CN109952980A - 毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法 - Google Patents

毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，包括以下步骤：A、实验生物：实验采用斑马鱼野生型AB品系，购买完成后在实验室内驯养，实验鱼卵采集用成鱼已在本实验室饲养1个月以上，通过联合联合毒性试验和单一农药试验，便于根据不同环境和不同药剂对动物的影响，增加了参考数据，提高数据的相互对照，较好的平衡和抵消了无关变量的影响，使实验结果更具有说服力，根据鱼类仔鱼的死亡数和死亡时间利用机率值分析法计算农药对仔鱼，对数据进行合理的分析和处理，避免依赖单一效应制定的有关评价标准污染，便于真实反映现实环境质量的客观要求，提高了有效的评价环境水体中污染物的环境风险，便于制定对水生生物更加“安全”的环境阈值。

Description

毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法
技术领域：
本发明属于毒性试验技术领域，特别涉及毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法。
背景技术：
随着现代工农业的迅速发展，越来越多的有机污染物通过各种途径进入到环境中，并在环境中共存，长期以来，毒理学的研究多集中于单一化学物质的毒性效应研究，许多标准，如废水允许排放标准、安全浓度标准也都是依据单个化学物质的毒性效应建立起来的，目前，很多环境毒理效应无法用单一污染物的作用机理来解释，已有多项研究表明即使多种污染物都处于相关水质基准的“安全”水平，也可能对水生生物产生显著的联合毒性效应，依赖单一效应制定的有关评价标准污染真实反映现实环境质量的客观要求，因此，为了准确有效的评价环境水体中污染物的环境风险，制定对水生生物更加“安全”的环境阈值，需要考虑污染物的联合毒性作用。
有关毒死蜱和丁草胺对水生生物的单一毒性效应研究已有较多报道，但对二者对水生生物的联合毒性尚未见报道。斑马鱼作为一种新型模式生物，因其与人类基因组的高度同源性而经常被用于毒理学试验。斑马鱼胚胎具有光学透明性，可清楚地观察到各个发育阶段，有助于实现观察体内病变过程和体节发育中的毒性影响。另外，斑马鱼还具有饲养成本低、繁殖率高等优点。日本青鳉作为模式实验动物已被多数世界组织认可，并于20世纪80年代被国际标准化组织列为毒性实验受试种之一，因此，毒死蜱和丁草胺对斑马鱼与日本青鳉仔鱼的单一及联合毒性效应研究，也为农田环境的污染监测提供了科学依据，现有的实验方式步骤繁琐，实验结果不明确，无法为复合污染的研究提供基础资料。
发明内容：
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，解决了现有的设备存在的缺点。
为了解决上述问题，本发明提供了一种技术方案：
毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，包括以下步骤：
A、实验生物：实验采用斑马鱼野生型AB品系，购买完成后在实验室内驯养，实验鱼卵采集用成鱼已在本实验室饲养1个月以上，用丰年虫喂食2次/d，投食30min后将残饵和粪便捞出，光照时间与黑暗时间比为14h:10h，繁殖前夜，把健康、性成熟的亲鱼按雌雄1:2的比例放入交配产卵缸内，次日早8h给光让其产卵受精，将清洗和消毒过的正常受精卵分为两部分：一部分用作胚胎实验；另一部分放在26±1℃光照培养箱中孵化，待仔鱼游泳平衡后用于暴露实验；日本青鳉每50尾种鱼按3:2的雌雄比例养殖在10L的圆玻璃缸中，养殖水量为8L，每天早、晚2次投喂新鲜孵化的丰年虫幼虫；每天早晨收取雌鱼所产受精卵，用滴管将卵分开后，挑选受精的健康受精卵用于孵化仔鱼；
B、实验用水及实验设备：试验用水的制备方法参照OECD导则，充分曝氧后待用，其各项主要指标为：水温度斑马鱼为26±1℃，日本青鳉为25±1℃，pH值为7.8±0.2，溶解氧≥7.8mg·L-1，硬度为230±20mg·L-1计，分别作为胚胎和仔鱼染毒器具；
C、实验药剂：96％毒死蜱原药，95％丁草胺原药，采用分析纯N，N-二甲基甲酰胺、吐温-80溶解农药原药并定容配制成一定浓度的母液，其助剂用量体积比不超过0.1％，供测定用；
D、农药对斑马鱼胚胎的毒性：在预试明确农药有效浓度范围的基础上，将农药母液用标准稀释水以等比级差稀释成5-7个浓度，用24孔细胞培养皿作染毒器具，其每孔容积为3mL，20孔为同一实验浓度，其余4孔为空白对照，实验时每孔加入2mL测试药液和1枚随机选取的3hpf胚盾期正常受精发育的胚胎，每个浓度设3个重复，在26±1℃的多功能培养箱中孵化，光周期为14h(光照):10h(黑暗)；
E、农药对斑马鱼仔鱼和日本青鳉的单一毒性：根据OECD导则的方法设计农药对斑马鱼和日本青鳉仔鱼的毒性试验，在预试明确农药有效浓度范围的基础上，将农药母液用标准稀释水以等比级差稀释成5-7个浓度，用24孔细胞培养皿作染毒器具，其每孔容积为3mL，20孔为同一实验浓度，其余4孔为空白对照，实验时每孔加入2mL测试药液和一条经镜检发育正常、刚进入平游期的仔鱼，试验期间不喂食，每个浓度设3个重复，斑马鱼试验温度为26±1℃，日本青鳉试验温度为25±1℃，光周期为14h(光照):10h(黑暗)，每隔24h更换1次实验液，每隔24h观察、统计仔鱼死亡数，利用机率值分析法计算得到暴露24h、48h、72h和96h的LC50值及其95％置信限；
F、联合毒性试验：其对包括斑马鱼仔鱼和日本青鳉仔鱼进行毒性试验，其试验步骤如下：
a、斑马鱼仔鱼：以单一农药对斑马鱼仔鱼96h的LC50值为一个毒性单位，分别按照毒性比1:1和浓度比1:1的混合比例以等对数间距设置5-7个不同的浓度，试验方法及各暴露时间的LC50值的计算同1.4.2；
b、日本青鳉仔鱼：以单一农药对日本青鳉仔鱼96h的LC50值为一个毒性单位，以浓度比为1:4、2:3、1:1、3:2和4:1的比例将毒死蜱和丁草胺混合、组成不同配比的二元混合体系，根据预实验结果，按等对数间距设置5-7个不同的浓度，测定个混合体系对日本青鳉的联合毒性，实验步骤及方法与单一毒性的测定相同，二元混合物的总浓度为2个组分浓度之和；
G、联合毒性评价方法：用下面的公式求出生物毒性作用之和S：S＝Am/Ai+Bm/Bi，式中Am和Bm分别是混合物中各毒物的毒性，Ai和Bi分别是A和B毒物单独作用时的毒性；将S转换成相加指数AI，当S≤1时，AI＝(1/S)-1.0；当S>1时，AI＝1.0-S，最后用AI评价化学品的复合效应，当-0.2<AI<0.25时为相加作用(Addition)；当AI≥0.25时为大于相加作用，即协同作用；当AI≤-0.2时为小于相加作用，即拮抗作用；
H、数据处理：根据鱼类仔鱼的死亡数和死亡时间利用机率值分析法计算农药对仔鱼的LC50值及其95％置信限，以LC50值95％置信限是否有重叠作为判断不同种药剂毒性差异是否显著的标准，LC50≤0.1mg a.i.L-1，为剧毒；0.1<LC50≤1.0mg a.i.L-1，为高毒；1.0<LC50≤10.0mg a.i.L-1，为中毒；LC50>10.0mg a.i.L-1，为低毒，最大容许浓度MPC以100作为防护系数，其公式为：MPC＝96h-LC50/100，得到某毒物的最大容许浓度。
作为优选，所述步骤A中试验水温控制在25±1℃，光照周期为光照14h:黑暗10h。
作为优选，所述步骤B中采用莱卡S8APO型复消色差立体显微镜进行观察和拍照。
作为优选，所述步骤E中平游期的仔鱼指受精卵产出后120h的鱼。
作为优选，所述步骤F中的混合比例参照毒性较大的药剂设计。
作为优选，所述步骤I中MPC即最大容许浓度。
作为优选，所述步骤I中农药对仔鱼的毒性分级标准根据国家环保总局1989年制定的《化学农药环境安全评价试验准则》。
作为优选，所述步骤D中需每隔24h更换1次实验液，每隔24h观察、显微镜观察CK组和暴露组胚胎，记录正常发育和畸形的胚胎数，计算胚胎孵化数和仔鱼畸形数等，试验持续96h。
本发明的有益效果：本方法高效且精确，通过联合联合毒性试验和单一农药试验，便于根据不同环境和不同药剂对动物的影响，增加了参考数据，提高数据的相互对照，较好的平衡和抵消了无关变量的影响，使实验结果更具有说服力，根据鱼类仔鱼的死亡数和死亡时间利用机率值分析法计算农药对仔鱼，对数据进行合理的分析和处理，避免依赖单一效应制定的有关评价标准污染，便于真实反映现实环境质量的客观要求，提高了有效的评价环境水体中污染物的环境风险，便于制定对水生生物更加“安全”的环境阈值。
具体实施方式：
本具体实施方式采用以下技术方案：毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，包括以下步骤：
A、实验生物：实验采用斑马鱼野生型AB品系，购买完成后在实验室内驯养，实验鱼卵采集用成鱼已在本实验室饲养1个月以上，用丰年虫喂食2次/d，投食30min后将残饵和粪便捞出，光照时间与黑暗时间比为14h:10h，繁殖前夜，把健康、性成熟的亲鱼按雌雄1:2的比例放入交配产卵缸内，次日早8h给光让其产卵受精，将清洗和消毒过的正常受精卵分为两部分：一部分用作胚胎实验；另一部分放在26±1℃光照培养箱中孵化，待仔鱼游泳平衡后用于暴露实验；日本青鳉每50尾种鱼按3:2的雌雄比例养殖在10L的圆玻璃缸中，养殖水量为8L，每天早、晚2次投喂新鲜孵化的丰年虫幼虫；每天早晨收取雌鱼所产受精卵，用滴管将卵分开后，挑选受精的健康受精卵用于孵化仔鱼；
B、实验用水及实验设备：试验用水的制备方法参照OECD导则，充分曝氧后待用，其各项主要指标为：水温度斑马鱼为26±1℃，日本青鳉为25±1℃，pH值为7.8±0.2，溶解氧≥7.8mg·L-1，硬度为230±20mg·L-1计，分别作为胚胎和仔鱼染毒器具；
C、实验药剂：96％毒死蜱原药，95％丁草胺原药，采用分析纯N，N-二甲基甲酰胺、吐温-80溶解农药原药并定容配制成一定浓度的母液，其助剂用量体积比不超过0.1％，供测定用；
D、农药对斑马鱼胚胎的毒性：在预试明确农药有效浓度范围的基础上，将农药母液用标准稀释水以等比级差稀释成5-7个浓度，用24孔细胞培养皿作染毒器具，其每孔容积为3mL，20孔为同一实验浓度，其余4孔为空白对照，实验时每孔加入2mL测试药液和1枚随机选取的3hpf胚盾期正常受精发育的胚胎，每个浓度设3个重复，在26±1℃的多功能培养箱中孵化，光周期为14h(光照):10h(黑暗)；
E、农药对斑马鱼仔鱼和日本青鳉的单一毒性：根据OECD导则的方法设计农药对斑马鱼和日本青鳉仔鱼的毒性试验，在预试明确农药有效浓度范围的基础上，将农药母液用标准稀释水以等比级差稀释成5-7个浓度，用24孔细胞培养皿作染毒器具，其每孔容积为3mL，20孔为同一实验浓度，其余4孔为空白对照，实验时每孔加入2mL测试药液和一条经镜检发育正常、刚进入平游期的仔鱼，试验期间不喂食，每个浓度设3个重复，斑马鱼试验温度为26±1℃，日本青鳉试验温度为25±1℃，光周期为14h(光照):10h(黑暗)，每隔24h更换1次实验液。每隔24h观察、统计仔鱼死亡数，利用机率值分析法计算得到暴露24h、48h、72h和96h的LC50值及其95％置信限；
F、联合毒性试验：其对包括斑马鱼仔鱼和日本青鳉仔鱼进行毒性试验，其试验步骤如下：
a、斑马鱼仔鱼：以单一农药对斑马鱼仔鱼96h的LC50值为一个毒性单位，分别按照毒性比1:1和浓度比1:1的混合比例以等对数间距设置5-7个不同的浓度，试验方法及各暴露时间的LC50值的计算同1.4.2；
b、日本青鳉仔鱼：以单一农药对日本青鳉仔鱼96h的LC50值为一个毒性单位，以浓度比为1:4、2:3、1:1、3:2和4:1的比例将毒死蜱和丁草胺混合、组成不同配比的二元混合体系，根据预实验结果，按等对数间距设置5-7个不同的浓度，测定个混合体系对日本青鳉的联合毒性，实验步骤及方法与单一毒性的测定相同，二元混合物的总浓度为2个组分浓度之和；
G、联合毒性评价方法：用下面的公式求出生物毒性作用之和S：S＝Am/Ai+Bm/Bi，式中Am和Bm分别是混合物中各毒物的毒性，Ai和Bi分别是A和B毒物单独作用时的毒性；将S转换成相加指数AI，当S≤1时，AI＝(1/S)-1.0；当S>1时，AI＝1.0-S，最后用AI评价化学品的复合效应，当-0.2<AI<0.25时为相加作用(Addition)；当AI≥0.25时为大于相加作用，即协同作用；当AI≤-0.2时为小于相加作用，即拮抗作用；
H、数据处理：根据鱼类仔鱼的死亡数和死亡时间利用机率值分析法计算农药对仔鱼的LC50值及其95％置信限，以LC50值95％置信限是否有重叠作为判断不同种药剂毒性差异是否显著的标准，LC50≤0.1mg a.i.L-1，为剧毒；0.1<LC50≤1.0mg a.i.L-1，为高毒；1.0<LC50≤10.0mg a.i.L-1，为中毒；LC50>10.0mg a.i.L-1，为低毒，最大容许浓度MPC以100作为防护系数，其公式为：MPC＝96h-LC50/100，得到某毒物的最大容许浓度。
其中，所述步骤A中试验水温控制在25±1℃，光照周期为光照14h:黑暗10h，便于试验生物生存。
其中，所述步骤B中采用莱卡S8APO型复消色差立体显微镜进行观察和拍照，便于观察试验生物的变化情况。
其中，所述步骤E中平游期的仔鱼指受精卵产出后120h的鱼，便于提高试验的准确性。
其中，所述步骤F中的混合比例参照毒性较大的药剂设计，节省试验时间。
其中，所述步骤I中MPC即最大容许浓度，便于数据分析。
其中，所述步骤I中农药对仔鱼的毒性分级标准根据国家环保总局1989年制定的《化学农药环境安全评价试验准则》，为数据分析提供有效的参考。
其中，所述步骤D中需每隔24h更换1次实验液，每隔24h观察、显微镜观察CK组和暴露组胚胎，记录正常发育和畸形的胚胎数，计算胚胎孵化数和仔鱼畸形数等，试验持续96h，便于结构分析。
实施例：
(1)毒死蜱和丁草胺对斑马鱼胚胎毒性：
在暴露96h后，空白对照组和助剂对照组中斑马鱼胚胎的死亡率均<10％，毒死蜱对斑马鱼胚胎的24h的LC50值为170.1(84.25-401.7)mg a.i.L-1，随着暴露时间的延长毒死蜱的毒性增加，暴露到96h时，毒性显著增加，其LC50值为13.03(7.54-19.71)mg a.i.L-1，丁草胺对斑马鱼胚胎的24h的LC50值为32.79(23.26-63.39)mg a.i.L-1，随着暴露时间的延长毒性显著增加，暴露到48h、72h和96h的LC50值分别为5.82(4.33-9.02)、4.42(3.04-6.42)和1.93(1.37-3.55)mg a.i.L-1，丁草胺对斑马鱼胚胎96h的毒性是毒死蜱毒性的6.75倍，
表1毒死蜱和丁草胺对斑马鱼胚胎的单一毒性
毒死蜱和丁草胺暴露对斑马鱼胚胎的多个系统发育产生影响，主要表现为卵凝结、心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲等，如表1；
(2)毒死蜱和丁草胺对斑马鱼仔鱼和日本青鳉仔鱼的单一毒性：
在暴露96h后，空白对照组和助剂对照组中斑马鱼仔鱼和日本青鳉仔鱼的死亡率均<10％。暴露24h时，毒死蜱对斑马鱼仔鱼的LC50值为0.67(0.54–1.06)mg a.i.L-1，随着暴露时间的延长，毒死蜱对斑马鱼仔鱼的毒性增加，暴露96h的LC50值为0.27(0.12–0.38)mga.i.L-1。丁草胺对斑马鱼仔鱼24h的LC50值为0.67(0.53–1.06)mg a.i.L-1，随着暴露时间的延长，丁草胺对斑马鱼仔鱼的毒性增加，但差异不显著，暴露96h的LC50值为0.44(0.30–0.58)mg a.i.L-1。由于毒死蜱和丁草胺对斑马鱼仔鱼96h的LC50值95％置信限重叠，故二者对斑马鱼仔鱼96h毒性不存在显著差异，如表2；
毒死蜱对日本青鳉仔鱼24h的LC50值为0.75(0.56-1.13)mg a.i.L-1，随着暴露时间的延长，毒死蜱对日本青鳉仔鱼的毒性增加，但差异不显著，暴露96h的LC50值为0.24(0.06–0.38)mg a.i.L-1。丁草胺对日本青鳉仔鱼24h的LC50值为0.85(0.56–1.46)mg a.i.L-1，随着暴露时间的延长，丁草胺对日本青鳉仔鱼的毒性增加，但差异不显著，暴露96h的LC50值为0.43(0.18–0.62)mg a.i.L-1。由于毒死蜱和丁草胺对日本青鳉仔鱼96h的LC50值95％置信限重叠，故二者对斑马鱼仔鱼96h毒性也不存在显著差异，如表3；
表2毒死蜱和丁草胺对斑马鱼仔鱼的单一毒性
表3毒死蜱和丁草胺对日本青鳉仔鱼的单一毒性
毒死蜱和丁草胺对斑马鱼仔鱼和日本青鳉仔鱼的毒性没有明显差异，且毒性均属于高毒级；毒死蜱和丁草胺对斑马鱼仔鱼的最大容许浓度分别为0.0027mg a.i.L-1和0.0044mg a.i.L-1；上述两种药剂对日本青鳉仔鱼的最大容许浓度分别为0.0024mg a.i.L-1和0.0043mg a.i.L-1；
(3)毒死蜱和丁草胺对斑马鱼仔鱼和日本青鳉仔鱼的联合毒性：
采用毒死蜱和丁草胺对斑马鱼仔鱼单一毒性所得96h的LC50值为一个毒性单位，进行两者毒性1:1的联合毒性试验。结果表明，这2种污染物在毒性1:1配比下，联合作用结果总体以拮抗作用为主，暴露24h到72h为拮抗作用，暴露96h为相加作用，即毒死蜱的存在降低了丁草胺的毒性，同时丁草胺的存在也降低了毒死蜱的毒性，并且随着暴露时间的延长，拮抗作用减弱，暴露到96h表现为相加作用。因此，生物体与其接触的时间越久，受到的威胁可能更大，如表4，当毒死蜱和丁草胺以浓度比1:1配比时，在暴露24h到96h时间内，二者对斑马鱼仔鱼的联合毒性表现为毒性剧增的协同作用如表4；
表4毒死蜱和丁草胺对斑马鱼仔鱼的联合毒性
毒死蜱和丁草胺在5种浓度配比下(1:4、2:3、1:1、3:2和4:1)对日本青鳉仔鱼在暴露24h到96h均表现为拮抗作用。二者在浓度比2:3时，随着暴露时间的延长拮抗作用减弱，而二者在浓度比1:1时，随着暴露时间的延长拮抗作用增强，如表5-9；
表5毒死蜱和丁草胺浓度比1:4时对日本青鳉仔鱼的联合毒性
表6毒死蜱和丁草胺浓度比2:3时对日本青鳉仔鱼的联合毒性
表7毒死蜱和丁草胺浓度比1:1时对日本青鳉仔鱼的联合毒性
表8毒死蜱和丁草胺浓度比3:2时对日本青鳉仔鱼的联合毒性
表9毒死蜱和丁草胺浓度比4:1时对日本青鳉仔鱼的联合毒性
毒死蜱和丁草胺在不同浓度配比下，联合作用模式不同,并且随着时间的增加,不同浓度配比下的联合作用强度变化规律也不同，可见，两者的联合作用是非常复杂的,这与周启星提出的联合效应广义理论相一致，他们认为在多元复合污染条件下，除了污染物的理化性质外，污染物的浓度组合关系起了更为直接和更为重要的作用，不同的生物种类对同一复合污染条件下的各个污染物以及污染物之间的交互作用有不同的反应模式，当然，在生物体内，有时发生的交互作用并不仅仅局限于污染物与污染物之间，还涉及到污染物与生物体本身固有的组分之间的交互作用，正是由于生物体存在这一作用机制，使得不同生物种类面临同一类型的复合污染胁迫，产生不同的生态毒理效应，使得同一浓度，同一类型的污染胁迫，导致了不同的生物积累和生物毒性，有时，尽管是同一生物种，但由于种群不同，对同一类型的复合污染胁迫也产生不同的生态毒理效应，因此，毒死蜱和丁草胺的联合作用机制还不清楚，尚需进一步研究。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物。

Claims (8)

1.毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、实验生物：实验采用斑马鱼野生型AB品系，购买完成后在实验室内驯养，实验鱼卵采集用成鱼已在本实验室饲养1个月以上，用丰年虫喂食2次/d，投食30min后将残饵和粪便捞出，光照时间与黑暗时间比为14h:10h，繁殖前夜，把健康、性成熟的亲鱼按雌雄1:2的比例放入交配产卵缸内，次日早8h给光让其产卵受精，将清洗和消毒过的正常受精卵分为两部分：一部分用作胚胎实验；另一部分放在26±1℃光照培养箱中孵化，待仔鱼游泳平衡后用于暴露实验；日本青鳉每50尾种鱼按3:2的雌雄比例养殖在10L的圆玻璃缸中，养殖水量为8L，每天早、晚2次投喂新鲜孵化的丰年虫幼虫；每天早晨收取雌鱼所产受精卵，用滴管将卵分开后，挑选受精的健康受精卵用于孵化仔鱼；
B、实验用水及实验设备：试验用水的制备方法参照OECD导则，充分曝氧后待用，其各项主要指标为：水温度斑马鱼为26±1℃，日本青鳉为25±1℃，pH值为7.8±0.2，溶解氧≥7.8mg·L-1，硬度为230±20mg·L-1计，分别作为胚胎和仔鱼染毒器具；
C、实验药剂：96％毒死蜱原药，95％丁草胺原药，采用分析纯N，N-二甲基甲酰胺、吐温-80溶解农药原药并定容配制成一定浓度的母液，其助剂用量体积比不超过0.1％，供测定用；
D、农药对斑马鱼胚胎的毒性：在预试明确农药有效浓度范围的基础上，将农药母液用标准稀释水以等比级差稀释成5-7个浓度，用24孔细胞培养皿作染毒器具，其每孔容积为3mL，20孔为同一实验浓度，其余4孔为空白对照，实验时每孔加入2mL测试药液和1枚随机选取的3hpf(hourpost-fertilization)胚盾期正常受精发育的胚胎，每个浓度设3个重复，在26±1℃的多功能培养箱中孵化，光周期为14h(光照):10h(黑暗)；
E、农药对斑马鱼仔鱼和日本青鳉的单一毒性：根据OECD导则的方法设计农药对斑马鱼和日本青鳉仔鱼的毒性试验，在预试明确农药有效浓度范围的基础上，将农药母液用标准稀释水以等比级差稀释成5-7个浓度，用24孔细胞培养皿作染毒器具，其每孔容积为3mL，20孔为同一实验浓度，其余4孔为空白对照，实验时每孔加入2mL测试药液和一条经镜检发育正常、刚进入平游期的仔鱼，试验期间不喂食，每个浓度设3个重复，斑马鱼试验温度为26±1℃，日本青鳉试验温度为25±1℃，光周期为14h(光照):10h(黑暗)，每隔24h更换1次实验液，每隔24h观察、统计仔鱼死亡数，利用机率值分析法计算得到暴露24h、48h、72h和96h的LC50值及其95％置信限；
F、联合毒性试验：其对包括斑马鱼仔鱼和日本青鳉仔鱼进行毒性试验，其试验步骤如下：
a、斑马鱼仔鱼：以单一农药对斑马鱼仔鱼96h的LC50值为一个毒性单位，分别按照毒性比1:1和浓度比1:1的混合比例以等对数间距设置5-7个不同的浓度，试验方法及各暴露时间的LC50值的计算同1.4.2；
b、日本青鳉仔鱼：以单一农药对日本青鳉仔鱼96h的LC50值为一个毒性单位，以浓度比为1:4、2:3、1:1、3:2和4:1的比例将毒死蜱和丁草胺混合、组成不同配比的二元混合体系，根据预实验结果，按等对数间距设置5-7个不同的浓度，测定个混合体系对日本青鳉的联合毒性，实验步骤及方法与单一毒性的测定相同，二元混合物的总浓度为2个组分浓度之和；
G、联合毒性评价方法：用下面的公式求出生物毒性作用之和S：S＝Am/Ai+Bm/Bi，式中Am和Bm分别是混合物中各毒物的毒性，Ai和Bi分别是A和B毒物单独作用时的毒性；将S转换成相加指数AI，当S≤1时，AI＝(1/S)-1.0；当S>1时，AI＝1.0-S，最后用AI评价化学品的复合效应，当-0.2<AI<0.25时为相加作用(Addition)；当AI≥0.25时为大于相加作用，即协同作用；当AI≤-0.2时为小于相加作用，即拮抗作用；
H、数据处理：根据鱼类仔鱼的死亡数和死亡时间利用机率值分析法计算农药对仔鱼的LC50值及其95％置信限，以LC50值95％置信限是否有重叠作为判断不同种药剂毒性差异是否显著的标准，LC50≤0.1mg a.i.L-1，为剧毒；0.1<LC50≤1.0mg a.i.L-1，为高毒；1.0<LC50≤10.0mg a.i.L-1，为中毒；LC50>10.0mg a.i.L-1，为低毒，最大容许浓度MPC以100作为防护系数，其公式为：MPC＝96h-LC50/100，得到某毒物的最大容许浓度。
2.根据权利要求1所述的毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，其特征在于：所述步骤A中试验水温控制在25±1℃，光照周期为光照14h:黑暗10h。
3.根据权利要求1所述的毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，其特征在于：所述步骤B中采用莱卡S8APO型复消色差立体显微镜进行观察和拍照。
4.根据权利要求1所述的毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，其特征在于：所述步骤E中平游期的仔鱼指受精卵产出后120h的鱼。
5.根据权利要求1所述的毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，其特征在于：所述步骤F中的混合比例参照毒性较大的药剂设计。
6.根据权利要求1所述的毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，其特征在于：所述步骤I中MPC即最大容许浓度。
7.根据权利要求1所述的毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，其特征在于：所述步骤I中农药对仔鱼的毒性分级标准根据国家环保总局1989年制定的《化学农药环境安全评价试验准则》。
8.根据权利要求1所述的毒死蜱和丁草胺复合污染毒性的试验方法，其特征在于：所述步骤D中需每隔24h更换1次实验液，每隔24h观察、显微镜观察CK组和暴露组胚胎，记录正常发育和畸形的胚胎数，计算胚胎孵化数和仔鱼畸形数等，试验持续96h。
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