2％B；18.5～21min，2％B。

质谱检测条件为：Thermo LTQ Orbitrap XL，ESI电喷雾离子源，正负离子模式，正离子喷雾电压4.80kV，负离子喷雾电压4.50kV；鞘气及辅助气为氮气，鞘气流速40arb，辅助气流速15arb。毛细管温度325℃，电压35V/－15V，管透镜电压50V/－50V，分辨率60000进行全扫描，扫描范围50～1000m/z。二级质谱碰撞能量ESI⁺45eV/ESI^－35eV。

(5)代谢组学数据分析

利用软件对代谢指纹图谱原始色谱峰进行检测和匹配，将原始数据转换为mz XML格式，然后通过XCMS软件程序对色谱中的信号进行数据提取、背景扣除、滤噪、保留时间校正、谱峰匹配和标准化预处理；所有峰位按照80％的原则进行取舍，数据少于80％视为随机噪音干扰直接去除，多于80％视为有效物质，并用有效数据的物质峰均值代替缺失值，得到优化后的二维数据矩阵变量数据列表。

对空白样本和模型毒物样本的数据矩阵依次进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，分析差异代谢产物，即诊断标志物。

数据处理方法判定的诊断标志物是通过与已有标准品、代谢物数据库对比和二级离子碎片匹配来确认的。

(6)结果

斑马鱼一般毒性毒性实验中，最基本的指标就是致死率。在本实验中，在不同浓度的氯化镉暴露的情况下，随着剂量升高，斑马鱼胚胎逐渐出现不同程度的死亡，剂量在10μM时出现显著性差异的死亡率上升，计算半数致死浓度(LC₅₀)为23.3μM。

本发明的代谢组学的方法，得到的0.05和0.1μM氯化镉暴露组的斑马鱼与正常组斑马鱼的差异代谢物都明显与正常对照组不同，如图1所示。

进一步分析发现，采用外源化学物处理斑马鱼模型后，处理的斑马鱼样本中诊断标志物的水平与正常样品相比，用DM值表示各诊断标志物的变化水平，DM(L-缬氨酸)≤0.9，DM(N-乙酰-L-天门冬氨酸)≤0.9)，DM(溶血卵磷脂)≤0.6，DM(肌酐)≥1.5，DM(2-磷酸甘油酸)≥2，若斑马鱼体内的5种诊断标志物出现了这样的变化特征，则可判定为发生了对机体的发育毒性(见表1)。

表1 0.05μM氯化镉暴露组的斑马鱼与正常组斑马鱼的差异代谢物

NO.	m/z	离子	代谢物	DM值	界值
						1	118	[M+H]+	L-缬氨酸	0.839	0.9
2	186	[M+H]+	2-磷酸甘油酸	2.209	2.0
						3	570	[M+H]+	溶血卵磷脂	0.302	0.6
4	112	[M-H]-	肌酐	1.684	1.5
						5	174	[M-H]-	N-乙酰-L-天门冬氨酸	0.891	0.9

通过对比可知，同样是斑马鱼模型，不同的检测指标和方法检测到的结果是不同的。在一般毒性中出现显著性差异的剂量是10μM，LC₅₀为23.3μM。但是利用本发明的方法，发现氯化镉在0.05μM水平，即引起了斑马鱼发育毒性的早期损伤。

这个对比结果表明，本发明的方法的灵敏性优于一般毒性实验指标，并且检测易于操作，稳定性佳。

实施例2

本发明建立的方法与斑马鱼行为学评价方法比较：

(1)在斑马鱼模型上采用行为学预测方法：

取发育2hpf的斑马鱼幼鱼于6孔板中，每孔15条左右，设置对照组和0.05，0.10，0.25，0.50和1.00μM氯化镉暴露组，给药后放入28.5℃孵箱中继续孵化，平行3次实验操作。每天更换新的暴露溶液，及时取出死亡鱼卵或幼鱼。96dpf时幼鱼移入行为运动仪内，适应5min后开始记录幼鱼自发运动轨迹，记录10min不间断视频，平行3次检测。

(2)在斑马鱼模型上采用本发明预测方法：

方法同上。检测5种诊断标志物的丰度，并计算变化倍数。

(3)结果

在斑马鱼模型实验中，行为学指标是比一般毒性指标更为灵敏的指标。氯化镉剂量在0.25μM以上时，斑马鱼运动距离明显增加，出现急转的情况，斑马鱼运动速率加快，运行的轨迹紊乱，表明斑马鱼行为学开始出现异常。

而在本发明的方法结果中，氯化镉剂量在0.05μM水平，较正常组相比L-缬氨酸、N-乙酰-L-天门冬氨酸、溶血卵磷脂的含量出现显著下降，而肌酐、2-磷酸甘油酸的含量出现显著上升。斑马鱼体内的5种代谢物发生了相应的变化，代表着体内代谢组网络发生了明显异常，即反映了待测化合物引起了发育毒性的早期损伤，见表2。

表2 0.05μM氯化镉暴露组的斑马鱼与正常组斑马鱼的差异代谢物

NO.	m/z	离子	代谢物	DM值	界值
						1	118	[M+H]+	L-缬氨酸	0.808	0.9
2	186	[M+H]+	2-磷酸甘油酸	2.231	2.0
						3	570	[M+H]+	溶血卵磷脂	0.312	0.6
4	112	[M-H]-	肌酐	1.680	1.5
						5	174	[M-H]-	N-乙酰-L-天门冬氨酸	0.791	0.9

本对比试验结果表明，本发明的方法的灵敏性优于行为学实验指标，并且检测易于操作，稳定性佳。

实施例3

一种利用斑马鱼模型预测外源化学物早期毒性的方法，评价硝酸铅的发育毒性：

待测的硝酸铅溶液，设置0.001、0.006、0.012μM硝酸铅剂量组，加入到培养皿中，放入受精后6h(hpf)的斑马鱼胚胎，平行设置空白组(正常样品)和样品暴露组，每组50个胚胎，给药后放入28.5℃培养箱中，到120hpf时，收集各组仔鱼，置带盖EP管中，纯水清洗三次，吸干水分，加入800μL甲醇水混合溶液(4:1，-20℃)，加入钢珠，放置组织研磨仪中在70Hz破碎1min；冰上放置30min；在14000rpm 4℃离心10min，取上清液转移到一个新的离心管中，用氮吹仪吹干，加入200μL甲醇水溶液(1:1，4℃)复溶样品，即得。

采用超高效液相色谱系统进行检测，色谱柱为(BEH)C18柱，进样量2～8μL，柱温40℃，流动相为0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)。梯度洗脱程序为0～1min，2％B；1～11min，2％～50％B；11～17min，50％～98％B；17～18min，98％B；18～18.5min，98％～2％B；18.5～21min，2％B。

质谱检测条件：Thermo LTQ Orbitrap XL，ESI电喷雾离子源，正负离子模式，正离子喷雾电压4.80kV，负离子喷雾电压4.50kV；鞘气及辅助气为氮气，鞘气流速40arb，辅助气流速15arb。毛细管温度325℃，电压35V/－15V，管透镜电压50V/－50V，分辨率60000进行全扫描，扫描范围50～1000m/z。二级质谱碰撞能量ESI⁺45eV/ESI^－35eV。检测5种诊断标志物的丰度，并计算变化倍数。

在实验剂量范围内，发现在0.006μM以上剂量时，斑马鱼体内代谢网络与正常组明显偏离。进一步分析5种生物标志物，结果如表3所示。

表3 0.006μM硝酸铅暴露组的斑马鱼与正常组斑马鱼的差异代谢物

NO.	m/z	离子	代谢物	DM值	界值
						1	118	[M+H]+	L-缬氨酸	0.814	0.9
2	186	[M+H]+	2-磷酸甘油酸	2.523	2.0
						3	570	[M+H]+	溶血卵磷脂	0.512	0.6
4	112	[M-H]-	肌酐	1.667	1.5
						5	174	[M-H]-	N-乙酰-L-天门冬氨酸	0.780	0.9

上述诊断标志物同实施例1变化趋势相同，即L-缬氨酸、N-乙酰-L-天门冬氨酸、溶血卵磷脂含量下降，肌酐、2-磷酸甘油酸含量上升。因此，该方法可用于重金属铅的毒性早期预测。

实施例4

一种利用斑马鱼模型预测外源化学物早期毒性的方法，评价氯化汞的发育毒性：

待测的醋酸汞溶液，设置0.001、0.005、0.025μM氯化汞剂量组，加入到培养皿中，放入受精后8hpf的斑马鱼胚胎，平行设置空白组和样品暴露组，每组80个胚胎，给药后放入28.5℃培养箱中，到96hpf时，收集各组仔鱼，置带盖EP管中，纯水清洗三次，吸干水分，加入900μL甲醇水混合溶液(4:1，-20℃)，加入钢珠，放置组织研磨仪中70Hz破碎3min；冰上放置40min；在14000rpm 4℃离心8min，取上清液转移到一个新的离心管中，用氮吹仪吹干，加入300μL甲醇水溶液(1:1，4℃)复溶样品，即得。

采用超高效液相色谱系统进行检测，色谱柱为(BEH)C18柱，进样量2～8μL，柱温40℃，流动相为0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)。梯度洗脱程序为0～1min，2％B；1～11min，2％～50％B；11～17min，50％～98％B；17～18min，98％B；18～18.5min，98％～2％B；18.5～21min，2％B。

质谱检测条件：Thermo LTQ Orbitrap XL，ESI电喷雾离子源，正负离子模式，正离子喷雾电压4.80kV，负离子喷雾电压4.50kV；鞘气及辅助气为氮气，鞘气流速40arb，辅助气流速15arb。毛细管温度325℃，电压35V/－15V，管透镜电压50V/－50V，分辨率60000进行全扫描，扫描范围50～1000m/z。二级质谱碰撞能量ESI⁺45eV/ESI^－35eV。

检测5种诊断标志物的丰度，并计算变化倍数。结果发现在实验剂量范围内，氯化汞均引起了斑马鱼代谢组的改变，进一步对0.001μM剂量组的结果分析如下，结果见表4。

表4 0.001μM氯化汞暴露组的斑马鱼与正常组斑马鱼的差异代谢物

NO.	m/z	离子	代谢物	DM值	界值
						1	118	[M+H]+	L-缬氨酸	0.813	0.9
2	186	[M+H]+	2-磷酸甘油酸	2.262	2.0
						3	570	[M+H]+	溶血卵磷脂	0.477	0.6
4	112	[M-H]-	肌酐	1.805	1.5
						5	174	[M-H]-	N-乙酰-L-天门冬氨酸	0.798	0.9

如表4所示，诊断标志物变化趋势与实施例1相同，该方法可用于重金属汞的毒性早期预测。

实施例5

一种利用斑马鱼模型预测外源化学物早期毒性的方法，评价阿特拉津的毒性。

待测的阿特拉津溶液，设置0.01、0.05、0.1μM阿特拉津剂量组，加入到培养皿中，放入受精后2h(hpf)的斑马鱼胚胎，平行设置空白组(正常样品)和样品暴露组，每组50个胚胎，给药后放入28.5℃培养箱中，到96hpf时，收集各组仔鱼，置带盖EP管中，纯水清洗三次，吸干水分，加入800μL甲醇水混合溶液(4:1，-20℃)，加入钢珠，放置组织研磨仪中在70Hz破碎1min；冰上放置30min；在14000rpm 4℃离心10min，取上清液转移到一个新的离心管中，用氮吹仪吹干，加入200μL甲醇水溶液(1:1，4℃)复溶样品，即得。

采用超高效液相色谱系统进行检测，色谱柱为(BEH)C18柱，进样量2～8μL，柱温40℃，流动相为0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)。梯度洗脱程序为0～1min，2％B；1～11min，2％～50％B；11～17min，50％～98％B；17～18min，98％B；18～18.5min，98％～2％B；18.5～21min，2％B。

质谱检测条件：Thermo LTQ Orbitrap XL，ESI电喷雾离子源，正负离子模式，正离子喷雾电压4.80kV，负离子喷雾电压4.50kV；鞘气及辅助气为氮气，鞘气流速40arb，辅助气流速15arb。毛细管温度325℃，电压35V/－15V，管透镜电压50V/－50V，分辨率60000进行全扫描，扫描范围50～1000m/z。二级质谱碰撞能量ESI⁺45eV/ESI^－35eV。检测5种诊断标志物的丰度，并计算变化倍数。

在实验剂量范围内，发现在0.01μM以上剂量时，斑马鱼体内代谢网络与正常组明显偏离。进一步分析5种生物标志物，结果如表5所示。

表5 0.01μM阿特拉津暴露组的斑马鱼与正常组斑马鱼的差异代谢物

实施例6

一种利用斑马鱼模型预测外源化学物早期毒性的方法，评价西玛津的毒性。

待测的西玛津溶液，设置0.01、0.03、1.0μM西玛津剂量组，加入到培养皿中，放入受精后6h(hpf)的斑马鱼胚胎，平行设置空白组(正常样品)和样品暴露组，每组50个胚胎，给药后放入28.5℃培养箱中，到96hpf时，收集各组仔鱼，置带盖EP管中，纯水清洗三次，吸干水分，加入800μL甲醇水混合溶液(4:1，-20℃)，加入钢珠，放置组织研磨仪中在70Hz破碎1min；冰上放置30min；在14000rpm 4℃离心10min，取上清液转移到一个新的离心管中，用氮吹仪吹干，加入200μL甲醇水溶液(1:1，4℃)复溶样品，即得。

采用超高效液相色谱系统进行检测，色谱柱为(BEH)C18柱，进样量2～8μL，柱温40℃，流动相为0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)。梯度洗脱程序为0～1min，2％B；1～11min，2％～50％B；11～17min，50％～98％B；17～18min，98％B；18～18.5min，98％～2％B；18.5～21min，2％B。

质谱检测条件：Thermo LTQ Orbitrap XL，ESI电喷雾离子源，正负离子模式，正离子喷雾电压4.80kV，负离子喷雾电压4.50kV；鞘气及辅助气为氮气，鞘气流速40arb，辅助气流速15arb。毛细管温度325℃，电压35V/－15V，管透镜电压50V/－50V，分辨率60000进行全扫描，扫描范围50～1000m/z。二级质谱碰撞能量ESI⁺45eV/ESI^－35eV。检测5种诊断标志物的丰度，并计算变化倍数。

在实验剂量范围内，发现在0.01μM以上剂量时，斑马鱼体内代谢网络与正常组明显偏离。进一步分析5种生物标志物，结果如表6所示。

表6 0.03μM西玛津暴露组的斑马鱼与正常组斑马鱼的差异代谢物

NO.	m/z	离子	代谢物	DM值	界值
						1	118	[M+H]+	L-缬氨酸	0.736	0.9
2	186	[M+H]+	2-磷酸甘油酸	2.152	2.0
						3	570	[M+H]+	溶血卵磷脂	0.462	0.6
4	112	[M-H]-	肌酐	1.854	1.5
						5	174	[M-H]-	N-乙酰-L-天门冬氨酸	0.621	0.9

实施例7

一种利用斑马鱼模型预测外源化学物早期毒性的方法，评价乐果的毒性。

待测的乐果溶液，设置0.01、0.05、1.0μM乐果剂量组，加入到培养皿中，放入受精后8h(hpf)的斑马鱼胚胎，平行设置空白组(正常样品)和样品暴露组，每组50个胚胎，给药后放入28.5℃培养箱中，到120hpf时，收集各组仔鱼，置带盖EP管中，纯水清洗三次，吸干水分，加入800μL甲醇水混合溶液(4:1，-20℃)，加入钢珠，放置组织研磨仪中在70Hz破碎1min；冰上放置30min；在14000rpm 4℃离心10min，取上清液转移到一个新的离心管中，用氮吹仪吹干，加入200μL甲醇水溶液(1:1，4℃)复溶样品，即得。

采用超高效液相色谱系统进行检测，色谱柱为(BEH)C18柱，进样量2～8μL，柱温40℃，流动相为0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)。梯度洗脱程序为0～1min，2％B；1～11min，2％～50％B；11～17min，50％～98％B；17～18min，98％B；18～18.5min，98％～2％B；18.5～21min，2％B。

质谱检测条件：Thermo LTQ Orbitrap XL，ESI电喷雾离子源，正负离子模式，正离子喷雾电压4.80kV，负离子喷雾电压4.50kV；鞘气及辅助气为氮气，鞘气流速40arb，辅助气流速15arb。毛细管温度325℃，电压35V/－15V，管透镜电压50V/－50V，分辨率60000进行全扫描，扫描范围50～1000m/z。二级质谱碰撞能量ESI⁺45eV/ESI^－35eV。检测5种诊断标志物的丰度，并计算变化倍数。

在实验剂量范围内，发现在0.01μM以上剂量时，斑马鱼体内代谢网络与正常组明显偏离。进一步分析5种生物标志物，结果如表7所示。

表7 0.01μM乐果暴露组的斑马鱼与正常组斑马鱼的差异代谢物

NO.	m/z	离子	代谢物	DM值	界值
						1	118	[M+H]+	L-缬氨酸	0.812	0.9
2	186	[M+H]+	2-磷酸甘油酸	2.116	2.0
						3	570	[M+H]+	溶血卵磷脂	0.561	0.6
4	112	[M-H]-	肌酐	1.755	1.5
						5	174	[M-H]-	N-乙酰-L-天门冬氨酸	0.434	0.9

环境污染物对机体的作用一般具有接触剂量较小、长时间内反复接触甚至终生接触、多种环境污染物同时作用于机体、接触的人群易感性差异大等特点；因此，外源化学物的低水平长期慢性接触，将是未来各种环境污染物对人体影响的基本方式。传统的毒性测试具有通量低﹑周期长、敏感度低和资源耗费等特点，显然不能满足对这些环境污染物进行毒性测试的需求。近年来，随着毒理学新技术的发展，在毒物的安全性评价方法上，国外发达国家已经逐步实现了从传统的整体动物试验到快速、灵敏、高效的替代试验的转变。

代谢组学作为系统生物学的一部分，通过考察机体受刺激后体液或组织中内源性代谢物的动态变化规律，并结合生物信息统计方法，可系统全面地揭示内因和外因作用于机体的毒性效应和机制。代谢组学技术具有快速、灵敏度高、选择性强的特点，逐渐在低剂量环境污染物长期暴露的毒性效应评估方面发挥出优势。

本发明进一步发展了基于斑马鱼模型的代谢组学技术，通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱检测、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析的方法，确立微量重金属元素毒性试验中共有的差异代谢物变化，比行为学试验和病理机制试验具有更灵敏的检测范围，可为中毒的早期诊断，监测健康损害的发生、发展及预防和治疗提供依据；该检测方法不但更加快速、便捷和准确，而且具有重要的经济和社会效益。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.一种利用诊断标志物评价微量外源化学物早期毒性的方法，其特征在于，检测诊断标志物包括：L-缬氨酸、N-乙酰-L-天门冬氨酸、溶血卵磷脂、肌酐和2-磷酸甘油酸；

相对于正常样品，所述诊断标志物出现以下变化：DM(L-缬氨酸)≤0.9、DM(N-乙酰-L-天门冬氨酸)≤0.9、DM(溶血卵磷脂)≤0.6；DM(肌酐)≥1.5、DM(2-磷酸甘油酸)≥2，则判定为外源化学物引起发育毒性，其中，DM值为某一诊断标志物在待测样品中含量与正常样品中含量的比值；

其中所述溶血卵磷脂为[M+H]⁺m/z为570的溶血卵磷脂；

所述外源化合物为重金属、农药。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重金属包括镉、铅、铜、汞、锡。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农药包括阿特拉津、西玛津、乐果。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，斑马鱼受精后2-8h的胚胎作为处理对象，处理90-120h后，提取仔鱼的代谢物即为检测所述标志物的对象。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述处理为将所述胚胎暴露在含有低浓度的外源化学物的溶液中。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述处理的过程中，温度保持在28-29℃。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，提取仔鱼的代谢物的步骤具体为：收集仔鱼，纯水清洗，吸干水分；

加入低温的体积百分数为80％±2％的甲醇水溶液，低温破碎；

低温放置30±5min，低温离心，取上清液，吹干，加体积百分数为50％±1％的甲醇水溶液复溶样品，即得。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标志物检测采用超高效液相色谱仪-四级杆飞行时间串联质谱仪进行；

色谱检测条件：超高效液相色谱系统，色谱柱为C18柱，进样量2～8μL，柱温30～50℃，流动相为溶液A-溶液B，梯度洗脱程序为0～1min，2％溶液B；1～11min，2％～50％溶液B；11～17min，50％～98％溶液B；17～18min，98％溶液B；18～18.5min，98％～2％溶液B；18.5～21min，2％溶液B；

溶液A为体积浓度0.1％±0.02％的甲酸水溶液，溶液B为体积浓度0.1％±0.02％的甲酸乙腈；

质谱检测条件：Thermo LTQ Orbitrap XL，ESI电喷雾离子源，正负离子模式，正离子喷雾电压4.80kV，负离子喷雾电压4.50kV；鞘气及辅助气为氮气，鞘气流速40±2arb，辅助气流速15±1arb，毛细管温度325±5℃，电压35V/－15V，管透镜电压50V/-50V，分辨率60000进行全扫描，扫描范围50～1000m/z，二级质谱碰撞能量ESI⁺45eV/ESI^－35eV。

9.权利要求1-8任一项所述的方法在环境或临床医学标准化检测中的应用。

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