CN115618637B - 一种内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法，涉及联合毒性研究领域。本发明通过分析内分泌干扰物单独暴露的细胞毒性效应和二元混合物暴露的细胞毒性效应，基于浓度加和模型，结合置信区间建立了一种联合效应评价方法，通过“浓度‑效应”曲线和预测曲线的位置关系，有效地判断二元混合物的联合效应类型，为联合毒性效应的评价提供了新途径。
Description
技术领域
本发明涉及联合毒性研究领域，具体而言，涉及一种内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法。
背景技术
食品中多种污染物同时暴露造成的风险问题已在全球范围内受到广泛关注，并被确认为影响食品安全和人体健康的重要风险来源。其中，部分污染物进入人体后，会对人体内分泌系统的正常功能造成干扰，如雌激素的产生、运输或代谢，表现出内分泌干扰毒性。人群样本生物学监测结果显示，人体内可检出多种不同的内分泌干扰物(EndocrineDisrupting Chemicals,EDCs)，低浓度水平EDCs同时存在的现象较为普遍。有证据表明，低浓度水平的EDCs同时暴露，可引起相加或协同作用，产生可观测到的毒性效应。因此，明确EDCs的联合毒性效应，对于制定EDCs的最大残留限量，保护食品安全和人民身体健康具有重要意义。
近年来，国际上已经开始重视多种污染物的联合毒性风险，欧盟食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)和美国环境保护署(EnvironmentalProtection Agency,EPA)评价了有机磷类、氨基甲酸酯类等农药对神经系统的联合毒性。传统的联合效应评价方法主要包括浓度加和(Concentration Addition，CA)、独立作用(Independent Action，IA)和联合指数(Combined Index，CI)三个模型。然而，不同于有机磷类、氨基甲酸酯类等单一剂量效应的污染物，EDCs具有双剂量效应，无法采用已有的联合效应评价方法进行联合毒性评价。因此，低剂量下EDCs的联合毒性效应评价仍缺乏有效方法。
基于模式生物的毒性评价存在代谢和遗传差异、动物实验争议、耗时长、成本高等不足。体外细胞测试技术因便于控制环境干扰因素、避免复杂机体影响、易于开展分子机制解析、利于揭示毒性作用机制等优势，已成为联合效应评价的主要手段。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法，其包括以下步骤：获取所述二元混合物中的每种内分泌干扰物单独暴露的细胞毒性实验结果，计算不同暴露条件下的细胞活性，绘制浓度效应曲线；其中，所述二元混合物由待评价的两种内分泌干扰物混合而成；获取所述二元混合物共暴露的细胞毒性实验结果，计算其M％置信区间，绘制实际浓度效应曲线和M％置信曲线；其中，二元混合物共暴露的细胞毒性实验的细胞染毒浓度梯度通过每种内分泌干扰物的浓度效应曲线选择设置；采用浓度加和模型对二元混合物的毒性效应进行预测，绘制预测浓度效应曲线，根据所述预测浓度效应曲线分别与实际浓度效应曲线和置信曲线的位置关系，判断染毒浓度范围内的联合效应类型。
第二方面，本发明实施例提供了一种电子设备，所述电子设备包括：处理器和存储器；所述存储器用于存储程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现如前述实施例项所述的内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法。
第三方面，本发明实施例提供了一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如前述实施例所述的内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过分析内分泌干扰物单独暴露的细胞毒性效应和二元混合物暴露的细胞毒性效应，基于CA模型，结合M％置信区间建立了一种联合作用评价方法，通过“浓度-效应”实际和预测曲线的位置关系，有效地判断二元混合物的联合效应类型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的判断联合效应类型的示意图；
图2为BaP(a)、PFOA(b)、4-HBP(c)单独暴露MCF-7细胞72h的浓度-效应曲线(R2均≥0.99)；
图3为BaP-PFOA(a)、BaP-4HBP(b)、PFOA-4HBP(c)二元联合暴露MCF-7细胞72h后实际浓度-效应曲线(实线)、95％置信曲线(点划线)及CA模型预测浓度-效应曲线(虚线)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法，其包括以下步骤：
获取所述二元混合物中的每种内分泌干扰物单独暴露的细胞毒性实验结果，计算不同暴露条件下的细胞活性，绘制浓度效应曲线；其中，所述二元混合物由待评价的两种内分泌干扰物混合而成；
获取所述二元混合物共暴露的细胞毒性实验结果，计算其M％置信区间，绘制实际浓度效应曲线和M％置信曲线；其中，M选自95～90中的任意数值，二元混合物共暴露的细胞毒性实验的细胞染毒浓度梯度通过每种内分泌干扰物的浓度效应曲线选择设置；
采用浓度加和模型对二元混合物的毒性效应进行预测，绘制预测浓度效应曲线，根据所述预测浓度效应曲线分别与实际浓度效应曲线和置信曲线的位置关系，判断染毒浓度范围内的联合效应类型。
本申请的发明人经一系列创造性劳动提出以上评价方法，该评价方法能够对低剂量的内分泌干扰物尤其是类雌激素干扰物进行联合效应类型评价，为低剂量的内分泌干扰物联合暴露毒性评估提供了新的途径。
在一些实施例中，所述判断染毒浓度范围内的联合效应类型的标准包括：若预测浓度效应曲线位于M％置信区间左侧时，在M％置信水平下的联合效应为拮抗作用；若预测浓度效应曲线位于M％置信区间内时，在M％置信水平下的联合效应为加和作用；若预测浓度效应曲线位于M％置信区间右侧时，在M％置信水平下的联合效应为协同作用，可参照图1。
在一些实施例中，M可以为90、91、92、93、94和95中的任意一种。
在一些实施例中，二元混合物共暴露的细胞毒性实验的细胞染毒浓度梯度的选择标准可以包括：选择每种内分泌干扰物的毒性效应均随染毒浓度变化的浓度范围。
在一些实施例中，所述判断染毒浓度范围内的联合效应类型时，不同的染毒浓度下的联合效应类型可能是不同的，需要根据不同染毒浓度条件、所述预测浓度效应曲线与实际浓度效应曲线和置信曲线的位置关系，结合上述判断标准进行判断。
在一些实施例中，所述内分泌干扰物包括类雌激素干扰物。
在一些实施例中，所述类雌激素干扰物包括：苯并a芘(BaP)、全氟辛酸(PFOA)、4-羟基二苯甲酮(4-HBP)中的任意一种。
在一些实施例中，所述置信区间的计算公式如下：
其中，μ为均值，σ为标准差，n为实验样本数量。
在一些实施例中，当M为95时，z为1.96。M为90时，z为1.64。置信水平对应的置信度可基于公知常识查询获得，不再赘述。
在一些实施例中，所述浓度加和模型的公式如下：其中，ECx，mix为诱导x％效应所需的混合物浓度；ECx，i为单一组分i达到x％效应时的浓度，pi为组分i在混合体系中所占质量比例。
在一些实施例中，所述二元混合物中，两种内分泌干扰物的效应浓度比为(1～9)：(1～9)。该效应浓度比可以为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、2∶1、2∶3、2∶5、2∶7、2∶9、3∶1、3∶2、3∶4、3∶5、3∶7、4∶1、4∶3、4：5、4∶7、4∶9、5∶1、5∶2、5∶3、5∶4、5∶6、5∶7、5∶8、5∶9、6∶1、6∶5、6∶7、7∶1、7∶2、7∶3、7∶4、7∶5、7∶6、7∶8、7∶9、8∶1、8∶3、8∶5、8∶7、8∶9、9∶1、9∶2、9∶4、9∶5、9∶7、9∶8中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述细胞包括MCF-7细胞。MCF-7是一种内分泌干扰敏感细胞系人乳腺癌细胞，由于具有雌激素作用靶点，适用于开展类雌激素内分泌干扰物的毒性效应研究。
在一些实施例中，在获取细胞毒性实验结果前，所述评价方法还包括：进行每种内分泌干扰物单独暴露的细胞毒性实验，和/或，进行二元混合物共暴露的细胞毒性实验。每种内分泌干扰物或二元混合物的细胞毒性实验是本领域技术人员可以基于常规技术领域知识进行实施的。
在一些实施例中，每种内分泌干扰物单独暴露的细胞毒性实验或二元混合物共暴露的细胞毒性实验的步骤包括：细胞饥饿处理22～26h后，将所述内分泌干扰物或所述二元混合物与细胞混合，培养70～74h后，测定细胞活性。
在一些实施例中，培养时间可以为70h、71h、72h、73h、74h中的任意一种或任意两种之间的范围。优选地，所述培养时间为72h。
可选地，细胞饥饿处理时间为22h、23h、24h、25h和26h中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，培养温度可以为27～37摄氏度，具体可以为27℃、29℃、31℃、33℃、35℃和37℃中的任意一种或任意两种之间的范围。
本发明实施例还提供了一种电子设备，所述电子设备包括：处理器和存储器；所述存储器用于存储程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现如前述任意实施例所述的内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法。
存储器可以是但不限于，随机存取存储器(Random Access Memory，RAM)，只读存储器(Read Only Memory，ROM)，可编程只读存储器(Programmable Read-Only Memory，PROM)，可擦除只读存储器(Erasable Programmable Read-Only Memory，EPROM)，电可擦除只读存储器(Electric Erasable Programmable Read-Only Memory，EEPROM)等。
处理器可以是一种集成电路芯片，具有信号处理能力。该处理器可以是通用处理器，包括中央处理器(Central Processing Unit，CPU)、网络处理器(Network Processor，NP)等；还可以是数字信号处理器(Digital Signal Processing，DSP)、专用集成电路(Application Specific Integrated Circuit，ASIC)、现场可编程门阵列(Field－Programmable Gate Array，FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件。
在实际应用中，该电子设备可以是服务器、云平台、手机、平板电脑、笔记本电脑、超级移动个人计算机(ultra-mobile personal computer，UMPC)、手持计算机、上网本、个人数字助理(personal digital assistant，PDA)、可穿戴电子设备、虚拟现实设备等设备，因此本申请实施例对电子设备的种类不做限制。
此外，本发明实施例还提供了一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如前述任意实施例所述的内分泌干扰物的二元联合毒性效应的评价方法。
计算机可读介质包括：U盘、移动硬盘、只读存储器、随机存取存储器、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1.1细胞培养与单独暴露实验
将45mL DMEM培养基、5mL胎牛血清、500μL 100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素双抗混匀配置成完全培养基待用。将MCF-7细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速转移至37℃水浴锅中快速晃动以使细胞冻存液融化。之后将细胞全部转移至已有2mL完全培养基的15mL离心管，1000r离心3min，弃上清。加入培养基吹打均匀后，将细胞悬液转移至已有25cm2培养瓶中，吹匀。置于饱和湿度、37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，每2～3天传代一次。细胞传代时，吸净培养瓶中完全培养基，加入2mL PBS(反面)清洗细胞，吸净；用胰酶消化后置于离心管，1000r离心3min，除去上清液。以1：2进行细胞传代。
选择处于对数生长期的MCF-7细胞开展实验。将细胞悬液稀释至3.0×104cells/mL，200μL/孔接种于96孔板中，于37℃、5％CO2环境贴壁孵育24h，吸去培养基。吸净96孔板中培养基，每孔加入100μL无酚红培养基，继续置于恒温培养箱中饥饿处理24h后进行染毒实验。
单独暴露：取苯并a芘(BaP)、全氟辛酸(PFOA)和4-羟基二苯甲酮(4-HBP)标准品分别配置10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11M的染毒液，在孔板染毒组中每孔加入100μL；空白、Control(对照)组每孔加含0.1％DMSO的无酚红培养基100μL。实验组与对照组均设6个平行，置于恒温培养箱中培养72h后基于CCK-8法测定细胞活性。
1.2单独暴露毒性效应分析
暴露后取出96孔板，使用CCK-8试剂盒进行细胞活性检测。每孔加入10μL CCK-8试剂，锡纸遮光后摇床摇匀2min。放入恒温培养箱中孵育2h后，采用酶标仪于450nm波长处测定光密度值(OD)值，并计算细胞存活率＝(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100％。获得细胞活性结果后，基于Origin 2019b软件绘制浓度-效应的散点图，并进行曲线拟合，获得“浓度-效应”曲线(图2)。实验结果显示三种污染物单独暴露下，在10-9～10-6M浓度范围内，均表现出浓度依赖性，随浓度增加，增殖毒性效应逐渐增强。在10-6M浓度时三种EDCs的增殖毒性均达到最强，BaP、PFOA和4-HBP的细胞增殖效应分别为204％、151％和183％。
2.二元暴露联合毒性效应类型评价
单独暴露下的毒性效应结果显示，BaP、PFOA和4-HBP在10-9～10-6M浓度范围内的毒性效应变化最为明显。因此，在10-9-10-6M浓度范围内，选取6.25×10-9、1.25×10-8、2.5×10-8、5×10-8、1×10-7、2×10-7M六个浓度梯度，采用等浓度混合的方式开展二元暴露毒性实验。即分别配置1.25×10-8、2.5×10-8、5×10-8、1×10-7、2×10-7、4×10-7M的BaP-PFOA、BaP-4HBP、PFOA-4HBP二元混合染毒液备用。细胞培养及96孔板铺板过程同步骤1.1，饥饿处理24h后，向孔板染毒组中每孔加入100μL染毒液；空白、Control组每孔加含0.1％DMSO的无酚红培养基100μL。实验组与对照组均设6个平行，置于恒温培养箱中培养72h后基于CCK-8法测定细胞活性。
获得细胞活性数据后，计算各实验组细胞活性的95％置信区间(公式如下)，并绘制实际测得的二元暴露下浓度-效应曲线与95％置信曲线。同时，基于浓度加和模型对各二元暴露组的联合毒性效应进行预测，并绘制预测的浓度-效应曲线。
其中，μ为均值，σ为标准差，n为实验样本数量。
以上曲线置于同一坐标系中，如图3所示。
3.判断联合毒性类型
结果显示，BaP-PFOA、BaP-4HBP、PFOA-4HBP的二元混合暴露毒性效应均表现出浓度依赖性，其毒性效应随混合浓度增大而增大。在实验所选最高浓度4×10-7M下，三种污染物两两混合暴露的毒性效应均达到最大值，BaP-PFOA、BaP-4HBP、PFOA-4HBP组合的细胞增殖效应分别为190％、176％、184％。
通过图中“浓度-效应”预测曲线和95％置信区间的位置关系发现，BaP-PFOA暴露组的CA预测曲线横穿了95％置信区间，表明随浓度升高，其联合作用从拮抗作用快速过渡到加和作用，再向协同作用转变。而在实验所选的大部分浓度范围内，BaP-4HBP组的预测曲线处于95％置信区间左侧，显示出拮抗作用，仅在较高浓度范围内转变为加和作用。PFOA-4HBP组的CA预测曲线从95％置信区间内向区间外转变，表明联合作用类型从加和作用转变为协同作用。特别的，预测曲线整体位于实际浓度效应曲线的右侧，这表明联合暴露可能产生更强的毒性效应。
进一步采用相加指数法对单点联合效应进行验证，S＝Am/Ai+Bm/Bi，其中，Am、Bm为混合暴露下对应组分的EC50；Ai、Bi为单独暴露下的EC50。将S转换为相加指数AI(Additive Index)，即当S≤1时，AI＝(1/S)-1.0；当S＞1时，AI＝1.0-S；根据AI值判断联合作用类型，当AI＜0时为拮抗作用；AI＞0时为协同作用。
实验结果显示，BaP、PFOA、4-HBP三种污染物单独暴露的EC50值分别为4.24×10-8、1.03×10-6、8.62×10-8mol/L；BaP-PFOA、BaP-4HBP、PFOA-4HBP二元混合暴露的EC50值分别为7.01×10-8、1.26×10-7、1.03×10-7mol/L。
计算可得，BaP-PFOA、BaP-4HBP、PFOA-4HBP三种联合暴露情形下效应为EC50时对应的AI值分别为：0.16、-1.21、0.54；结果表明，BaP-PFOA、BaP-4HBP、PFOA-4HBP二元联合暴露下达到EC50值时，其联合暴露类型分别为协同作用、拮抗作用、协同作用，这一结果与本发明建立的联合作用类型判断方法结果一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种内分泌干扰物二元联合毒性效应的评价方法，其特征在于，其包括以下步骤：
获取二元混合物中的每种内分泌干扰物单独暴露的细胞毒性实验结果，计算不同暴露条件下的细胞活性，绘制浓度效应曲线；其中，所述二元混合物由待评价的两种内分泌干扰物混合而成；
获取所述二元混合物共暴露的细胞毒性实验结果，计算其M％置信区间，绘制实际浓度效应曲线和M％置信曲线；其中，M选自90～95，二元混合物共暴露的细胞毒性实验的细胞染毒浓度梯度通过每种内分泌干扰物的浓度效应曲线选择设置；
采用浓度加和模型对二元混合物的毒性效应进行预测，绘制预测浓度效应曲线，根据所述预测浓度效应曲线分别与实际浓度效应曲线和置信区间的位置关系，判断染毒浓度范围内的联合效应类型；
所述判断染毒浓度范围内的联合效应类型的标准包括：若预测浓度效应曲线位于M％置信区间左侧时，在M％置信水平下的联合效应为拮抗作用；若预测浓度效应曲线位于M％置信区间内时，在M％置信水平下的联合效应为加和作用；若预测浓度效应曲线位于M％置信区间右侧时，在M％置信水平下的联合效应为协同作用；
所述浓度加和模型的公式如下：其中，ECx，mix为诱导x％效应所需的混合物浓度；ECxi为单一组分i达到x％效应时的浓度，pi为单一组分i在混合体系中所占质量比例。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述二元混合物中，两种内分泌干扰物的浓度比为(1～9)：(1～9)。
3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，所述内分泌干扰物包括类雌激素干扰物。
4.根据权利要求3所述的评价方法，其特征在于，所述内分泌干扰物包括：苯并a芘(BaP)、全氟辛酸(PFOA)、4-羟基二苯甲酮(4-HBP)中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述置信区间的计算公式如下：
其中，μ为均值，σ为标准差，n为实验样本数量，z为M％置信水平对应的置信度。
6.根据权利要求5所述的评价方法，其特征在于，当M为95时，z为1.96。
7.根据权利要求5所述的评价方法，其特征在于，当M为90时，z为1.64。
8.根据权利要求1～7任一项所述的评价方法，其特征在于，每种内分泌干扰物单独暴露的细胞毒性实验或二元混合物共暴露的细胞毒性实验步骤包括：将所述内分泌干扰物或所述二元混合物与细胞混合，培养70～74h后，测定细胞活性。
9.根据权利要求8所述的评价方法，其特征在于，所述细胞毒性实验的步骤还包括：将细胞饥饿处理22～26h后，再与所述内分泌干扰物或所述二元混合物混合。
10.根据权利要求1～7任一项所述的评价方法，其特征在于，所述细胞包括MCF-7细胞。
11.一种电子设备，其特征在于，所述电子设备包括：处理器和存储器；所述存储器用于存储程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现如权利要求1～10任一项所述的内分泌干扰物二元联合毒性效应的评价方法。
12.一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时实现如权利要求1～10任一项所述的内分泌干扰物二元联合毒性效应的评价方法。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103266172A (zh) * | 2013-05-15 | 2013-08-28 | 上海交通大学 | 快速评价内分泌干扰物作用机制及其复合效应的方法 |
| CN107796934A (zh) * | 2016-09-06 | 2018-03-13 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法 |
| CN112395747A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-02-23 | 南京信息工程大学 | 一种预测复杂联合作用方式的混合污染物毒性的方法 |
| CN112980915A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-18 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种评价毒性效应机制的方法 |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103266172A (zh) * | 2013-05-15 | 2013-08-28 | 上海交通大学 | 快速评价内分泌干扰物作用机制及其复合效应的方法 |
| CN107796934A (zh) * | 2016-09-06 | 2018-03-13 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种评价溴代阻燃剂生物毒性及其遗传效应的方法 |
| CN112395747A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-02-23 | 南京信息工程大学 | 一种预测复杂联合作用方式的混合污染物毒性的方法 |
| CN112980915A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-18 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种评价毒性效应机制的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 环境内分泌干扰物复合效应研究进展;王春花;蒋萍;胡伟;王玉秋;;环境与健康杂志(01);全文 * |
| 食源性内分泌干扰物联合效应研究进展;许彦阳;陆雨顺;王昕璐;钱永忠;;食品安全质量检测学报(02);全文 * |
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