JP5091861B2 - クロマトグラフィー／マススペクトロメトリーを用いてサンプルを分析する手段と方法 - Google Patents

クロマトグラフィー／マススペクトロメトリーを用いてサンプルを分析する手段と方法 Download PDF

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Description

本発明は少なくとも1つのサンプルを分析する方法に関し、その方法では、該供試サンプルは少なくとも1種の化合物を含んでなり、該方法は次のステップを含んでなる：a) 少なくとも1種の化合物を含んでなる少なくとも1つのサンプルを提供し；b)該供試サンプル中の該少なくとも1種の化合物を決定し、それによって生の結果が作成され；およびc)ステップb)で得られた生の結果を分析し、その該少なくとも1つの供試サンプルの分析には少なくとも1つの参照サンプルの分析を伴い；その分析では供試サンプルおよび参照サンプルがその方法の各ステップにおいて同一の順序で分析される。さらに、本発明は該方法を行うためのシステムを包含し、そのシステムは機能しうる形でお互いに連結された次のものを含んでなる：(a) 化合物を測定する手段；(b) プロセスのパラメーターをモニターする手段；(c) (a)の手段から得られた生の結果を分析する手段であって、生の結果を分析するための該手段は次のものを含んでなる：(i) 化合物を測定する該手段から受け取った生の結果を含んでなる第1のデータベース；(ii) モニターされたプロセスパラメーターを含んでなる第2のデータベース；(iii) その生の結果をヴァリデートするためのルールを含んでなる第3のデータベース；(iv) 同定された化合物のアロケートされた結果を含んでなる第4のデータベース；このシステムでは少なくとも第2、第3、および第4のデータベースは機能しうる形で第1のデータベースと連結されている。
生物体の表現型分析の最新鋭の技術には、とりわけ、ゲノミクスと呼ばれているある生物体のゲノム全体の分析、プロテオミクスと呼ばれているタンパク質全体の分析、およびトランスクリプトミクスと呼ばれるRNA転写産物全体の分析が含まれる。最近になってこれらの表現型分析の基本的技術は、ある生物体のメタボライトの全体であるメタボロームを分析する技術ができたことによって全てが揃った。この技術はメタボロミクス、時にはメタボノミクスと呼ばれる。メタボロミクスは、ある生物体またはその生物体の臓器、組織、または細胞中の低分子量の化合物(すなわちメタボライト)の全ての、ある特定の時点および特定の環境条件下での定性的および定量的測定と定義することができる。従って、メタボロミクスは生物学的物質の代謝の際の組成物の研究と考えることもできる。通常は、生物学的物質のサンプル特に尿中、唾液または血漿を調べる。メタボライトは生化学的経路および細胞性の機作の産物または中間産物である。多数の生物体でのメタボライトの正確な数は不明である。例えば、ヒトでは約2000から多い場合は20,000までの範囲の異なるメタボライトがあると推定されている。特に興味深いのはいわゆる小分子、すなわち種々の代謝の生化学的経路の基質、中間産物、または産物としての役割を有する低分子量の化合物である。遺伝子やタンパク質はその大部分は細胞内で起こることをあらかじめ定めているが、実際の生物活性、それには細胞のシグナル伝達、エネルギー輸送、および細胞間情報伝達が含まれるが、それらの多くはメタボライトのレベルで起こり、またそれらの全てはメタボライトによって調節されている。従って、遺伝子やタンパク質は細胞性の機作と密接に関連はしているが、メタボライトは、例えば異なる細胞間のシグナル伝達などの内因性因子、または例えば環境条件の変化などの外因性因子に応答する実際の細胞の活性を、より一層密接に反映している。メタボロームの変化は、遺伝的変化、疾病、または環境の影響に対する生物体の究極的な答えである。従って、メタボロームは、ある表現型について予言性の最も高いものである。この結果、メタボライトを包括的にかつ量的に研究すること(すなわちメタボロミクス)は、生物体の表現型に及ぼす様々な内因性および外因性の影響を研究するための望ましい道具であり、従って、例えば疾病の発症や進行、または毒性などに関連する複雑な生物学的問題を効果的に取り扱うことができる。前述のとおり、メタボロミクスの利点は、外因性の因子によって引き起こされる影響は、生物体のトランスクリプトーム、プロテオーム、さらにはゲノムやエピゲノムの変化よりも通常ははるかに早く現れる代謝の変化としてただちにモニターすることができることである。メタボロミクスは、生物体のゲノム、トランスクリプトーム、またはプロテオームにただちには影響を及ぼさない外因性因子の影響を測定することができる。例えば、ある毒性化合物はある生物体に対して有害な可能性があるがその生物体のゲノムに変化を起こさせるとは限らない。
生物体のメタボロームなどの化合物の複雑な混合物の分析のための技法としては種々のものが既に報告されている。そのような技法としては、例えば、任意で液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などのクロマトグラフィー分離技法と組み合わせた、質量分析、核磁気共鳴(NMR)。フーリエ変換型赤外スペクトル(FT-IR)、および水素炎イオン化検出器(FID)などが挙げられる。
しかし、メタボロミクスにはそれらの方法によって得られた結果が非常に変動しやすいという欠点がある。この変動性は、技術的および生物学的変動によるものである。技術的変動は分析機器のどんなものにも共通に見られる。しかし、このことは、例えば抽出用、クロマトグラフィー用、および質量分析用の機器などの様々な分析機器は通常はお互いに組み合わせるので、メタボロミクスの分野では特に重要な問題である。そのため、ある１つの機器によって生じた変動は、方法全体では著しく増強されることとなろう。さらに、メタボローム分析によって得られたデータを評価するために適用される分析機器によってより一層技術的な変動性が生ずることとなろう。それらのデータは通常は複雑で多次元のデータセットで、それらは次元圧縮(dimensional reduction)などを含むデータプロセシングを行ってからでなければ評価することができない。従って技法の技術的な変動性によって多数の偽陽性または偽陰性の結果が生み出される。さらに、メタボロミクスに用いる出発材料の生物学的変動性も結果に影響を及ぼす。特に、ゲノミクスやプロテオミクスとは異なり、メタボロミクスで調べようとする対象、すなわちメタボロームは急速に変化しやすい。メタボロームのそのような変化はメタボローム分析の1つのサンプルのランの最中にすら起こりうる。例えば、安定性の低いメタボライトの分解が起こりうる。その結果生ずる分解産物は、当然のことながら、結果に影響を及ぼすこととなる。さらに、メタボロミクスが表現型の比較分析に用いられる場合、例えばある処理をした被験生物のメタボロームを非処理の対照と比較しようとする場合などでは、そのような実験に用いられる出発物質が生物学的な変動性をあらかじめ大きく決定してしまう。被験生物、例えば、供試動物などが異なれば、そのメタボロームは、通常は生理学的範囲内で大きく異なっている。そのため、それらの供試動物が正常で同じような生理学的状態であるように見えても、個々のメタボロームが異なっている可能性はある。従って、比較研究では、正常な状態で生ずる代謝の相異が生物学的変動性にさらに寄与する。この結果、毒性評価または薬剤の有効性を調べる研究のために用いられる比較メタボロミクスは、技術的および生物学的ソースに起因する変動によって強い影響を受ける。このため、偽陽性や偽陰性の結果が多数生ずることを考慮すると、メタボロミクスに基づいた知見が確かに妥当なものであると確信することは現在のところ困難である。それでもやはり、毒性評価、薬剤開発、薬理遺伝学、または診断などを含む様々な課題に対してメタボロミクス分析技術を信頼性を持って適用することは極めて望ましいことであろう。
さらに、メタボロミクスのほかに、一般的に、化合物の複雑な混合物を分析するための信頼性の高い技術はずっと以前から必要とされている。
従って、上述の要求に応えるためには、本発明の基礎となっている技術的な問題点は、手段と方法の条件であると考えなければならない、すなわちあるサンプル、それは生物学的サンプル中のメタボライトなどのような、少なくとも1種の化合物、好ましくは複数の化合物を含んでなるが、そのようなサンプルの分析のための信頼しうる効率的な方法が提供されなければならない。その技術的問題は特許請求の範囲の記載で特徴付けられ、下記で説明している実施態様によって解決されるものである。
従って、本発明は少なくとも1つのサンプルを分析する方法に関し、その方法では、該供試サンプルは少なくとも1種の化合物を含んでなり、該方法は次のステップを含んでなる：a) 少なくとも1種の化合物を含んでなる少なくとも1つのサンプルを提供し；b)該供試サンプル中の該少なくとも1種の化合物を決定し、それによって生の結果が作成され；およびc)ステップb)で得られた生の結果を分析し、その該少なくとも1つの供試サンプルの分析には少なくとも1つの参照サンプルの分析を伴い；その分析では供試サンプルおよび参照サンプルがその方法の各ステップにおいて同一の順序で分析される。
「分析するための方法」という表現は、本発明の方法を全ての分析目的に用いうることを意味している。本発明の方法は本質的には上述のステップからなるものとすることができるか、またはさらに別のステップを含んだものとすることができる。さらに、本発明の方法それ自体が異なる目的のための方法、例えばスクリーニング方法、診断方法、または品質管理方法などの方法中に包含されることも想定している。本発明の方法を適用しうる好ましい技術分野については下記に詳述する。
本明細書中で用いられている「少なくとも1種の化合物」という用語は、単一種の化合物または複数の種類の化合物、すなわち好ましくは少なくとも2、3、4、5、10、50、100、500、1,000、2,000、3,000、5,000、または10,000種類の化合物を意味する。本明細書中で用いている化合物とは、該化合物の少なくとも1個の分子から該化合物の複数の分子とすることができ、複数の種類の化合物とは化学的に異なる複数の分子であって各化合物について少なくとも1個の分子から複数の分子が存在していることを、理解すべきである。本発明の化合物は全てのクラスの有機化合物または無機化合物を包含し、それらには生物体などの生物学的物質の構成成分である化合物が含まれる。好ましくは、本発明の化合物は小分子の化合物であり、より好ましくはメタボライトである。より好ましくは、複数の種類の化合物を想定している場合には、複数の種類の該化合物はメタボロームをなすメタボライトである。
メタボライトは小分子の化合物であり、例えば、代謝経路の酵素の基質、そのような経路の中間産物、または代謝経路によって得られる産物などである。代謝経路は当業界ではよく知られており、生物の種によって異なりうる。好ましくは、該経路としては、少なくともクエン酸サイクル、呼吸鎖、光合成、光呼吸、解糖系、糖新生、ヘキソースモノリン酸経路、酸化的ペントースリン酸経路、脂肪酸の産生とβ酸化、尿素サイクル、アミノ酸生合成経路、プロテアソーム分解などのタンパク質分解経路、アミノ酸分解経路、次のもの生合成または分解：脂質、ポリケチド(例えばフラボノイドやイソフラボノイドを含む)、イソプレノイド(例えば、テルペン、ステロール、ステロイド、カロテノイド、キサントフィルなどを含む)、炭水化物、フェニルプロパノイドおよびその誘導体、アルカロイド、ベンゼノイド、インドール、インドール-イオウ化合物、ポルフィリン、アントシアニン、ホルモン、ビタミン、補欠分子族あるいは電子キャリアーなどの協同因子、リグニン、グルコシノレート、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および関連分子例えばtRNA、ミクロRNA(miRNA)あるいはmRNA、を含む。従って、小分子化合物メタボライトは好ましくは次のクラスの化合物からなる：アルコール、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、アミン、イミン、アミド、シアン化物、アミノ酸、ペプチド、チオール、チオエステル、リン酸エステル、硫酸エステル、チオエーテル、スルホキシド、エーテル、または上述の化合物の組み合わせまたは誘導体。メタボライト中の小分子は、正常な全ての機能、臓器機能、または動物の成長、発達、または健康に必要とされる、一次メタボライトであろう。さらに、小分子メタボライトは、生物体に必須の生態学的機能を有する二次メタボライト、例えば生物体をその環境に適合させることのできるメタボライトなどを含んでいる。さらにまた、メタボライトは該一次および二次メタボライトに限定されるものではなく、さらに人工の小分子化合物をも包含する。人工の該小分子化合物は、生物体に投与されたまたは生物体によって摂取された、外因性に提供された小分子であるが、上記で定義した一次または二次メタボライトではないものである。例えば、人工小分子化合物は薬剤から動物の代謝経路によって得られる代謝産物であってもよい。さらに、メタボライトは、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびRNAやDNAなどのポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、メタボライトの分子量は50 Da(ドルトン)から30,000 Daであり、最も好ましくは30,000 Da未満、20,000 Da未満、15,000 Da未満、10,000 Da未満、8,000 Da未満、7,000 Da未満、6,000 Da未満、5,000 Da未満、4,000 Da未満、3,000 Da未満、2,000 Da未満、1,000 Da未満、500 Da未満、300 Da未満、200 Da未満、100 Da未満である。しかし、好ましくは、メタボライトの分子量は少なくとも50 Daである。最も好ましくは、本発明のメタボライトの分子量は50 Daから1,500 Daまでである。
本明細書で用いている「供試サンプル」という用語は、本発明の方法で分析されることとなるサンプルを意味する。該供試サンプルは、人工的サンプル、生物学的サンプル、または環境サンプルとする。その供試サンプルは液体、固体、気体、または超臨界サンプルとすることができる。
人工的サンプルは、少なくとも1種のあらかじめ選択された化合物を含んでなるサンプル、またはその化合物からなるサンプルである(すなわち、天然物でない化合物、または自然環境から分離され人工的サンプルと組み合わされた天然の化合物)。複数の化合物を含んでなる人工的サンプルは、あらかじめ選択された化合物を単に混合することによって得ることができる。さらに、サンプルはin vitroで行った化学反応の結果として得られた化合物からなるものとすることができる。従って、本発明の少なくとも1種の化合物は、化学反応によって得られた産物または複数の産物とすることができる。
さらに、少なくとも1種の化合物を含んでなるサンプルは生物学的または環境のソースから得ることができる。通常は、生物学的ソースから得られたサンプル(すなわち、生物学的サンプル)は複数の種類の化合物を含んでいる。従って、それらは複雑なサンプルであり、分析および特徴を調べることが困難である。好ましくは、生物学的サンプルは生物体由来のものである。本明細書では生物体とは、動物(ヒトを含む)、植物、細菌、真菌、およびウイルスを包含している。好ましくは、細菌、ウイルス、または真菌のサンプルは、それらを含んでなる培養物の形態で提供される。そのような培養物の提供および入手法は当業界ではよく知られている。サンプルはまた、異種の生物体の混合物、例えばマイクロバイオム(microbiome)、それには腸内微生物叢が包含されるが、そのようなマイクロバイオム、またはある特定の環境、例えばサラゴサ海などの環境で生活している微生物集団のようなものとすることもできる。好ましくは、植物からのサンプルは、植物の葉、幹、根、または花などの植物の部分、またはその植物の種子から得られたものである。しかし、その植物全体も用いることができる。動物からのサンプルとしては、体液、好ましくは血液、血漿、血清、リンパ液、汗、唾液、涙液、精液、膣液、糞便、尿、または脳脊髄液、または、例えば生検などによって細胞、組織、または器官から由来したサンプルが挙げられる。生物学的サンプルはまた、細胞内のコンパートメントまたは細胞内小器官、例えば、ゴルジ装置や植物細胞ではクロロプラストなどをも包含する。さらに、生物学的サンプルはまた、気体状サンプル、例えば生物体の揮発性物質なども包含する。
さらに、本発明のサンプルとしては環境サンプルをも含む。環境サンプルは、自然または環境の何らかの適切な場所から得たものである。好ましくは、それらのサンプルは自然または環境の該場所に存在する少なくとも1種の化合物を含んでなる。より好ましくは、環境サンプルは該場所で見出される複数の種類の化合物、例えば有機化合物および無機化合物、または生物体などを含んでなる。好ましくは、環境サンプルは地質学的サンプル、古生物学的サンプル、水または排水のサンプル、または大気サンプルなどの気体状サンプルが含まれる。
最も好ましくは、本発明のサンプルは上記で定義した生物学的サンプルである。
好ましくは、上述のサンプルは本発明の方法で特徴を調べる前にあらかじめ処理される。下記でより詳細に説明するとおり、該前処理としては、化合物を放出または分離するために必要な処理、または過剰な物質または不要物を除去するために必要な処理が挙げられる。適切な技術は、化合物の抽出、分画、精製、および/または濃縮を含んでなる。さらに、化合物の分析のために適した形態または濃度の化合物を提供するためにその他の前処理が行われる。例えば、本発明の方法でガスクロマトグラフィーをマススペクトロメトリーと組み合わせて用いる場合には、該ガスクロマトグラフィーを行う前に化合物を誘導体化することが必要であろう。適切で必要な前処理は本発明の方法を行うための手段によって異なり、当業者にはよく知られている。上述の前処理されたサンプルはまた、本発明で用いられている「サンプル」という用語に含まれている。
本発明で用いている「提供する(providing)」という用語は、少なくとも1つの供試サンプルが、該供試サンプル中に含まれる少なくとも1種の化合物を測定するために適した様式で提供されることを意味している。従って、本明細書中で用いられている「提供する」とは、本明細書中で特に言及したものを含む適切な前処理を行うこと、すなわち、最も好ましくは、サンプルの濃縮もしくは分画、および/またはサンプルの抽出を行うことをも意味する。供試サンプル中の少なくとも1種の化合物を測定するために用いられる技法の如何によっては、さらに追加の前処理を必要とする可能性もある。そのような前処理としては、タンパク質の加水分解、または既に上述し、下記に詳細に述べるように、ガスクロマトグラフィーの前にサンプル中に存在する少なくとも1種の化合物を誘導体化することが包含される。
本明細書で用いている「該少なくとも1種の化合物を測定する」という用語は本明細書中で述べているサンプルに含まれている少なくとも1種の化合物の少なくとも1種の特性を測定することを意味する。本発明では特性とは、ある化合物の物理的および/または生化学的性質を含む化学的性質を特徴付ける特質のことである。そのような性質としては、例えば、分子量、粘度、密度、電荷、スピン、光学活性、色調、蛍光、化学発光、元素組成、化学構造、他の化合物との結合能、生物学的読み出しシステムにおいて応答しうる能力(例えば、リポーター遺伝子の誘導)、および類似のものが挙げられる。該性質の値は特性として役に立ち、当業界ではよく知られた技術によって測定することができる。さらに、その特性は、ある化合物の物理的および/または化学的性質の値から標準的な操作、例えば、かけ算、割り算、または対数変換などの数学的計算によって由来するいかなる特質とすることもできる。好ましくは、比率を計算することができる。最も好ましくは、本発明で測定される特性は化合物の分子量および/または電荷である。その分子量と電荷から由来する最も好ましい特性は質量対電荷の比(m/z)である。
ある供試サンプル中に含まれる少なくとも1種の化合物は本発明に従って定量的または定性的に測定することができる。定性的測定には、その化合物の存在または不在が適切な技法によって測定される。さらに、好ましくは、定性的測定としては化学的構造、またはその化合物の組成を決定することが含まれる。定量的測定には、そのサンプル中に存在する少なくとも1種の化合物の正確な量が測定されるか、またはその少なくとも1種の化合物の相対的な量が測定される。化合物の正確な量が測定できないまたは測定すべきでない場合に、その相対的な量を測定することができる。その場合には、その相対的な量は、その中にその化合物が存在している量が、該化合物を第2の量で含んでいる第2のサンプルと比較して拡大しているかまたは縮小しているかを決定することができる。したがってある化合物を定量的に分析することには、化合物の半定量的分析と、時には呼ばれることのあるものをも含む。
さらに、本発明の方法で用いられる測定する、とは、好ましくは前述の化合物分析ステップの前に化合物分離ステップを用いることを含む。好ましくは、該化合物分離ステップは、化合物を時間によって分離する分離法をもたらすようなステップである。従って本発明で用いる適切な分離技術は、好ましくは、液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、薄層クロマトグラフィー、サイズ排除またはアフィニティークロマトグラフィーなどの全てのクロマトグラフィーでの分離が含まれる。これらの技法は当業界ではよく知られており、当業者であれば苦もなく適用することができる。最も好ましくは、LCおよび/またはGCが本発明の方法で想定されているクロマトグラフィー技法である。
化合物のそのような測定のための適切な装置は当業界ではよく知られている。好ましくは、質量分析が特にガスクロマトグラフィー/マススペクトロメトリー(GC-MS)、液体クロマトグラフィー/マススペクトロメトリー(LC-MS)、直接導入型マススペクトロメトリーまたはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴マススペクトロメトリー(FT-ICR-MS)、キャピラリー電気泳動/マススペクトロメトリー(CE-MS)、高速液体クロマトグラフィー/マススペクトロメトリー(HPLC-MS)、四重極型マススペクトロメトリー、MS-MSまたはMS-MS-MSなどの何らかの連続的に結合したマススペクトロメトリー、誘導結合プラズマ/マススペクトロメトリー(ICP-MS)、熱分解/マススペクトロメトリー(Py-MS)、イオン移動度/マススペクトロメトリーまたは飛行時間型マススペクトロメトリー(TOF)において用いられる。最も好ましくは、LC-MSおよび/またはGC-MSが用いられ、それらは下記に詳述する。該技法は、例えば、Nissen, Journao of Chromatography A, 703, 1995:37-57, 米国特許第4,540,884号、または米国特許第5,397,894号中に開示されており、その開示内容は本明細書中に参照により組み入れる。質量分析技法の代替として、または質量分析技法の追加として、次の方法を化合物決定用に用いることができる：核磁気共鳴(NMR)、核磁気共鳴画像法(MRI)、フーリエ変換型赤外分光法(FT-IR)、紫外吸収スペクトル(UV)、屈折率(RI)、蛍光検出、放射化学的検出、電気化学的検出、光散乱(LS)、分散ラマンスペクトル、または水素炎イオン化検出器(FID)。これらの技法は当業者にはよく知られており、苦もなく適用することができる。
本発明で測定されるある化合物についての特性は少なくとも2種類の異なる変数によって示すことができ、該変数のうちの少なくとも1つは強度の変数であることを想定している。強度変数は測定されたシグナルの強度を反映するものであればどのような変数であっても良い。シグナル強度は、好ましくは、化合物の量と直接的または間接的に相関する。その他の変数は化合物の特性によって変わる変数であって、好ましい1実施形態においては、時間変数および質量変数である。本発明の方法の好ましい1実施形態においては、GC-MSおよび/またはLC-MSなどのように、時間分離技法を質量分離技法と組み合わせる。時間分離技法は時間の関数としてシグナル強度を作り出す。クロマトグラフィーを用いる場合、それは本発明で好ましいと想定しているものであるが、そのような場合には、時間変数は好ましくは保持時間である。そうではあるが、「時間変数」という表現は基本的には実験または測定の進行の程度を示しているいかなる変数にも一般化することができる。従って、例えば、「時間変数」という表現は位置変数をも含んだものとすることができ、その位置変数は特徴的な速度を用いることによってプロセス時間に変換することができる。従って例えば、クロマトグラフィーカラムを用いる場合にはある特定の化合物の位置(例えば、カラム内部の特異的な着色によって示されるような)を、例えばその化合物の位置をそのカラム内の溶媒の位置、それはそのカラム内でのその溶媒の速度(移動速度)に依存しているが、その位置と比較することによって、時間に変換することができる。実験または測定の進行の程度を示すような他のタイプの「時間変数」も利用可能であり、含めるべきであるが、そのようなものとしては例えば、既知の周期性をを有するプロセスのサイクル数などが挙げられる。「時間変数」という表現と同様に、「質量変数」という表現も質量に限定すべきものではなく、例えば、質量対電荷比、m/zおよび/またはその他の質量から由来する変数などを含むものとすることができる。
本明細書中で用いている「測定する」とはさらに、一次生データを生の結果へとプロセスすることを含んでいる。例えば、測定方法として質量分析を用いる場合には、一次生データは例えば、イオン衝撃を測定する二次電子増強装置によって作り出される。その後に発生する電圧シグナルは変換されて生の結果となるが、それは、該シグナルの強度値、および衝撃の位置(チャンネル位置)、質量フィルターのセッティング、または衝撃までの時間などの質量関連の値に基づいたものである。一次生データの該プロセシングは当業界ではよく知られた技法で行うことができる。NMR、IR、UV、またはその他の分光技法の場合には、電磁的放射の吸収が測定される。方法によって異なるが、シンチレーション装置、半導体、光電素子、熱センサー、または光電子増倍器が、吸収を測定するために用いられる。ここでも、電圧をベースとした二次シグナルが一次生データとして作り出される。上述のとおり、該一次生データは当業界ではよく知られた技法によって生の結果へとプロセスすることができる。
「生の結果」という用語は、上述の一次生データのプロセスされたものを意味する。生の結果は、好ましくは、上述の少なくとも2つの変数によって特徴付けられる少なくとも1つのデータポイントを含んでなる。好ましくは、質量分析を用いる場合には、そのデータポイントは質量変数および強度変数によって特徴付けられる。さらに、化合物は生の結果において1つ以上のデータポイントを作り出しうることは理解されるべきである。質量分析を用いる場合には、データポイントは生の結果においてはピークをもたらしうるものである。従って、本発明の好ましい1実施形態においてはLC-MSおよび/またはGC-MSが、化合物の測定に用いられ、一次生データは3次元のフォーマット中にプロセスされる。そのフォーマットは測定して得られた一次生データに対応するデータポイントを含んでいる。一次生データの各データポイントの全体は最大値(すなわちピーク)および最小値(すなわち強度変数についてはゼロレベルのデータポイント)を含んだ3次元景観を形成する。生の結果はまた、その他の適切なフォーマット、例えばデータシートなどで示すこともできる。
一次生データをプロセスする手段と方法は当業界ではよく知られている。例えば、質量分析と組み合わせたクロマトグラフィーの場合には、プロセシングのためのコンピュータープログラムは市販されており、例えば、Chem Station(Agilent Technologies, USA)、Analyst(MDS SCIEX, Canada)、またはAMDIS(NIST, USA)などが挙げられる。さらに、一次生データのプロセシングは、一次生データを数値的フォーマットに変換する、データを一般的なユニットフォーマットに変換する、および/またはデータの次元を減らすことによって、連接した(coherentな)データを作ることが必要となることもある。そのような連接したデータを作り出すための適切な手段と方法はWO 03/046798中に開示されており、その開示内容は本明細書中に参照により組み入れる。
「参照サンプル」という用語は少なくとも1種の参照化合物を含んでいるサンプルを意味する。該参照化合物は、本発明の1態様においては、あらかじめ選択された量のあらかじめ選択された化合物またはそのようなあらかじめ選択された化合物の混合物である。本明細書で前述したように、生物学的材料を含んでいるサンプルを調べる場合には、生物学的材料のサンプルが参照サンプルとしても役に立つことが考慮されている。その参照サンプルは本発明の方法によって作り出された生の結果を、技術的変動性および/または生物学的変動性に関してノーマライズするために適したものである。このことは同一の参照サンプルについて行った種々の分析(すなわち理論的には同一の結果が生じるはずの種々の分析)を比較することによって達成することができ、それについては下記に詳述する。
この目的のために、本発明では、本発明の方法で行った少なくとも1つのシリーズの分析(すなわち少なくとも2つの供試サンプルの分析)には、本質的に同一の組成を有する参照サンプルを用いるのが有利であることが見出された。1つのシリーズの分析は、例えば、比較研究として行うことができる。そのような研究では、好ましくは、少なくとも1つの第1の供試サンプルが分析され、該分析によって得られた結果を、少なくとも1つの第2の供試サンプルの分析結果と比較する。その場合の参照サンプルは様々なアリコートに分けることができる。従って、その参照サンプルの1つのアリコートはそのシリーズの分析の各々のための参照サンプルとして役立ちうる。そのようなアリコートは、アリコートの組成に変化を与えない条件下で保管することは理解すべきである。例えば、参照サンプルとして用いる生物学的サンプルのアリコートは、好ましくは、不活性の雰囲気、例えば液体窒素内、または少なくと−80℃の温度で保管することができる。ある供試サンプルの単一の分析のみが行われる場合には、既に以前に分析してある参照サンプルを用いることを想定している、すなわち以前の分析から得られたその生の結果が利用できる。本発明の方法では2つ以上の参照サンプルを用いることができる。さらに、同一の参照サンプル(例えば、1種類の参照サンプルの種々のアリコート)が、好ましくは2回以上、より好ましくは3回から10回、下記に述べるシークエンスで含まれる。好ましくは、少なくとも3種の異なる参照サンプルが用いられる。好ましい参照サンプルは下記に詳述する。さらに、本発明の方法の特定のステップのために、各ステップ全体のために用いられる上述の参照サンプルに加えて、別の参照サンプルを含めることができる。
本発明で用いている「シークエンス」(sequence)という用語は、一緒に分析されることとなるサンプルの集まりを意味する。好ましくは、供試サンプルおよび参照サンプルは一定の順序で、すなわち、同一の1回の分析内だが別々のサンプルのランで、同一の装置を用いて、本発明の方法にかけられる。より好ましくは、シークエンスは少なくとも1つの供試サンプルと少なくとも1つの参照サンプルを含んでなり、最も好ましくは、少なくとも1つの供試サンプルと少なくとも2つの参照サンプルである。シークエンスの順序はランダムに、またはあらかじめ選択しておくことができる。全ステップに同一のランダム化した、またはあらかじめ選択したシークエンスの順序を用いるか、または、その方法の各ステップについて新たなシークエンスを定めることができる。
本明細書で用いている「分析する」という用語は、本発明の方法によって作り出された生の結果をヴァリデートすること、および/または評価することを意味する。その方法の特定の目的の如何によって変わるが、この用語はさらに別のステップを含むものとすることができる。該さらに別のステップを含んでいる本発明の方法の好ましい実施形態は本明細書の別のところで特定する。
本明細書で用いているヴァリデーションとは、分析の際に、すなわちサンプルのランの際にモニターされたプロセスのパラメーターを考慮しつつ生の結果を確認することまたは無効にすることを包含する。例えば、モニターしたプロセスのパラメーターが本発明の方法を行うために用いているある特定の分析装置が技術的に整合性に欠けていることを示した場合には(例えば、電気機器内の電圧または電流の変動、または流速の変化、またはクロマトグラフィーの間の標準品の回収率の変化など)、該サンプルランから得られた生の結果は無効とし、従ってその評価においてさらにそれ以上考慮はしない。さらに、ヴァリデーションには、生の結果の各ピークまたはシグナルをヴァリデーションアルゴリズムにかけることを包含する。そのようなアルゴリズムでは、例えば、あるピークまたはシグナルの特性を、対応する参照のピークまたはシグナル、または最適なものを仮定したピークまたはシグナルと比較することができる。生の結果に含まれているピークまたはシグナルの特性が、対応する参照の特性と著しく異なる場合も、そのピークまたはシグナルを評価用としては無効とする。適切なアルゴリズムでは、例えば、相対的保持時間の指数、ピークの形状、標準的なマトリクスで得られたfortification(強化された)結果、あらかじめ選択した化合物についてのfortification 結果、および/または外部標準でのキャリブレーションなどを考慮に入れており、それらについては下記に詳細に述べる。
本明細書で用いている分析するという用語は、好ましくは、既にヴァリデートされている生の結果の評価をも包含する。評価には、参照サンプルから得られたヴァリデートされた結果(すなわち、実際の分析の結果および同一の参照サンプルについての以前の分析の結果)に関して、ヴァリデートされた結果のノーマライズが包含されるが、それについては下記に詳述する。ノーマライズのステップおよびヴァリデーションは逆の順番で、および/または反復して行うことができる。好ましくは、ヴァリデーションはノーマライズの前に行われる。
さらに、評価には、少なくとも1種の特定の化合物の存在または不在またはその化合物の化学的性質に関して(定性的分析)、あるいは少なくとも1種の化合物の正確なまたは相対的な量に関しての(定量的分析)ヴァリデートされた結果に基づいて結論を引き出すことのできる全ての技法が含まれる。さらに、その結論は、好ましくは種々のサンプル中の化合物の同一性の程度または化合物の量に関しての結論を包含するものである。好ましい1態様においては、評価は種々のサンプル間のヴァリデートされた結果の比較をも包含する。最も好ましくは、該比較は、それらのサンプルがお互いに異なるのか同一であるのかを評価することを含む(すなわち、類似性の程度が求められる)。原則的には、化合物または化合物の特性または化合物の量が種々のサンプル間で著しく異なるか否かを決定することのできる統計学的検定が、上述の比較を行うために適している。より好ましくは、適切な技法としては、パターン認識アルゴリズムおよび/または統計学的検定アルゴリズムおよび/または多変量アルゴリズムが含まれ、例えば、Principal Component Analysis(PCA)、Simple Component Analysis(SCA)、Independent Component Analysis(ICA)、Principal Component Regression(PCR)、Partial Least Squares(PLS)、PLS Discriminant Analysis(PLS-DA)、Support Vector Machines(SVM)、Neural Networks、Bayesian Networks、Bayesian Learning Networks、Mutual Information、Backpropagation Networks、symmetrical Feed-Forward Networks、Self-Organizing Maps(SOMs)、Genetic Algorithms、HierarchicalまたはK-Mean Clustering、Anova、Studentのt検定、Kruskal-Wallis検定、Mann-Whitney検定、Tukey-Kramer検定、またはHsu's Best検定が挙げられる。好ましくは、上述のサンプルの比較は、サンプルの定性的または定量的組成に関して、サンプル間の相異または類似性を求めるために適用することができる。類似性の決定は、好ましくは、化合物の量についてその平均値または中央値を決定することをも包含する。本明細書中で用いている比較とは、後者の場合には、好ましくは、その組成が異なっていることが疑われる2つのサンプルの平均値または中央値を比較することも含まれる。本発明で用いている評価は、好ましくは自動化、例えば、上述のアルゴリズムのうちの少なくとも1つをコンピューターで行うための適切なコンピュータープログラムによって自動化することにより、助けることができる。
下記の特に好ましい評価のためのアルゴリズムは、好ましくは、全体としてまたは部分的に、コンピューターおよび/またはコンピューターネットワーク、または類似のデータプロセシング装置によって実行されるときに評価を行うことを考慮したインストラクションを含んでいるコンピュータープログラムによって行われる。
好ましくは、ヴァリデートされた結果の評価の際に行う場合には、比較することとは、該ヴァリデートされた結果を、参照のセットに対して類似性がある/異なっているという点で分類することを含んでいる。好ましくは、1つのアルゴリズムが用いられ、それは「ミスマッチ/マッチ(MMM)アプローチ」と名付けることができる。この方法では、分析のステップは、少なくとも2つのベクトルを関連づけるステップが含まれ、そのステップでは少なくとも2つのベクトルのうちの少なくとも1つをそのベクトルの成分の信頼性を考慮に入れつつ、それらの成分についての縮退(shrinkage)プロセスにかける。
「MMM法」の好ましい実施形態においては、このアルゴリズムには下記のステップが含まれる：
サンプルの各群(例えば、非処理の対照のサンプルに対して、代謝性の変化を生じさせることが考えられるある特定の化合物で処理された供試サンプル)は、コントラストのベクトルX=X1, X2, X3, ……Xiによって特徴付けられ、この式でiは個々のメタボライトを示し、Xiは各サンプル群内の個々のメタボライトについてのヴァリデートされた結果に対応する。典型的には、Xは試験群(T)の中央値または平均値、および対照群(C)の中央値または平均値から計算された、コントラストの中央値または平均値を示しており、すなわち、Xi=Median(Ti)-Median(Ci)またはXi=Mean(Ti)-Mean(Ci)である。従って、例えば、Xiの正の値はメタボライトの濃度の増加を示し、一方Xiの負の値は減少を示している。
この方法の目的は、例えば、コントラストのベクトルY=Y1, Y2, Y3, ……Yiによって特徴付けられる参照サンプルによるプロフィールの供試サンプルのプロフィールとのマッチングを見出すこと、あるいはまたまたはそれに加えて、これらのプロフィールの間の差を見出すことである。従来の方法は当業者には既知である、それらの方法は、Pearson 相関法、Spearman 相関法、またはKendall相関法などの相関法に基づいたものである。従って、例えば、Pearson相関法に従ってプロフィールの比較を行う際は、参照プロフィールYの供試プロフィールXとのマッチングを見出すために下記のアルゴリズムを用いることができる：

maxy(corr(X,Y)) ＝ maxy Σi[(Xi-<X>)(Yi-<Y>)/(sd(X) sd(Y))]
≒ maxy Σi[Xi Yi/(|X||Y|)]
＝ maxy (Σi [Xi Yi /(|X||Y|)]- +Σi[Xi Yi/(|X||Y|)]+)

この式で標準偏差は"sd"、[x]-はx<0であればxに等しくそうでなければ0であり、[x]+はx>0であればxに等しくそうでなければ0であり、対数比では<X>≒0、<Y>≒0と仮定している。
最後の項では1番目の総和は「ミスマッチ」の(負の)スコアを示す、すなわちプロフィールXおよびYの個々のコンポーネントの負の積の総和であり、従ってメタボリックプロフィール内の差を数量化したものである。

ミスマッチ ＝ - Σi[Xi Yi/(|X||Y|)]->0

第2番目の総和は「マッチ」のスコアを示している、すなわち、プロフィールXおよびYの個々のコンポーネントの正の積の総和であり、従って、メタボリックプロフィール内の類似性を数量化したものを示している。

マッチ ＝ Σi[Xi Yi/(|X||Y|)]+> 0

しかし、マッチとミスマッチを分けることなく全体にわたって総和を求めることによるこれらの既知の相関法は、マッチのスコアとミスマッチのスコアによって別々に提供される情報を無視している。
本発明に従って行われる「MMM法」では、この追加情報を考慮に入れる。マッチとミスマッチを分けて評価することによって予測の信頼性の程度が高くなることは数学的に示すことができるが、それは例えば、多くの場合、ミスマッチのスコアによって提供される情報は、マッチのスコアによって提供される情報よりも、相異や類似性の決定には大きい意味があるからである。
MMM法では、マッチのスコアおよびミスマッチのスコア内の情報の内容は「縮退(shrinkage)」と呼ばれるステップによってさらに強調される。従って、コントラストベクトルXに加えて、コントラストベクトルXと同じ次元の第2の確率のベクトルPが計算され、それはP=P1, P2, P3, ……Piとなる。Pは、適切な2サンプル検定法、例えばt検定、Welch検定、Wilcoxon検定その他などによって試験群または処理を受けた集団(Ti)を対照の集団(Ci)に対して行った検定に由来する、十分な統計学的根拠のあるベクトルである。公式的ではないが、Piは対応するコントラストXiが偶然見つかったもの(chance find)である尤度を評価するものであり、従って、コントラストXiの信頼性(実験的なおよび/または統計学的な)を評価するものである。
次に、2つのベクトルXとPを一列に並べ、Pをあらかじめ定めた確率値αでエレメントについてに比較する。確率Pkがαよりも大きい場合には、対応するコントラストXkを0とセットする(すなわち"shrink"させる、そこでこの方法の名前が生まれた)。縮退の前に確率のレベルαを定めなければならないことは理解されるべきである。好ましくは、α=0.05、α=0.10、またはα=0.01(それぞれ5%、10%、および1%の検定レベル)が推奨されるが、より大きいまたは小さい値も、取り扱う問題によっては合理的であろう。あるいはまた、ベクトルコンポーネントの各々について個々の確率αkを用いることもできる。この方法(いわゆる"縮退")によって、小規模で重要でない変化はミスマッチ-マッチの統計学的処理に寄与しないことが確保される(下記参照)。統計学的には、縮退はミスマッチ-マッチスコアの変動/バイアスを大きく減らす。従って、上述の縮退ステップを生物学的サンプルから得られたデータについて行うことは、例えば、被験物間の生物学的変動からのネガティブな影響を減らすこととなる。その結果残った重要な値｜X｜>0であるXは、変化を受けずにそのままであるか、または離散化(discretize)されるかのどちらかである。離散化は、好ましくは、三元のコード化、すなわち全ての正の値を1とし、全ての負の値を−1とすることによって行うことができる。離散化には、−1、0、および1の3つのレベルより多いレベル、例えば、非常に重要なXの値について−2および2のレベルを追加することもできる。
さらに次の1ステップにおいては、上記で概説した「従来の」相関法と同様に、ミスマッチ-マッチスコアリングを、2つのshrinkされたプロフィール、つまりX'とY'の類似性/非類似性を評価するために行うが、ここでX'とは上述のshrinkされた供試サンプルのプロフィールであり、Y'とは上述のshrinkされた参照サンプルのプロフィールである。これらの2つのベクトルX'、Y'を一列に並べ、コンポーネントについて乗じ、ユニット長にノーマライズする、すなわち、

Z'＝ (X'1*Y'1, X'2*Y'2, X’3*Y'3…X'i*Y'I)/(|X'|*|Y'|)

この式で｜X'｜｜Y'｜はそれぞれユークリッドノルムであり、

|X'| ＝ sqrt(X'1*X'1+ X'2*X'2+ X'3*X'3+……X'i*X'i)
|Y'| ＝ sqrt(Y'1*Y'1+ Y'2*Y'2+ Y'3*Y'3+……Y'i*Y'i)

この式で"sqrt"は平方根を示し、"*"は乗算を示している。
あるいはまた、ノーマライズしていないZ'を用いることができる、すなわち
Z' ＝ (X'1*Y'1, X'2*Y'2, X'3*Y'3 ……X'i*Y'i)。
ノーマライズしていないZ'についての式は、ノーマライズしたZ'についての式と同様に最大の相関の変わりに最大の共分散を用いて導くことができる。
次いで、Z'の正と負のコンポーネントを別々に要約し、それによって2つのスコアを定義する、すなわちマッチのスコアとミスマッチのスコアは次のようになる：

マッチ ＝ Σk [Z'k]+
ミスマッチ ＝ -Σk [Z'k]-

縮退を行った場合にはミスマッチスコアはマッチスコアよりもはるかに多い情報を提供することを示しうる。このように、2つのスコアを判定するための規定(prescription)が定められる。その規定に従えば、類似のプロフィールを有するものはミスマッチが最小となりマッチが最大となる。従って、「マッチ」のスコアと「ミスマッチ」のスコアから別々に提供される情報を考慮に入れることによって、MMM法はメタボリックプロフィールの、信頼性が高く効果的な評価および/または分類を行うことができる。
本発明の方法のより好ましい1実施形態においては、上記で特定したアルゴリズムを用いることによって、多数のプロフィールを包含する参照セットに対してのある1つのプロフィールの比較を行うためにMMM法を用いることができる。この目的のために、下記のステップを行う：
第1に、上述の各ステップを所望の数の参照プロフィールに適用してN個のペアのスコアを得る(N=参照プロフィールの数)。
次いで、それらのスコアリングデータを下記のステップの1つ以上によってプロセスすることができる：
1) N個のペアのスコアを、まず、「ミスマッチ」のスコアで次第に増加する順にソートし、次いで「マッチ」のスコアを次第に減少する順にソートする。このソーティングを行うことによってミスマッチスコアが最小限でかつマッチスコアが最大限であるような候補をリストの最上位に置くこととなる。このアプローチは離散化プロフィールには特に適している。参照セットからの候補品も標的とするものと同様にソートしたリストの最上位に見出すことができる；
2) スコアをソートすることに加えてミスマッチ-マッチのスコアをプロットすることを推奨するが、それはそのことによって変質したペア、別の候補、その他についての価値のある情報が提供されることとなるからである。このことは、ミスマッチスコアに対してマッチスコアを、参照プロフィールのみを確認しうる適切なプロット標識(例えば、ナンバー、カラーコーディング、またはドリルダウン機能(drill down functionalities)を用いてプロットすることによって容易に行うことができる。類似性の検出が目指すものである場合には、見込みのある候補は2変量性のミスマッチ、マッチ−分布の上縁および下縁の位置に見出すことができる。
3) 上記1)に記載のようにスコアを階層的にソートすることに加えて、ミスマッチとマッチの異なる情報内容を組み入れて重みをつけて合計すること、または当業者にはよく知られている他の方法によって、ミスマッチとマッチのスコアを組み合わせることができる。
本発明では、前述のコンピューターを用いるアルゴリズムはある程度の数の値が失われている状態でも許容することができ、それ故、特に生物学的データの比較を自動化高スループットスクリーニングアッセイで行う際に有用であることが見出された。また、極めて多数の値がない場合でも失われていない値の数に対して追加のノーマライズを行うことによって取り扱うことができる。MMM法のアプローチのもう一つの長所は参照サンプル中には含まれていない新しいクラスの発見にある：そのようなシナリオによって特徴的なミスマッチ対マッチの分布が明らかとなる。最後に、MMM法のアプローチの特別な長所は、困難な多重クラス分類作業をクラス数のかなり少ないより単純な分類作業へと減らす能力があることである。この点では、MMMアプローチと他の分類方法、特に下記のSICIアプローチとを組み合わせることが、特に効果的である。
好ましくは、評価に、代替としてまたは追加として"Select, Iteratively Classify and Integrate Approach (SICI Approach)"を含めることができる。好ましくは、このアルゴリズムが下記のステップを行うことができることである：
1. データセットの分割：
1つのデータセットは異なる起原、実験、その他に由来するデータを含んでなるものとすることができる。それらのデータ(すなわちヴァリデートされた結果)はお互いが異なっていることもありうる。評価の改善を行うために、サンプルまたは被験物の著しく異なる群から得られた結果からなる不均質なデータセットは、好ましくは、2つ以上の均質な群、例えば雄の群と雌の群、または実験動物の異なる集団の群に分割する。分割はサンプルまたは被験物の著しく異なる群のヴァリデートされた結果が共通のデータベース中に保存されている場合にのみ必要となることは理解しておくべきである。分割の必要性は、好ましくは、unsupervised(目的変数をもたない) 分析法によって検出する。unsupervised 法としては主成分分析(principal component analysis：PCA)、非直線PCA、Independent Component Analysis(ICA)、Self-organized Maps(SOM)、メトリックおよび/またはノンメトリック型の多次元スケーリング、Sammon's Mappingがある。
2. アナライトの選択
任意で行うデータセットの分割ステップの後、アナライト(例えば、メタボライトを選択するステップを行う。この目的のために、サブデータセットの各々は「有意なアナライト」(すなわち有意なヴァリデートされた結果)のみに制限する。有意なアナライトを定義するために、お互いに異なると思われるサンプル間の全てのアナライトを、統計学的検定、例えば、studentのt検定、Welch検定、Wilcoxon検定など(各々の検定でpairedまたはunpairedで)を適用することによって比較する。お互いに異なると思われるサンプルは、好ましくは、例えば、同一の臨床試験の、同一の実施施設と臨床試験の、同一の動物試験の、同一の実施施設と動物試験の、同一の測定シリーズの、処理群などの供試サンプルおよび対照サンプルであるか、または、本明細書中で説明するとおり、比較を行うその他の群である。各アナライトに対して、行った全ての群間比較検定でそのアナライトについて得られた全てのp値(通常、いくつかの群間比較が行われる)のうちの特徴的なp値(確率値)が、例えばp値の最小値、中央値、または平均値などが指定される。有意なアナライトとは、ある定められた閾値のαより低いp値を有するアナライトと定義される(ここでαは0と1との間の値であり、α=1とは全てのアナライトを選択することに相当する)。従って、αはいわゆる「偽発見率」(false discoveru rate:FDR)に対応させることができ、例えば、αが0.10であることはFDRが10%であることに対応し、αが0.05であることはFDRが5%であることに対応し、αが0.01であることはFDRが1%であることに対応する。
3. 個々のサンプルまたは関連するサンプルの1群を分類する
有意なアナライトを選択した後、該有意なアナライトを含んでいる個々のサンプルまたは関連サンプルの個々の群を分類するステップを行う。この目的のために、それらの選択した有意なアナライトは、トレーニングデータを構成している既知のクラスのメンバーである参照セットについて作成された分類モデルに基づいて、参照品と比較する。類似性の程度によって、供試サンプルを、一定の確率を有する参照品によって定義される1つのクラス(すなわち、クラス確率)に割り当てる。分類は十分に確立された分類モデルアルゴリズム、例えば、Prediction Analysis of Microarrays (PAM, 例えばTibshirani, Hastie, Narasimhan, およびChu(2002):"Diagnosis of multiple cancer types by shrunken cetroids of gene expression", Proc. Natl. Acad. Sci. 2002 99:6567-6572を参照せよ)、Linear Discriminant Analysis (LDA)、diagonal LDA、Support Vector Machines (SVM)、決定樹などによって行われる。参照とはこのような関連性では、サンプルに含まれている重要なアナライト、それはある特定のクラスへの割り当てが既知なものであるが、そのようなアナライトからなるパネルまたはプロフィールとすることができる。分類のタイプによって、当業者であれば供試サンプルの参照品に対する適切なアサインメントをどうすれば得られるかについては十分にわかっている。さらに、単一の供試サンプルの他に、複数の供試サンプルの群を、それらが同一の生物学的実体に属しているものであれば、一緒に分類することができる。1つの生物学的実体とは、一体の被験生物とすることができる。このような場合には、該被験生物から様々な時点で採取されたサンプルは、それでもなお、供試サンプルの1群として一緒に分類することができる。本明細書で用いている「関連サンプルの群」は、同一の被験生物の異なるサンプル、例えば、時間経過で調べる実験のサンプルから得られたヴァリデートされた結果の単一のセットによって示すことができ、または個々のサンプルに対応するヴァリデートされた結果の個々のセットによって示すことができる。上述の単一のサンプルまたは複数のサンプルの群の分類は、本明細書ではこれ以後「単一ケース分類」"single case classification"と呼ぶ。
4. 単一ケース分類結果の、群の結果への統合
単一ケース分類は群のレベルではあいまいなものとなりうる。供試サンプルの群、例えば、実験(処理)の反復などを行って得られたものの群の全体について(すなわち、関連性のない供試サンプルについても)、あいまいでない分類結果を作り出すために、単一ケース分類結果は統合しなければならない。このことは、好ましくは、特別な統合ルールをその単一ケース分類に適用することによって行われる。特別な統合ルールは供試サンプルの群の全体を、単一ケース分類の多数のクラスに基づいて分類することができ(多数決)、また、もしも外れたケースがある程度あるものと考えられるならば、供試サンプルの群の全体を最尤度またはトリム(trimmed)最尤度に従って分類することができる。
5. サブデータセットの結果の統合
さらに好ましいステップにおいては、種々の均質な群についての分類結果を、均質でない母集団の群について一般化した結果があるとすればそれを得るために、さらに統合することができる。例えば、雄の均質な群についての結果と雌の均質な群についての結果は、分析した集団の全被験生物からなる母集団の不均質な群についての結果を得るために統合することができる。このことは、生物学的/生化学的解釈のレベル、例えばシステム生物学技法を適用して、あるいはまたvotingsまたは尤度(likelihoods)を合計することによって数学的に行うことができ、おそらく、信頼性の程度を特徴付けるかまたはサブデータセットの結果の関連性を特徴付ける重みを組み込んで行う。
6. 分類プロフィールの作成
さらに、好ましくは、分類のプロフィールを作成する任意のステップを行う。好ましくは、そのステップは、分類のための群の供試サンプルが限られた数しかない場合、および単一のケースを割り当てうるクラスの数が多い場合、それは少なくとも3クラス、好ましくは10クラスを超え、より好ましくは100クラスを超えるであるが、それらの場合に適用される。分類プロフィールは、好ましくは、反復して再分類を行う下記の方法によっておられる：
・第1に参照(例えばトレーニングデータ)の全体を用いて分類を行うもの(classifier)を作り、それをある特定の群(処理群)の第1のクラスの予測に適用する。
・次いで、その予測されたクラスの全てのケースを該参照から除き、残りの参照についてもう一つの分類を行うものを作り、それを第2のクラス予測に適用する。
・次いで、第2の予測クラスの全てのケースをさらに該参照から除き、もう一つ別の分類するものをさらに次のクラス予測のために作る、など。
・この方法は全てのクラスが参照から除かれるまで、または分類プロフィールが十分な長さとなるまで続けられる。
ある特定の(処理)群の全てのクラス予測は、「分類プロフィール」を形作る：それは順序づけられたクラス予測のリストであり、それには例えば対数最尤度などの対応する段階的なクラス確率、および例えば対数最尤度から2番目の対数最尤度までの距離などのクラス割り当ての特殊性が付されている。好ましくは、分類プロフィールの長さは参照についてのクラス数に等しいが、より短いプロフィールも、適用分野によっては、または作成されたプロフィールの構造によっては、十分なものとなりうる。
上述の評価技法はメタボロミクスのプロファイリング用として開発したものではあるが、他の多次元データ、それは例えばトランスクリプトームやプロテオームのプロファイリングのために行われるマイクロアレイ、質量分析、またはNMR分析から得ることのできるものであるが、そのようなデータのプロファイリングにも同じように適用しうることは理解されるべきである。
さらに、分析には、好ましくは、ある特定のサンプルについて、生の結果またはヴァリデートされた生の結果に基づいて特定のプロフィール(すなわち、フィンガープリント)を作ることも含まれる。そのような特定のプロフィールは、そのサンプル全体の少なくとも1つの特性に由来する生の結果に基づいたものである。あるサンプルが異なる化合物を複数含んでいる場合には、そのプロフィールは全ての化合物についての特性の全てから由来する生の結果を必ずしも含んでいない。好ましくは、最も情報量の多い生の結果をその特定のプロフィール中に含めることを想定している。さらに、その生の結果はプロセスすることができ、情報を持つようにプロセスされた生の結果がプロフィール中に含まれる。本発明に従って特定のプロフィールを作るための好ましい技術を下記に詳細に開示する。
本発明の方法は、原理的には、種々のタイプの供試サンプルの分析に適しており、そのようなサンプルとしては、生物学的、人工的、および環境のサンプルが挙げられる。
上述のとおり、本発明の方法は、より好ましくは、生物体のメタボロームをその生物体由来の生物学的サンプルに基づいて分析することに適用される。従って、本発明の方法は、好ましい1実施形態において、生物体のメタボロームを、原理的には前述の、および下記により詳細に研究するステップを用いてその生物体から得られたサンプルに基づいて分析する方法を含んでいる。
第1のステップにおいては、血漿や尿などの生物学的材料由来のサンプルが提供される。そのサンプルは、この方法の全ステップの間、少なくとも1種の参照サンプルと挙動をともにする。血漿の場合には、参照サンプルは以前に分析したサンプルのアリコートとすることができる、すなわち、技術的な変動性を評価するために該サンプルの生の結果が既に存在していることが重要である。あるいはまた、同一の参照サンプルの少なくとも2つのアリコートを供試サンプルとともに分析することができる。その場合には、技術的な変動性は、同一の参照サンプルの少なくとも2つのアリコートの少なくとも2回の分析に基づいて評価することができる。それらのサンプルは、好ましくは、抽出および/または極性のメタボライトと非極性のメタボライトを含んでいる極性画分と非極性画分に分ける分画を含む前処理にかける。好ましくは、それらのサンプルは全てのステップにおいて同一の順序で分析にかけられる。
第2のステップでは、それらの画分に存在しているメタボライトを測定する。該測定はメタボロームの組成の定性的および定量的測定を含んでなる。メタボローム(すなわち、メタボライトの数)の複雑性を考慮して、メタボライトはまず最初に、好ましくはLCおよび/またはGCでクロマトグラフィーで分離する。任意で、LCおよび/またはGCにかける前にメタボライトの誘導体化を要することもある。測定にはさらに質量分析が含まれる。これらの技法によって各サンプルについてのプロセスされた生データ(すなわち生の結果)、すなわち、種々のピークを含んでいる3次元マススペクトルが得られる。
この方法の分析ステップにおいては、ピークはモニターしておいたプロセスパラメータに基づいて、および例えばピークの形状を調べる適切なピークヴァリデーションアルゴリズムによってヴァリデートされる。その後のステップでは、そのヴァリデートされたピークを、実際のおよび/または以前の参照サンプルの生の結果でのノーマライゼイションを含め、評価する。本発明の方法では、メタボロームの各メタボライトを測定と分析することは必要でない。より正確に言えば、メタボロームの分析は、そのメタボロームに特徴的であることが見出されたメタボライト、あらかじめ選択したメタボライトのセット、または特定のメタボリックプロフィールを有するメタボライトの、一部の存在または不在を調べること、またはその一部の量の測定によって行うことができる。特徴的なメタボライトまたはあらかじめ選択したメタボライトは、既知のメタボライトならびにいわゆる未知であることが既知なものを含んでいる。後者は、測定結果において単にシグナルの存在のみが知られているようなメタボライト、例えば、ある定まったマススペクトルを有しある定まった保持時間の位置に認められるピークなどである。しかし、該未知であることが既知なものの化学的性質(すなわち、元素組成および構造)は、正確には知られていない。本明細書では、メタボリックプロフィールとは、上述の特定のプロフィールであってその基礎をなす化合物がそのメタボロームのメタボライトであるものに関する。本明細書でメタボロームの分析とは、好ましくは、例えば、種々の処理にかけられた生物体から得たメタボライト、メタボライトの量、または種々のサンプルのメタボリックプロフィールの比較を含んでいる。例えば、1つのサンプルまたはサンプルの1群は、ある化合物を投与された1つの生物体または生物体の群に由来するものとすることができる。そのような化合物は毒性のある化合物かまたは薬剤となる可能性のあるものである。第2のサンプルまたはサンプルの群は、対照として用いる、例えば未処理か、またはプラシーボで処理された、1つの生物体または生物体の群に由来するものである。サンプルの分析から得られたヴァリデートされた結果の比較は、上述のとおり行う。例えば、サンプルを評価するためにPCAを用いることができる。それによって、サンプル間の類似性の程度が、従ってその生物体のメタボロームを測定することができる。
本発明の方法は、好ましくは、自動化によってアシストされる。例えば、抽出、分画、クロマトグラフィー、および/または測定の際のサンプルプロセシングはロボットを用いた自動化を行うことができる。ヴァリデーションおよび評価を含む生の結果の分析は、好ましくは、適切なコンピュータープログラムおよびデータベースによってアシストされる。本発明の方法を行うための好ましいシステムは下記に詳述する。本明細書で前述の自動化では、本発明の方法を高スループットのアプローチで用いることができる。
都合の良いことに、本発明では、分析に上述の参照サンプルを加えることは、本発明の方法によって得られた結果の質を著しく改善することが示されている。本明細書に記載の参照サンプルの使用によって、シークエンス内部のノーマライゼーションとヴァリデーション が可能となる。それによって、技術的および/または生物学的な変動性の影響が著しく減少する。従って、本発明によって、化学的サンプルの分析、および特に複雑な生物学的サンプルの分析の信頼性がより高くなる。従って、メタボロミクスは、毒性学、薬理学、および環境制御などの高品質の分析を必要とする分野に高い信頼性で適用することができる。そうではあるが、古典的な化学分析(例えば化合物合成における、化合物を探索する分析や品質管理を含む)も、本発明の方法の有利性から大きな利益を得ることとなろう。
具体的には、本発明はまた、少なくとも1つの供試サンプルを分析する方法に関し、その方法では該供試サンプルは少なくとも1種の化合物を含んでなり、該方法は次のステップを含んでなる：
a) 少なくとも1種の化合物を含んでなる少なくとも1つの供試サンプルを提供し；
b) 該供試サンプル中の該少なくとも1種の化合物をクロマトグラフィーを連結した質量分析を用いて測定し、それによって一次生データが生成され；
c) ステップb)で得られた一次生データから次の方法で生の結果を生成する：(i)一次生データのデコンボリューションおよびそのデコンボリューションされた一次生データの、参照スペクトルおよび参照リテンションインデックスを用いた各化合物へのアロケーション、ならびに(ii)あらかじめ定めたイオン質量と時間窓を用いてシグナルの強度と保持時間を化合物に割り当て、
d) ステップc)で得られた生の結果を分析するが、該分析は、ヴァリデートされた結果がそれによって生成されたルールに基づいて生の結果を確認または無効とすることのできるヴァリデーションツールを用いた該生の結果のヴァリデーションを含んでおり、
該少なくとも1つの供試サンプルの分析は少なくとも1つの参照サンプルの分析を伴って行われるものであり；
それらのステップにおいて供試サンプルおよび参照サンプルはこの方法の各ステップにおいて全く同一の順序で分析され；
それらのステップにおいてこの方法は自動化によってアシストされる。
本明細書の「クロマトグラフィーを連結させた質量分析」という用語は、質量分析を行う前に調べようとするサンプル中に含まれている化合物をクロマトグラフィーで分離することを組み合わせた質量分析に関する。本明細書の別のところで述べるとおり、クロマトグラフィーは、好ましくは、液体クロマトグラフィーおよび/またはガスクロマトグラフィーとすることができる。
「生の結果を生成させる」という用語は一次生データを生の結果へとプロセスすることに関する。一次生データのプロセシングは、上述のデコンボリューション技法およびアロケーション技法によって行うことができる。それらの技法をどのように行うか、および適切な参照スペクトルをどのように入手するかは当業界ではよく知られている。マススペクトルは生の結果をもたらすが、それは少なくとも3つの次元での値によって特徴付けることができ、それらの次元とはすなわち、クロマトグラフィーによる分離の結果としての保持時間の次元、サンプル中に含まれる化合物に依存する質量関連の次元(例えば、m/z)、およびそれらの化合物の存在もしくは不在、または量に依存する強度関連の次元である。
「ヴァリデーションツール」という用語は、あるサンプルから得られた生の結果を確認することのできる、または無効とすることのできる手段である。無効とされた生の結果はそれ以降の分析、すなわちそれ以後の評価ステップにはかけられないこととなる。そのようにするために、それらの生の結果は削除されるかまたは別の切り離されたデータベースで保管される。ヴァリデーションツールによって確認された生の結果はさらにその先の評価を行うために保持され、それらの化合物を表現するヴァリデートされた結果のセットを構成し、高い信頼性で分析される。ヴァリデーションツールは、マススペクトルから従来のアルゴリズム、例えばAMDIS(http://chemdata.nist.gov/mass-spc/amdis/)またはGC/MS Chem Station(Aglient Technologies)などによって生成した生の結果(ピーク)を無効とするかまたは確認するアルゴリズムを含む。ヴァリデーションツールは各生の結果をルールのセットを用いて調べる。そのルールは機能しうる形でヴァリデーションツール中に実施される。そのヴァリデーションツールは、好ましくは、コンピューターで行われるアルゴリズム、および上述のルールが機能しうる形でお互いに連結されたものを含んでいるルールデータベースを含んでなる。本発明に従って適用されるルールは、下記のパラメーターに基づいて生の結果をヴァリデートまたは無効とする：固有の保持時間；固有のリテンションインデックス；全ての標準に利用できるヴァリデートされた生の結果、そのような標準としてはリテンションインデックスを定めるもの、およびその後のステップにおいてノーマライゼーション用に用いることのできるものが含まれる。上述のパラメーターの他に、より好ましくは、次のパラメーターを考慮することができる：用いられる従来のアルゴリズムの全てのための固有の保持時間値(例えば、AMIDSおよびChemStationで生成された生の結果のための固有の保持時間値)；用いられる全ての従来のアルゴリズムのための固有のリテンションインデックス値と計算値(例えば、AMIDSおよびChemStation生の結果から得られた、サンプルに含まれているリテンションインデックス参照標準品に基づいた、固有の計算された(すなわち外挿された)
リテンションインデックス)；化合物の生の結果への固有のアロケーション；生成した生の結果が反映している化合物の溶出の固有の順番。さらに、ヴァリデーションツールは、好ましくは、さらに別のパラメーターを考慮することができ、そのようなパラメーターとしては、固有の装置およびサンプルのパラメーター、またはプロセス全体の固有の機能を示しているパラメーターが挙げられるが、それらについての詳細は本明細書の別のところで述べる。
分析のステップが、当然のことながら、ヴァリデートされた結果の評価を、好ましくは、上記で特定したアルゴリズムによって、および特に"MMM"アプローチまたは"SICI"アプローチを適用することによって、包含しうることは理解されるべきである。
好ましくは、ヴァリデーションツールによって適用されるルールは下記のルールを含んでいる：
(a) ステップc)中の手順(i)および(ii)によって得られる生の結果の各々について、ある化合物の生の結果について得られた保持時間(RT)があらかじめ定めておいた限度値以内であるか否かを定めること、もしもその保持時間が限度外である場合にはその生の結果は無効となる；
(b) ステップc)中の手順(i)および(ii)によって得られる生の結果の各々について、ある化合物の該生の結果のマススペクトルのマッチの質があらかじめ定めておいた参照の結果と比較して、あらかじめ定めた限度値を超えるか否かを定めること、もしもそのマッチの質が限度値以下である場合にはその生の結果は無効となる；
(c) ステップc)中の手順(i)および(ii)によって得られる生の結果の各々について、ある化合物の生の結果について得られたリテンションインデックス(RI)があらかじめ定めておいた限度値以内であるか否かを定めること、もしもそのリテンションインデックスが限度外である場合にはその生の結果は無効となる；
(d) ステップc)中の手順(i)および(ii)によって得られる生の結果の各々について、ある化合物の生の結果が、ノーマライゼーションに用いられることとなる化合物のヴァリデートされた生の結果にアロケートされるか否かを定めること、もしもそのノーマライゼーションに用いられる化合物の生の結果が無効であるならば、そこにアロケートされた生の結果も無効となる。
上記のルール(b)に用いられている「マススペクトルのマッチの質」とは、分析しようとするマススペクトルと参照のマススペクトルの間の類似性の程度を意味する。該類似性の程度はあらかじめ定めた閾値を超えるものでなければならず、そうでない場合には、その結果は無効となる。好ましくは、同一性の程度が少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%である。
より好ましくは、そのルールにはさらに、次のものからなる群から選択された少なくとも1つのルール、最も好ましくは、全てのルールを含んでなる：
(a) 手順(i)で得られた、ある化合物の生の結果について与えられた保持時間(RT1)と、手順(ii)で得られた、同一の生の結果について与えられた保持時間(RT2)が、同じではないことを定め、その生の結果を無効とする；
(b) 手順(i)で得られた、ある化合物の生の結果について与えられたリテンションインデックス(RI1)と、手順(ii)で得られた、同一の生の結果について与えられたリテンションインデックス(RI2)が、同じではないことを定め、その生の結果を無効とする；
(c) ステップd）において、ある化合物へのアロケートにより2つ以上の生の結果が得られた場合には、ルールデータベースに含まれているその他のルールを適用した後に、各生の結果のデータポイントを結んで作成した曲線下面積で最も大きな値を有する生の結果を用いる；
(d) ステップc)の手順(i)および(ii)で得られた生の結果の各々について、リニアモデリング用のリテンションインデックススタンダードに基づいて、生の結果のリテンションインデックスがあらかじめ定めた限界値以内であるか否かを定め、もし外挿したリテンションインデックスの値が限界値を外れていた場合には、その生の結果を無効とする；
(e) ステップc)の手順(i)および(ii)で得られた生の結果の各々について、ある化合物の生の結果に隣接するような、あらかじめ定めた保持時間またはリテンションインデックスの範囲内にありあらかじめ定めた溶出の順であるあらかじめ定めた有効な生の結果が存在するか否かを定め、もしそのような有効な生の結果が隣接していないならば、その生の結果を無効とする；
(f) ステップc)の手順(ii)で得られた生の結果の各々について、生の結果のデータポイントによって作成した曲線下面積が負の値でないかを定め、それによって負の値を有する生の結果を無効とする。
ルール(d)で用いている「リニアモデリング」という用語は、リテンションインデックススタンダードに基づき、あらかじめ定義された、好ましくは、リニアなリテンションインデックスの関数が計算されることを意味する。この関数は、分析しようとする生の結果の外挿されたリテンションインデックスについての限界値を定めるための基礎となる。
ルール(f)においては、生の結果の負の値は不適切な統合によって生ずることを理解すべきである。
都合の良いことに、本発明の上述の方法によって、効果的で信頼性の高い質量分析データの分析が可能であり、さらに高スループットのスクリーニングに非常に適している。具体的には、ヴァリデーションツールの使用により、あるサンプルの情報(すなわち生の結果)の最高値をその後の評価目的に使用することができる。ヴァリデーションのための従来の技法は、通常はあるサンプルから得られた生の結果のセット全体を無効とすることをねらっている。その結果、あるサンプルから得た情報の全体−それには原理的におそらく有用である情報が含まれるが−そのような全体は通常は失われている。他の技法はあいまいな生の結果を同定することをねらっており、そのような結果は後に研究者によって手作業で調べる必要がある。それらの技法は自動化に非常に適しているとは言えず、従って、高スループットのスクリーニングに適していないことは、理解されるべきである。本発明の上述の方法のおかげで、マススペクトルを高い信頼性で調べることができ、それによって、あいまいな生の結果を自動的に無効とし、一方情報を含んだ生の結果を確認しその後の評価のために維持しておくことがヴァリデーションツールによってなされる。
上述の方法の好ましい1実施形態においては、該分析にはさらに、ヴァリデートされた結果に基づいて供試サンプルの具体的なプロフィールを作成することを含んでいる。
さらに、本発明は、ステップd)での分析が、ヴァリデートされた結果ではなく生の結果に基づいて特異的なプロフィールを作成することをも含むことを除いては上述の方法の特徴を有する方法にも関する。そのような方法には上述のヴァリデーションツールは必要でないことは理解されるべきである。
そのような方法は、都合の良いことに、2つのサンプルの精度はより低いものの迅速な比較が可能である。そのような比較は、2つのサンプルについて個々の差を見出すよりもむしろお互いに異なるか否かを検出することをねらっている。
本発明の上述の方法の全てのさらに好ましい実施形態は、下記のとおりである。
本発明の方法の好ましい1実施形態においては、該少なくとも1つの参照サンプルは次のものからなる群から選択されたものである：
(a) 少なくとも1つの供試サンプルの一部分を含んでいる参照サンプル
(b) 定義された参照スタンダードを複数含んでいる参照サンプル
(c) 参照サンプル(a)の一部分および参照サンプル(b)の一部分を含んでいる参照サンプル。
上述のとおり、本発明の方法で用いられる参照サンプルは少なくとも1種の化合物および、好ましくは、複数の異なる化合物を含んでいる。従って、本発明の方法の好ましい1実施形態においては、供試サンプルの一部分は上述のとおり参照サンプルとして用いることができる。好ましくは、そのような参照サンプルは技術的な変動性、または技術的変動性と生物学的変動性のための参照品となり、より好ましくは、少なくとも技術的変動性のための参照品となる。より好ましくは、上述の参照サンプルの後者のものは一連の分析において分析されることとなる各供試サンプルの一部分を含んでなるもの、すなわち、分析されることとなる供試サンプルの少なくとも1つをプールしたものである。
さらに、その参照サンプルは複数の定義された参照スタンダードを含んだものとすることができる。そのような参照サンプルは、本質的に該定義された参照スタンダードからなっているか、または該参照スタンダードに加えてさらに別の化合物を含んだもののいずれかとすることができる。前述のさらに別の化合物を含んだ参照サンプルは、好ましくは、上述のとおり、少なくとも1つの供試サンプルの一部分を含んでいる参照サンプル、または一連の分析において分析されることとなる供試サンプルをプールしたものであってそれに複数の定義された参照スタンダードが混合されたものとすることができる。定義された参照スタンダードは既知の化学的性質を有する化合物でそれについての回収率が本発明の方法の各ステップについて、または各ステップの全体について既知である化合物である。さらに、参照スタンダードは、誘導体化の有効性が既知の化合物、または他の処理についての有効率が既知の化合物を含んだものとすることができる。そのような参照スタンダードは、本発明の方法の間の回収率を計算するために、または本発明の方法の間の有効率(例えば、誘導体化の有効率)を計算するために必要である。さらに参照スタンダードまたは参照サンプルは、連続的操作内でのシステムの適合性および感度の測定に用いることができる。好ましくは、参照スタンダードは、前に述べたメタボライトの種々の化学的クラスの少なくとも1種の特徴的な化合物を含んでなるものを用いる。それらの参照スタンダードは、通常は供試サンプル中に存在するか、または通常は存在しないがある処理を行った後には供試サンプル中に存在しているような化合物を含んでなるものとすることができる。また、参照スタンダードは、同一の化合物が、ある参照サンプル、それはこの化合物を含んでいる場合も含んでいない場合もあるが、その参照サンプル中にあるか、または供試サンプル中にあるか、または供試サンプル中にこの化合物がないことを証明するためにも用いられる。あるいはまた、該メタボライトのアイソトープで標識された誘導体を用いることができる。アイソトープで標識された参照スタンダードの適用については当業者にはよく知られている。従って、本発明の方法中に、複数の定義された参照スタンダードを含んでいる少なくとも1つの参照サンプル、および/または、少なくとも1つの供試サンプルの一部分と、複数の定義された参照スタンダードを含んでいる参照サンプルの一部分とを含んでなる少なくとも1つの参照サンプルを含めることが好ましいものと想定している。
最も好ましくは、回収率の計算に用いることのできる下記のスタンダードは、次のものからなる群から選択された、極性相のためのものである：アルギニン、アラニン、ロイシン、グリシン、セリン、プロリン、グルタミン、システイン、トリプトファン、リンゴ酸、クエン酸、ピルビン酸、ホモゲンチジン酸、エリトリトール、グリセルアルデヒド、エリトロース、リボース、キシロース、アラビノース、果糖、マンノース、ブドウ糖、ガラクトース、マルトース、イソマルトース、ショ糖、マルトトリオース、グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、グルコース-1-リン酸、グリセリン-3-リン酸、プトレシン、およびスペルミジン。非極性相には、最も好ましいスタンダードは次のものからなる群から選択される：ステアリン酸メチルエステル、リノール酸メチルエステル、トランス-10, シス-10-オクタデカジエン酸メチルエステル、リノレン酸メチルエステル、リシノール酸メチルエステル、シス-5,8,11,14,17-エイコサペンタエン酸メチルエステル、シス-4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸メチルエステル、セロチン酸メチルエステル、モンタン酸メチルエステル、メリシン酸メチルエステル、パルミチン酸、トリオレイン、オクタデカノール、α-トコフェロール、フィトール、β-シトステロール、コレステロール、リポ酸、トランス-9-ヘキサデセン酸メチルエステル、2-ヒドロキシ-ヘキサデカノン酸、および3-ヒドロキシ-ヘキサデカノン酸。
さらに、本発明の好ましい1実施形態においては、参照サンプルは、例えば本発明の方法の各ステップについてまたは方法全体のためのブランクなどを含めることができる。本発明の方法で用いられている溶媒およびその他の作用物の純度を証明するために、適切なブランクを含ませることができる。さらに保持時間ロッキング(RTL)のスタンダードを、測定がクロマトグラフィーを含んでいる場合には、その中に含めることができる。RTLはクロマトグラフィーの操作者が、GCシステム、カラム長、および検出器にかかわらず、カラムが同じ定常状態、公称相比、および直径を有している限りはアナライトの保持時間を再現させることのできる方法である。RTLはGCカラムの上部圧力を、ある与えられたアナライト、いわゆるRTSスタンダードで、これも内部標準とすることができるが、そのアナライトが望ましい保持時間となるまで調整することによって行われる。これを行うと、クロマトグラム中の他の全てのアナライトが最も正確な保持時間を示すこととなる。保持時間ロッキングには、極性または非極性スタンダードを含んでいる参照サンプルをクロマトグラフィーにアプライする。好ましくは、その参照サンプルと、より好ましくは、各サンプルはそれぞれのRTLスタンダードを含有し、RTLはRTLスタンダード含有のサンプルの各インジェクションの後に行われる。適切なスタンダードは当業界ではよく知られている。最も好ましくは、メチルノナデカノエートおよびリビトール-5-TMSが非極性および極性画分のためのRTLスタンダードとしてそれぞれ用いられている。
さらに、本発明の好ましい1実施形態においては、内部標準が各サンプルに添加される。内部標準の使用は当業界ではよく知られており、特に内部標準は、プロセシングの間のサンプルのロス、または抽出および誘導体化の効率が様々であること、および用いる装置の感度が様々であることを補正(計算)するために用いられる。内部標準はそれぞれのアナライトと化学的に見てできる限り類似したものとすべきであり(すなわち、サンプル中に存在する化合物のうちの少なくとも1種)、好ましくは、アイソトープで標識したアナライトそれ自体を用い、その内部標準はアナライトと類似の量でサンプル中に含まれている。より多くのアナライト(すなわち化合物)が測定され、アナライトが化学的により異なるものであれば、より適切な内部標準を用いるべきである。
さらに、本発明の方法の好ましい1実施形態においては、リテンションインデックススタンダード(RI-スタンダード)が各サンプルに添加される。RI-スタンダードの使用は当業界ではよく知られており、特にKovats-RI-standardsおよびそれのKovats-RI-calculationへの使用が報告されている。それらのスタンダードは種々の数の炭素原子を有する、同族の一連の化合物からなり、例えば、n-アルカンまたは直鎖脂肪酸、好ましくは、炭素原子数が奇数であるものまたはその誘導体(それらはメタボライトとしては興味のないものであるが)、最も好ましいのは、炭素原子数が7から31の間の奇数である直鎖脂肪酸のトリメチルシリルエステルである。文献からの既知の方法を用いて、RI-スタンダードの保持時間内のアナライトの保持時間の直線補間によって、リテンションインデックス(RI)が求められ、そのインデックスは保持時間そのものよりもアナライトについてより正確でより代表的なものであり、同じ固定相、公称相比、および直径のカラムを用いる限りは、GCシステム、カラム長、または検出器とは無関係である。
本発明の方法のさらに好ましい1実施形態においては、該供試サンプルおよび該参照サンプルは全く同一の順序で分析される。最も好ましくは、その順序がサンプルの分析前に少なくとも1つの供試サンプルおよび少なくとも1つの参照サンプルの該順序内でのランダムなポジショニングによって確立されていることである。
上述のとおり、本発明では、本発明の方法によって分析されることとなる供試サンプルと参照サンプルを全く同一の順序で分析しなければならないことが見出されている。さらに、好ましい1実施形態においては、供試サンプルと参照サンプルは本発明の方法の各ステップにおいて全く同一の順序でプロセスされるがその順序は、最も好ましくはランダムポジショニングによって決定されたものである。そうではあるが、その順序もあらかじめ選択された順序とすることができることは強調されるべきである。従って、例えば2つの供試サンプル(T1およびT2)、および2つの参照サンプル(R1およびR2)についてのプロセスの順序T1-R2-T2-R1は、ランダムポジショニングまたはあらかじめ選択しておいたポジショニングによって得ることができる。それらのサンプルは本発明の方法のステップの各々において該順序でプロセスされる。言い替えれば、全ての種類の前処理を含め、それらのサンプルの提供はT1-R2-T2-R1の順で行われ、少なくとも1種の化合物の測定はT1-R2-T2-R1の順で、それらのサンプルについて行われることとなる。本発明では、本発明の方法の上述のステップを同一の順序で行っていることは、さらにそのステップによって生み出される結果の質を高めることとなることが見出されている。具体的には、技術的変動性は、該方策によってさらに減少する。
本発明の方法の別の好ましい1実施形態においては、ステップc)の該分析は少なくとも1つの供試サンプルの生の結果の、参照サンプルについて得られた生の結果と関連させてのノーマライゼーションを含んでなる。
上記で述べたノーマライゼーションとは少なくとも1つの供試サンプルのヴァリデートされた結果を、少なくとも1つの参照サンプルについて実際の分析で得られたヴァリデートされた結果と関連させてノーマライズされることを意味する。さらに、ノーマライゼーションは、本発明の方法を行うために用いられる機器の技術的変動性による影響を最小限に抑えるために役に立つ。従って、参照サンプルについて得られた結果は、同一の参照サンプルについて以前に得られた結果と関連させて考慮される。その参照サンプルについて実際に得られた結果と以前に得られた結果は、好ましくは、技術的変動性を評価するために、お互いに比較される。少なくとも1つのサンプルについて得られる生の結果のノーマライゼーションは、該アセスメントに基づいて行われる。例えば、該アセスメントに基づいて、複数の供試サンプルについての一連の分析について標準偏差を計算することができる。ついで、さらに、少なくとも1つの供試サンプルについて得られた生の結果は、好ましくは参照サンプルの全てまたはサブセットのいずれかを用いてノーマライズされる。好ましくは生の結果のノーマライゼーションは、技術的変動性を調整するために、シークエンスごとに、および化合物ごとに行われる。複数のシークエンスからの複数の供試サンプルについて、および複数の化合物について、生の結果はシークエンスごとにおよび化合物ごとに対応する参照サンプル(またはそのサブセット)に対してノーマライズされる。このノーマライゼーションはあるサンプルの生の結果を、対応する参照集団(またはその集団からのサブセット)を説明している統計学的パラメーター(例えば、標準偏差、平均、中央値、またはパーセンタイル)に関連づけることによって行われる。そのことによって、分析の結果得られた結果に及ぼす技術的変動性の影響は著しく低減する。
本発明の方法のさらに好ましい1実施形態においては、該方法はさらに、該方法のためのプロセスパラメーターのモニタリングを含んでなる。
本発明の方法でモニターされることとなるプロセスパラメーターは、技術的な不整合性または障害を示すパラメーターである。例えば、前処理の有効率またはクロマトグラフィーの回収率をモニターすることができる。さらに、本発明の方法を行うために用いられる装置の技術操作のパラメーター(例えば、電流の変動、その他)をモニターすることを想定している。例えば、全ての電子装置の機能を当業界ではよく知られた技法でモニターすることができる。電子装置としては、コンピューター、クロマトグラフィー装置、ロボット、および質量分析装置などの化合物分析用の装置が含まれる。
好ましくは、測定前に下記のプロセスパラメーターがモニターされる：タイムスケジュールで定めたメンテナンスとクリーニング手順の管理、例えば、質量のキャリブレーション、スプレー針の交換/管理、そのシステムに行われたインジェクションの総数、インラインフィルターの交換、ポンプオイルの管理および/または交換、分析的分離カラムの交換、プレカラムの交換、質量分析計の内表面のクリーニング、真空試験、圧試験、ならびに対照の溶液を用いた性能試験など。あるシークエンスの分析中および/または分析後に、好ましくは、次のプロセスパラメーターをモニターする：用いた装置の識別名、装置の動作のタイムスタンプ(プロセス内での待ち時間)、サンプル-装置およびサンプル-サンプルの関連性があればその全て、(シークエンス)プロセス観察(急激な動きまたはその他の通常は起こらない観察結果)、1つのシークエンスの測定前後の質量分析計の真の値、カラムの性能(性能が悪いことは、脂質または極性物質の分析で特定のアナライトの保持時間のシフトが限界値を超えることまたはピーク形態のパラメーターを定期的にチェックすることによってわかる)、シークエンス測定およびデータフローの完全性(プロセシング、
記録の保存、データベース内のデータの利用可能性、LIMSでのトラッキング)、カラムの染み出し、汚染、マトリックスのロス、誘導体化の問題についてチェックする生データの肉眼的検査。好ましくは、該パラメーターとそれに関する記述は、実験室情報管理システム(LIMS)のようなデータベース中に集められるが、そのLIMSについては本明細書の他のところで述べる。
好ましくは、モニターされたプロセスパラメーターはデータベース中に保管される。そのモニターされたプロセスパラメーターは本発明の方法の分析ステップの間に、生の結果のヴァリデーション用に利用することができることを想定している。従って、そのモニターされたプロセスパラメーターを含んでいるデータベースは、好ましくは、本発明の方法を行うために用いられる分析機器に、機能しうる形で連結されている。
本発明の方法のより好ましい1実施形態においては、ステップd)における該分析は、モニターされたプロセスパラメーターに基づいた生の結果の確認または無効判定を含んでなる。
生の結果を無効と判定することには、ある供試サンプルから得られた生の結果の全体を無効とすること、または生の結果の特定のデータポイントを無効とすることが包含される。例えば、ステップc)での分析に質量分析が用いられる場合には、マススペクトルの全体が無効とされるか、または特定のピークが無効とされる。後者のようなことは、クロマトグラフィーの間に不整合が生じた場合に起こる可能性がある。そのような場合には、技術的な不整合が起こったときの時間の範囲に対応する保持時間のある一定の範囲内の3次元マススペクトルのピークが無効とされる。さらに、あるサンプル全体の生の結果は、次のような特定の条件下では無効とされることとなる：(i) 保持時間のスタンダードが測定できないかまたは無効とされる；(ii) モニターされたプロセスパラメーターが整合性を欠く；(iii) サンプル(例えばもともとの重量、ソース、その他)に関連する情報、好ましくはもともとの重量であるが、それが入手しえない。それらの無効とされた生の結果は削除することができ、又は好ましくは別の切り離されたデータベース中に保管することができる。
本発明の方法の別の好ましい1実施形態においては、ステップd)における該分析は、生の結果のピーク分析を含んでなる。最も好ましくは、該ピーク分析はコンピューターによって行われる。
既に前述のとおり、本発明の方法の好ましい1実施形態においては、生の結果は、3次元のフォーマットにアレンジすることのできるデータポイントであり、その結果最大値と最小値がもたらされる。最大値(ピークとも呼ばれる)は、生の結果のピークを、仮定に基づいて最適化したピークの形状、または参照スタンダード化合物のピークの形状と比較するピーク分析ツールによって調べることができる。仮定に基づいて最適化したピークは、例えば、ガウス分布の形状をしたものとすることができる。生の結果が上述の質量分析で生み出されたものである場合には、この結果得られたピークは、好ましくは、次のように調べられる：ピーク分析によって調べられたピークをベースとしたパラメーターは、ピークの溶出順、ピーク形状のパラメーター、例えばシグナル対ノイズ比、ピークの対称性、ピークのショルダー、統合ベースラインの傾斜、半分の高さでのピーク幅、隣接するピークからの分離(例えば、ベースライン分離)、絶対ピーク強度、内部標準に対する相対強度、絶対保持時間、内部標準もしくは別の物質に対する相対保持時間、変動係数および保持時間のトレンド、相対保持時間、ピーク高および/もしくはピーク面積。さらに、内部標準とRIスタンダードの全てがソフトウエアによって見出されることを調べる。プロセスに既知の問題(融解、交差汚染、誘導体化効率)がある可能性を示す、特別のピークも調べる。試薬を含まないサンプルを、プロセスの間の汚染の有無を評価するために調べる。さらに、RIスタンダード、内部標準、および既知のおよび未知であることが既知のアナライトが個々のRT マッチの質および/またはMS マッチの質の判断基準を満足するか否かを調べる。さらに、同一のアナライトが、ピーク発見ソフトウエアおよびデコンボリューションソフトウエアで同一のRIおよびRTで、良く一致して見出されるかクロスチェックする。ある種の化合物(アナライト)では上述の判断基準のサブセットのみしか調べることができない。管理と記録は部分的に手動で、または自動で行われ、いくつかの通常用いられるパラメーターについてはそのレベルを超えた結果は無効であるとされる明確なレベルがあり、その他のものでは手動で評価され通常の値と明確に異なる値が見られた場合には追跡される。正常値からの偏差の程度によっては、そのシークエンス、サンプル、またはピークの拒否という結果となりうることがあり、装置が操作から外されるか(調整、カラムの性能、その他によって修理や部品交換が行われる)、または後に通知がなされることを知らせる注意書きがなされる。必要に応じて(評価においてアナライトまたはサンプルが目立つ)、ピークの注釈およびサンプルの質の手動による最チェックを反復して行うことができる。
ピーク分析は、当業界ではよく知られた、アルゴリズムを含んでいるピーク分析ツールによって行うことができる。適切なピーク分析ツールは、例えば、ChemStation(Aglient Technologies, USA)、Analyst(MDS SCIEX, Canada)、またはAMDIS(NIST, USA)である。ピーク分析に用いる適切なアルゴリズムは、好ましくは、ノイズ分析、成分認知、スペクトルデコンボリューション、およびピーク同定ステップを包含している。ChemStation、Analyst、およびAMIDSの他に、適切なアルゴリズムとしては、とりわけ、Biller, 1974, A novel approach for the utilization of gas chromatograph-mass spectrometer data, Anal. Lett. 7: 515-528, Colbi, 1992, Spectral deconvolution for overlapping GC/MS components, J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 3: 558-562, Herron, 1996, Software-based mass spectral enhancement to remove interfaces from spectra of unknowns 7: 598-604, Pool, 1997, Automated extraction of biomass spectra from gas-chromatographic/mass spectrometric data, 32: 438-443, Tromey, 1976, Extraction of mass spectra free of background and neighbouring component contributions from gas chromatography/mass spectrometry data, Anal. Chem. 48: 1368-1375, Rosenthal, 1981, Improvement of algorithm for peak detection in automatic gas chromatography-mass spectrometry data processing, Anal. Chem. 53: 538-539に記載されている。本発明の方法のさらにいっそう好ましい1実施形態においては、該ピーク分析はさらに、そのピーク分析によって得られる結果に基づいた生の結果の確認または無効判定を含んでなる。
モニターされたプロセスデータについて述べたとおり、生の結果またはその部分はピーク分析の結果に基づいて無効とすることができる。上述の説明は必要に応じて変更を加えて適用する。無効とされた生の結果は削除するか、または好ましくは別の切り離されたデータベース中に保管する。
本発明の方法の好ましい1実施形態においては、ステップd)の該分析は、生の結果に基づいた特異的プロフィールを作成することを含んでなる。
特異的プロフィールは、生の結果またはある特定の供試サンプルのヴァリデートされた結果に基づいて作成される。好ましくは、その特異的プロフィールが、フィンガープリントのように、該サンプルを特異的に同定することを想定している。上述のとおり、特異的プロフィールは、生の結果、ヴァリデートされた結果、またはそれらから由来した結果を含んでなるものとすることができる。
特異的プロフィールは当業界で既知の技法によって作成することができ、それらの技法は例えば、Per Johnson, 2005, Extraction interpretation invalidation of information for comparing samples in metabolic LC/MS data sets, Analyst 130: 701-707に記載されている。この文献では、多数のサンプルの比較用の頑強で解釈可能な多変量モデルを作り出すことのできる方法が報告されている。この報告された方法には、代表的なデータセットの構築法が、それには自動ピーク検出、アライメント、保持時間ウインドウのセッティング、クロマトグラフィーの次元の合計、およびalternating regressionによるデータ圧縮が含まれている。別の特異的プロフィールを作成するための適切な方法は、Per Johnson 2004, A synergy for identifying differences in large theories of metabolomic samples analyzed by GC/MS, Analytical Chemistry 76: 1737-1745中に見出すことができる。この文献では生物学的システム中のメタボライトを同定し、定量するための方法が報告されている。その方法では、サンプル間の差を説明する、ベースラインの補正、アライメント、時間窓決定、alternating regression、PLS-DA、およびクロマトグラム中の保持時間窓の同定が含まれている。同様に、操作技法は例えば、WO 2003/102543または米国特許第0127287号(2005)中に開示されており、その開示内容は本明細書中に参照により組み入れる。
生の結果に基づいて特異的プロフィールを作成する好ましい方法には、生の結果の3次元のセットを作成することが含まれ、そのセットでは第1の次元はシグナル強度で、他の2つの次元は特性に関するもので、好ましくは質量変数および/または時間変数である。第2のステップにおいては、第2の次元、好ましくは質量変数の次元が、少なくとも2つの質量変数インターバルに分けられ、各質量インターバルについての抽出シグナルが選択され、その抽出シグナルは時間の関数である。最後に、第3の次元は、好ましくは、時間変数の次元であり、少なくとも1つの時間変数インターバルとに分けられ、特性値は各時間変数インターバルについておよび各抽出シグナルについて選択される。それによって、特異的プロフィールが作成され、それはそれぞれの時間変数インターバルとそれぞれの質量変数インターバルの関数として、選択された特性値を含んでなる。シグナルの抽出は好ましくは、統合、合計、平均化、境界での選択または最大値または最小値に基づいた選択によって行われる。最も好ましくは、各時間変数インターバルについての特性値は、各時間変数インターバルを通じて抽出されたシグナルを統合することによって選択される。さらに、この方法には、特異的プロフィールが生の結果に基づく場合には、各時間変数インターバル内で抽出されたシグナル内のピークを検出するために、上述のピーク分析アルゴリズムを含めることができる。特異的プロフィールを作成するための特に好ましい方法は、下記の実施例1から3に記載している。最も好ましくは、本発明の方法で作成されることとなる特異的プロフィールは、メタボロームに特異的なメタボリックプロフィールである。
本発明の方法のさらに好ましい1実施形態は、ステップb)における該測定が質量分析を含んでなるものである。
本明細書で用いている質量分析とは、本発明に従って測定しようとするある化合物に対応する分子量(すなわち質量)または質量変数を測定することのできる全ての技法を包含する。好ましくは、本明細書で用いている質量分析は、GC-MS、LC-MS、直接導入質量分析、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極型質量分析、MS-MSまたはMS-MS-MSなどの連続的連結(タンデム)質量分析、ICP-MS、Py-MS、TOFまたは上述の技法を用いた組み合わせ型のものに関する。これらの技法の適用法は当業者にはよく知られている。さらに、適切な装置が市販されている。より好ましくは、本明細書で用いている質量分析は、LC-MSおよび/またはGC-MSに関する。より好ましくは、本明細書で用いている質量分析は、四重極型MSを包含する。最も好ましくは、該四重極型MSは次のように行われる：a) 質量分析計の第1の分析四重極内でのイオン化によって作られたイオンの質量/電荷商(m/z)の選択、b) 衝突ガスで満たされ衝突室となるその次の四重極内での、ステップa)で選択されたイオンの加速電圧をかけることによるフラグメンテーション、c) さらに次の四重極内における、ステップb)内でのフラグメンテーションプロセスによって作られたイオンのm/zの選択、これらによってこの方法のステップa)からc)は少なくとも1回行われるが、さらにイオン化プロセスの結果として生じた物質の混合物中に存在する全てのイオンのm/zの分析行われ、その四重極は衝突ガスで満たされているが分析の際は加速電圧はかけられていない。本発明で用いられる該最も好ましい質量分析についての詳細は、WO 03/073464中に記載されている。
上述のとおり、より好ましくは、ステップb)での該測定には質量分析の前に液体クロマトグラフィーを行うことも含まれている。
本明細書で用いている液体クロマトグラフィーとは、液相または超臨界相にある化合物を分離することのできる全ての技法を意味する。液体クロマトグラフィーは、移動相中の化合物、例えば本発明のサンプル中の少なくとも1種の化合物などを、固定相に通過させることを特徴とする。複数の化合物が固定相中を異なる速度で通過すると、個々の化合物は特有の保持時間(すなわち、その化合物がシステムを通過するのに要する時間)を有しているので、時間に応じて分離されることとなる。本明細書で用いている液体クロマトグラフィーにはHPLCも含まれる。液体クロマトグラフィーのための装置は例えば、Agilent Technologies, USAから市販されている。液体クロマトグラフィーを行うことの好ましい例は、下記の実施例1および2に述べている。
さらにより好ましくは、ステップb)の該測定は質量分析の前にガスクロマトグラフィーを行うことが含まれている。
本発明で用いられるガスクロマトグラフィーは原理的には、液体クロマトグラフィーと同じように操作される。しかし、化合物が液体の移動相内にあって固定相を通過するのではなく、化合物はガス状の中に存在する。化合物は、固体の支持体材料が固定相として入っているか、又はカラムの壁が固定相となるかまたは固定相となるものにコートされている。ガスクロマトグラフィーの場合も、各化合物にはカラムを通過するために必要な特有の時間がある。さらに、ガスクロマトグラフィーの場合には、ガスクロマトグラフィーにかける前に化合物を誘導体化しておくことが好ましいと想定している。誘導体化するための適切な技法は当業界ではよく知られている。好ましくは、本発明での誘導体化は、好ましくは極性化合物のメトキシ化およびトリメチルシリル化、および好ましくは非極性(すなわち親油性)化合物のトランスメチル化、メトキシ化、およびトリメチルシリル化に関する。誘導体化の詳細は下記の実施例で述べる。
別の好ましい1実施形態においては、本方法はステップb)の前にさらに、該少なくとも1つの供試サンプルを少なくとも1つの、極性化合物を含んでいる第1画分および非極性化合物を含んでいる少なくとも1つの第2画分に分画するステップを含んでなる。
本明細書で用いている「分画する」という用語は、化合物の分離および/または化合物の濃縮のための技法を意味する。適切な分画技法は当業界ではよく知られている。
上述の極性化合物を含んでいる画分は、好ましくは、サンプルを極性化合物用の溶媒と接触させ、その化合物を該極性溶媒中に拡散させること(すなわち極性化合物の抽出)によって該極性溶媒中に極性化合物の濃厚な画分をもたらすことによって得られる。極性化合物を含んでいる極性溶媒は残りのサンプル残査から分離され、本発明で意味する極性画分となる。本明細書で用いている極性溶媒には、極性指数がKellner, Analytical Chemistry, Weinheim, 1998, p.195に従って測定するとき4.0から10.2、好ましくは5.0から7.0、より好ましくは5.5から6.5のものが包含される。従って、極性溶媒は、水を含有する溶液を含む水、または極性プロトン性または非プロトン性有機溶媒、例えば炭素原子1から6個のアルキル基を有する、アルキルアルコール例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールなど、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル、ジメチルスルホキシド、またはN,N-ジメチルホルムアミドなどである。さらに、極性溶媒はKuster/Thiel, Rechentafeln fur die chemische Analytik, Walter DeGruyter, Berlin/New York, 1993, p. 359中に述べられているように少なくとも0.5の極性を有するもの、またはその混合物である。さらに本発明の方法で用いることが好ましい溶媒はWO 03/041834中に開示されている。本発明で用いられる極性溶媒は好ましくは水とアルコール、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノールとの混合物である。最も好ましくは、極性溶媒は下記の実施例で述べるようなメタノールと水の混合物である。
同様に、非極性化合物を含んでいる画分は好ましくは、サンプルを非極性溶媒と、その非極性化合物(すなわち親油性化合物)が非極性溶媒中に拡散するために十分な時間、接触させることによって得られる(すなわち非極性化合物の抽出)。本発明の非極性溶媒とは、極性指数がKellner, Analytical Chemistry, Weinheim, 1998, p.195に従って測定するとき、上述の極性画分の極性溶媒の極性指数よりも少なくとも0.3低い極性指数を有する溶媒または溶媒の混合物を意味する。より好ましくは、極性指数が極性溶媒の極性指数よりも0.5低いものであり、さらにより好ましくは1.0低いものであり、最も好ましくは2.0低いものである。従って、非極性溶媒の極性指数は5.5から1.0の範囲であり、より好ましくは5.0から2.0、最も好ましくは4.5から3.5の範囲である。非極性溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素を含むハロゲン化溶媒、またはヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、もしくはヘプタンを含む脂肪族溶媒、またはトルエン、ベンゼン、もしくはエーテル、例えばt-ブチルメチルエーテル、ジエチルエーテルなどのエーテル、またはテトラヒドロフランなどを含む芳香族溶媒が挙げられる。好ましくは、本発明で説明した分画を室温で行う。信頼度が高く正確な相分離を得るには、分画は好ましくはロボットによってアシストされる。
より好ましくは、該分画はさらに、該供試サンプル各々の、タンパク質、ペプチド、またはアミノ酸を含んでいる3つの画分のうちの少なくとも1画分中へ分画されることを含んでなる。
タンパク質またはペプチドを含んでいる画分は、好ましくは、該タンパク質またはペプチドを沈殿させることによって得られる。その沈殿させたタンパク質は残りのサンプルから例えば、遠心処理によって分離することができる。それによって、沈殿させたタンパク質またはペプチドを含んでいる固形のペレットが形成され、残りの液状サンプルは上述のとおりプロセスすることができる。そのペレットはその後の分析に適した溶媒中に溶解させることができる。アミノ酸を含んでいる画分はタンパク質を含んでいる画分を加水分解することによって得ることができる。あるいはまた、総アミノ酸含量は、前もって分画することなく、サンプルの一部を加水分解することによって測定することができる。加水分解はよく知られた技法で行うことができ、そのような技法としては、熱加水分解、酸加水分解、または酵素的加水分解が挙げられる。
本発明の方法のさらに好ましい1実施形態においては、ステップa)での該提供は、該少なくとも1つの供試サンプルが含んでいる少なくとも1種の化合物を抽出することを含んでなる。
本明細書で用いている抽出とは、有機物、例えば細胞、組織、器官、体液、葉、または実などに含まれている化合物を溶媒中に溶解することを意味する。上述のとおり、極性化合物は極性溶媒を用いて抽出することができ、一方、非極性化合物は非極性溶媒を用いて抽出することができる。さらに、抽出プロセスの効率を高めるために、好ましくは、抽出は、下記および下記の実施例に記載しているように高温および高圧条件下で行う。抽出は温度が30℃から90℃の範囲内で、より好ましくは60℃から80℃の範囲内で、最も好ましくは70℃で行われる。圧は好ましくは100 barから180 barの範囲内で、より好ましくは130 barから150 barの範囲内で、最も好ましくは140 barである。本発明で用いる抽出は、好ましくは液体-液体抽出が包含される。さらに、より好ましくは、抽出には、生物学的材料(例えば、組織または器官)から化合物を放出させるための物理的または化学的処理が包含される。物理的処理としては、好ましくは、ボールミル処理、Ultra Turrax(IKA, USA)処理、または超音波処理が含まれる。抽出は、好ましくは、Accelerated Solvent Extractor(ASE)でアシストされる。
前述の観点から、少なくとも1つの供試サンプルは、好ましくは、1つの生物体由来、好ましくは、本質的に同一のメタボロームを有する複数の生物体のうちの1つの生物体由来のものである。より好ましくは、該生物体は植物、動物、細菌、または真菌である。本発明では動物は、ヒト以外の哺乳類およびヒトを含んでいる。さらに、生物体は遺伝子を改変されたものまたは本明細書の別のところに詳細に説明したように処理されたものとすることができる。
ある特定のメタボロームについて質の高い結果を得るために、統計学的理由で、ある生物体の様々な個体からの様々なサンプルを含んでなる集団を特徴付ける統計学的パラメーター(例えば、平均値や中央値)を計算することを想定している。しかし、個々の生物体は、原理的には、本質的に同一のメタボロームを有する。このような状況で、本質的に同一なメタボロームとは、生物体の集団の全ての個体が同調する代謝活性を有しており、その結果(i)その集団の各個体のメタボローム中に本質的に同じメタボライトが存在し、(ii)その集団の個体の各々について本質的に同一な該メタボライトの量がもたらされる。またメタボライトの量は集団の個体間で、集団の統計学的値の範囲内で変動しうるものであることは理解すべきである。当業者であれば、パーセンタイルのような統計学的記述語を用いることができることは既知である。生物体の本質的に同一なメタボロームは、好ましくは、１つにまとめて多変量解析、例えば主成分分析(PCA:Principal Component Analysis)、または階層的クラスタリングで測定することができる。
細菌や真菌に関する限り、それらの生物体がモノクローナルに増殖させうることおよび同一の居住条件下、例えば同一の細胞培養物内などの条件下で容易に維持しうるので、そのような集団を容易に得ることができる。
本質的に同一のメタボロームを有する動物は、本質的に同じ年齢の動物集団のコンパイル、および該動物集団を下記の居住条件下で馴化させるのに十分な時間維持することによって提供することができる：(i) 一定の温度、(ii)一定の湿度、(iii)その動物集団の動物の物理的分離、(iv)餌は自由に摂取させる、その餌は本質的に化学物質による汚染または微生物汚染のないものとする、(v) 水分は自由に摂取させる、その水分は本質的に化学物質による汚染または微生物汚染のないものとする、(vi) 一定の照明時間、ならびに、該期間終了後にその動物集団が提供される。上記のコンパイルとは、何らかのソースから動物を選択して本発明の方法にかけることとなる動物集団を確立することを意味する。従って、それらの動物は同一の母動物の子孫または異なる母動物の子孫のことがある。1匹の母動物の単一の子孫をソースとして用いる場合には、動物集団をコンパイルするために子孫全体を用いることができ、またはその子孫のうちの選択された動物を用いることができる。本明細書で用いているコンパイルは、動物の年齢に関して行われる、すなわち、下記に詳述するように、その集団の全個体が本質的に同じ年齢である。しかし、さらに別の特徴を考慮に入れることができる。さらに、体重、サイズ、性別、全般的な外観(例えば、外見で健康な動物のみが選択される)が考慮される。本質的に同じ年齢であることとは、動物が同様な成長段階、例えば、胚、若年、成年であることを意味する。本発明の方法で用いるための好ましい動物の年齢は、青年期、好ましくは青年期の前期である。動物集団の動物は、好ましくは、年齢としてX日±1日の範囲であり、ここでXは動物集団の想定年齢である。言い替えれば、集団のある動物は、その動物集団の平均年齢の動物より、多くとも1日年を取っているか、または若いこととなる。最も好ましくは、その集団の全ての動物の年齢がXである。そのような動物は1匹の母体から同時に生まれ子孫である動物、すなわち同腹子をコンパイルすることによって提供されるか、または同じ日に異なる母体から生まれた動物をコンパイルすることによって提供される。胚を用いる場合には、本質的に同じ年齢とは、胚の成長段階に関してのものであることを理解すべきである。様々な動物種の胚の成長段階は当業界ではよく知られた技法によって決定することができる。成長段階は、例えば、受精の時点に基づいて計算することができる。さらに、個々の胚は、既知の形態学的特徴によって成長段階を定めることができる。さらに、胚を用いる場合には、該胚を身ごもっている母は本明細書中に示す条件下で維持される。例えば、本発明の方法の動物としてラットまたはマウスを用いる場合には、動物がX±1日の年齢で、そのXが生後63、64、または65日間であることが好ましい。イヌでは好ましい年齢(X)は6ヶ月である。本発明の方法で用いている、維持する、とは動物集団の動物に適用される特別の居住場所、食餌、飲料、および環境条件を意味する。動物が、OECD Guideline for Testing of Chemicals No:407に規定する条件下で維持されることが好ましい。さらに特定の条件を下記に示す。
i) 動物集団の全ての動物は同一の一定温度のもとで維持される。本発明の方法を行うための、動物にストレスを与えない温度の選択には注意を払うべきである。好ましくは温度は20-24±3℃、より好ましくは、22±3℃、最も好ましくは22、23、または24℃である。
ii) さらに、動物集団の全ての動物は同一の一定の湿度のもとで維持される。その湿度は、少なくとも30%とすべきであるが、70%を超えるべきではない。しかし、例外的なまれな状況においては(例えば飼育室やケージの清掃の際)、湿度は70%を超えても良い。好ましくは、湿度は50-60%である。
iii) 動物集団の動物の物理的分離も本発明の方法にとって重要であることが見出されている。従って、動物集団の各動物は別々のスペース内、例えば、別々のケージ内で維持されなければならない。
iv) 動物集団の動物は餌を自由に摂取させる。用いる餌は本質的に化学的汚染物または微生物の汚染物を含まないものとしなければならない。適用すべきスタンダードについては、Fed. Reg. Vol.44, No.91, May 09, 1979, p.27534中に述べられている。最も好ましくは、細菌などの微生物の汚染物は餌の1gあたり5 x 105個以下である。そのような餌はProvimi Kliba SA, SwitzerlandからGround Kliba mouse/rat maintenance diet "GLP" mealを購入することができる。
v) 動物集団の動物には飲料は自由に供給される。好ましくは、該飲料は水である。しかし他の水をベースとした飲料も同様に用いることができる。そのような飲料は、例えば、その動物に必要な栄養素、ビタミン、またはミネラルを含んだものとすることができる。飲料として水を用いた場合には、European Drinking Water Directive 98/83/EGに述べられているように、その水は化学的汚染物または微生物の汚染物を含まないものとしなければならない。
vi) 最後に、動物集団の各動物は同じ一定の照明時間でなければならない。一定の照明は、好ましくは、人工光源(太陽光のスペクトルを有するもの)によって行われる。照明時間は12時間の明、その後12時間の暗とする。その後照明時間を再度開始する。好ましい照明時間は明の時間が6時から18時までの12時間で、暗の時間が18時から6時までの12時間である。
上述の居住条件は、物理的に分離された動物が入っているケージ用の共通の保管スペースを用いることによって、動物に適用することができる。該共通の保管スペースは動物室または動物棟とすることができる。手段の全動物を同じ部屋で維持することによって、一定の湿度、温度、および照明時間はその部屋全体または棟全体についてそれらのパラメーターを調節することによって容易に達成することができる。それらのパラメーターの調節は好ましくは自動化によってアシストされ、それらのパラメーターは常にモニターされている。馴化するために十分な長さの第1の期間では、動物集団の動物は、それらの動物の代謝活性が同期してその結果それらの動物が馴化され本質的に同一のメタボロームを有するようになる期間、上述の特定の居住条件下で維持されなければならない具体的には、該第1の期間はその集団の個体の全てが同じサーカディアンリズム、食物消化リズム、または鎮静/活動期に適応することができるようになるのに十分な長さである。さらに、その第1の期間は、各動物がその生化学的および生理学的パラメーターを与えられた環境条件、例えば湿度や温度などに応じて調整できるようになる期間である。
本質的の同じメタボロームを有する植物の集団は、例えば、次のようにして得られる：Arabidopsis ecotype C24(Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK;NASC Stock N906)については、均一な種子を蒔いて層化させることは、好ましくは、4℃の暗所で4日間行う。その期間の湿度は85%から95%の間、好ましくは90%に保つ。層化の後、例えばArabinodopsis thalianaの供試サンプルは、好ましくは、次の条件で22日から23日間の範囲の期間増殖させる。一定の照明を行う期間：明の期間を16時間続け、その後8時間の暗の期間を置き、照明は太陽光のスペクトルを反映したものとし、好ましくは光の強さを200-250 μE/m2/s、最も好ましくは200 μE/m2/sとする；20℃の一定温度、60%の一定の湿度、400 ppmの一定のCO2濃度とする。
好ましくは、該供試サンプルは細胞由来、組織由来、または器官由来のものである。
本発明で供試サンプルとして用いられることとなる細胞、組織、または器官は、生物体、好ましくは動物由来のもので、手術や生検を含む当業界ではよく知られた技法によって採取されたものとすることができる。さらに細胞、組織、または器官由来の供試サンプルには、細胞培養された細胞、細胞系統、または細胞由来の一次細胞培養物の全てのタイプのもの、および組織培養物または器官培養物の全てのタイプのものが含まれる。一次細胞は組織や器官から解剖と分散によって得ることができる。細胞系統を得るために単離された細胞を不死化するかまたは腫瘍遺伝子で形質転換することができる。
また、該供試サンプルが体液由来のものであることも好ましい。より好ましくは、その体液は血液、血清、血漿、リンパ液、唾液、脳脊髄液、汗、精液、膣液、涙液、糞便、または尿である。
上述のサンプルは当業界ではよく知られた技法によって採取することができる。適切な技法としては、血液のサンプリング、羊水のサンプリング、または尿のサンプリングが挙げられる。サンプルの性質によっては特別なサンプル前処理が必要である可能性もあることは理解されるべきであり、それは例えば血漿の場合には、凝固を防ぐために血液サンプルをヘパリンなどの凝固阻害剤と混合することが必要とされる。
さらに好ましい生物学的サンプルは生物体の揮発物を含んでいる。
本発明の方法の好ましい1実施形態においては、該方法はさらに、ステップd)の分析結果を含んでいるアウトプットの結果のセットを提供するステップを含んでなる。
既に上述したとおり、本発明の方法で行われる分析は、2つ以上の異なるサンプルのヴァリデートされた結果の比較を包含する評価ステップのためのデータが利用可能であることを必要とすることがある。さらに、分析された結果が保管に適したフォーマットであるか、または他の評価ステップのために特別にカスタマイズされたフォーマットとなっていることを想定している。従って、本明細書で用いられている「アウトプット結果のセットを提供する」という用語は、ヴァリデートされノーマライズされた生の結果および/または評価された結果を適切なアウトプットフォーマットへと変換することを意味し、そのフォーマットは、保管のために用いることができ、または、上述のパターン認識アルゴリズム、統計学的検定アルゴリズム、または多変量アルゴリズムを用いて種々のアウトプット結果の比較に用いることができる。当然のことながら、それらの結果は他のどのようなカスタマイズされたアウトプットフォーマットにも変換することができる。前述のカスタマイズされたアウトプットフォーマットは、例えば、ヴァリデートされノーマライズされた生の結果の、ExcelファイルやASCIIファイル、または3次元グラフィックなどのフォーマットを含んでなるものとすることができる。さらに、適切なカスタマイズされたアウトプットフォーマットは、総イオンクロマトグラム(TIC)の形態とすることができる。
本発明はまた、第1のサンプルに特異的な特質の決定方法に関し、それは次の事項を含んでなる：
a) 少なくとも1つの第1のサンプルについて本発明の方法で得られたアウトプットデータのセットを、少なくとも1つの第2のサンプルについて本発明の方法で得られたアウトプットデータのセットと比較し；
b) ステップa)の比較の結果に基づいて、該少なくとも1つの第1のサンプルに特異的な特質を決定するが、アウトプットデータのセットの差異は該少なくとも1つの第1のサンプルに特異的な特質を示すものである。
本明細書で用いている「特異的な特質」という用語は、第1のおよび第2のサンプルをお互いに区別することのできる特質を意味する。決定される特質は、少なくとも1つの特定の化合物、少なくとも1種の化合物の存在度(すなわち正確なまたは相対的な量)、またはあるサンプルまたはその一部分の特定のプロフィールである。
「第1のサンプル」および「第2のサンプル」という用語は、種々のサンプルの実体を意味する。従って、サンプルとは種々の化合物を含むものとすることができ、または、サンプルとは同じ化合物の様々な正確なまたは相対的な量を含んでいるものとすることができる。例えば、第1のおよび第2の生物学的サンプルは同じ生物体から、ある特定の処理の前と後に得られたサンプルという違いのみで得ることができ、または該生物体の異なる細胞、組織、または器官由来のものとすることができる。当然のことながら、第1と第2のサンプルは種の異なる生物体から、または同一種だが上述したとおり異なる処理を受けた生物体から得ることができる。例えば、第1および第2の環境サンプルは、同じ環境的位置から、例えば、ある環境イベントの前と後から得ることができる。さらに、第1および第2の環境サンプルは、対応する第1および第2の環境から得ることができる。
「アウトプットデータセットの差異」という用語は、質的および量的な差異を包含する。従って、本発明の方法のステップb)での比較の結果として得られた差異は、ある化合物の存在または不在という差異、その存在度における差異、または特異的プロフィールにおける差異とすることができる。好ましくは、本明細書で述べるアウトプットデータセットの差異は統計学的に有意な差である。ある差異が統計学的に有意であるか否かは、当業界ではよく知られた統計学的検定法によって検定することができる。上述の差異は、原理的には、パターン認識アルゴリズム、統計学的検定アルゴリズム、および/または多変量アルゴリズム、例えば、Principal Component Analysis(PCA)、Simple Component Analysis(SCA)、Independent Component Analysis(ICA)、Principal Component Regression(PCR)、Partial Least Squares(PLS)、PLS Discriminant Analysis(PLS-DA)、Support Vector Machines(SVM)、Neural Networks、Bayesian Networks、Bayesian Learning Networks、Mutual Information、Backpropagation Networks、symmetrical Feed-Forward Networks、Self-Organizing Maps(SOMs)、Genetic Algorithms、HierarchicalまたはK-Mean Clustering、Anova、Studentのt検定、Kruskal-Wallis検定、Mann-Whitney検定、Tukey-Kramer検定、またはHsu's Best検定によって決定することができる。より好ましくは、比較には上述の特定のアルゴリズムの1つが用いられ、最も好ましくは、「shrunken contrastsの方法」または「SICI アプローチ」が用いられる。
本明細書で用いている「示すもの(indicative)」という用語は、第1のサンプルについて本発明の方法によって決定された特質をさらに確認することが必要であることを意味している。例えば、あるサンプルについての特質の特異性をさらに確認することができる。しかし、上述の方法で用いられている「示すもの」とは、好ましくは、該差異に基づいて決定される特質が該第1のサンプルに特異的な特質であることを意味する。
本発明はさらに、第1のサンプルと第2のサンプルに共通の特質を決定するための方法に関し、その方法は次の事項を含んでなる：
a) 少なくとも1つの第1のサンプルについて本発明の方法によって得られたアウトプットデータセットを、少なくとも1つの第2のサンプルについて本発明の方法によって得られたアウトプットデータセットと比較し、
b) 該少なくとも1つの第1のサンプルと該少なくとも1つの第2のサンプルについての共通の特質を、ステップa)で行った比較の結果に基づいて比較するが、それらのアウトプットデータセットの類似性は該共通の特質を示すものである。
本明細書で用いている「共通の特質」という用語は、少なくとも2つのサンプルのお互いの類似性を決定することのできる特質を意味する。決定される特質は、少なくとも1つの特定の化合物の存在または不在、少なくとも1種の化合物の存在度(すなわち正確なまたは相対的な量)、またはあるサンプルまたはその一部分の特定のプロフィールである。
「アウトプットデータセットにおける類似性」という用語は、質的および量的な類似性を包含する。従って、本発明の方法のステップb)での比較の結果として得られた類似性は、化合物の存在または不在、化合物の存在度、または特定のプロフィールにおける類似性である。好ましくは、アウトプットデータセットにおいて本明細書で述べている類似性は統計学的に有意な類似性である。ある類似性が統計学的に有意であるか否かは当業界ではよく知られている統計学的検定法によって検定することができる。上述の類似性は、原理的には、パターン認識アルゴリズム、統計学的検定アルゴリズム、および/または多変量アルゴリズム、例えば、Principal Component Analysis(PCA)、Simple Component Analysis(SCA)、Independent Component Analysis(ICA)、Principal Component Regression(PCR)、Partial Least Squares(PLS)、PLS Discriminant Analysis(PLS-DA)、Support Vector Machines(SVM)、Neural Networks、Bayesian Networks、Bayesian Learning Networks、Mutual Information、Backpropagation Networks、symmetrical Feed-Forward Networks、Self-Organizing Maps(SOMs)、Genetic Algorithms、HierarchicalまたはK-Mean Clustering、Anova、Studentのt検定、Kruskal-Wallis検定、Mann-Whitney検定、Tukey-Kramer検定、またはHsu's Best検定によって決定することができる。より好ましくは、比較には上述の特定のアルゴリズムの1つが用いられ、最も好ましくは、「shrunken contrastsの方法」または「SICI アプローチ」が用いられる。
本明細書で用いている「示すもの(indicative)」という用語は、第1のサンプルについて本発明の方法によって決定された特質をさらに確認することが必要であることを意味している。例えば、あるサンプルについての特質の類似性をさらに確認することができる。しかし、上述の方法で用いられている「示すもの」とは、好ましくは、該類似性に基づいて決定される特質がそれらのサンプルが共通して有している特質であることを意味する。
具体的には、本発明は、ある生物体に適用されたある処理によって生ずる効果を測定するための方法も包含され、その方法は本発明の方法の各ステップおよびさらに該生物体の第1のサンプルに特異的な特質に基づいて効果を測定するステップを含んでなる。より好ましくは、該処理はその生物体の遺伝子の改変、ある化合物の投与、物理的処置、環境条件の変更、その生物体への照射、またはそれらの処理の組み合わせである。
前述のとおり、本発明の方法はある生物体の特定の処理によって生ずる効果を測定するために特に有用である。通常は、本明細書で意味しているようなある生物体の処理によって生ずる効果とは、メタボロームの変化を生じさせる処理である。既に前述したとおり、メタボライトは種々の処理、それらとしては化合物の投与、環境条件の変化、もしくは照射などの外因性因子、または生物体のゲノムの遺伝子の改変によって生ずる変化などが含まれるが、それらの処理に応じて起こる実際の細胞の活性を密接に反映している。
従って、本発明の方法によってある第1のサンプルに特異的な特質に基づいて測定される効果が、その処理が適用される生物体のメタボロームに及ぼす影響であることが好ましい。
上記で述べたとおり、本発明の方法はより具体的には、ある生物体の遺伝子の改変によって生ずる効果を測定するための方法を包含する。遺伝子の改変は、例えばエチルニトロソウレア(ENU)、エタンスルホン酸メチル(EMS)などのDNA修飾剤を用いた生物体のランダムな突然変異誘発により、相同組換えもしくは非相同組換えにより、または挿入変異誘発により導入することができる。生物体によって異なるが、挿入変異誘発は適切な挿入システムによって行うことができ、そのようなシステムとしては、植物でのT-DNA配列挿入、もしくはトランスポゾン、動物のための非ウイルス性、ウイルス性、レトロウイルス性、もしくはトランスポゾンベクター系、動物でのloxPシステムを用いたノックアウトおよびノックインアプローチ、または当業者にはよく知られている関連システムが挙げられる。さらに、本明細書で用いている遺伝子の改変には、対照の遺伝子を含んでいる発現カセットの生物体への導入が包含され、該発現カセットはその生物体のゲノム中に安定に組み込むかまたは細胞質中に残したままとすることができる。本発明で述べている遺伝子の改変は、好ましくはその生物体内で遺伝子産物が生み出されないかまたはその量が低減するもの、または新たな遺伝子産物が存在するようになるもの、または該生物体内で遺伝子産物の量が増加するもの、またはそれらの組み合わせである。さらに、該遺伝子の改変によって、その生物体のメタボロームまたはその一部が変化する、すなわちメタボライトが消失する、その存在度が変わる、または新たなメタボライトが出現することが想定される。前述の遺伝子の改変には、遺伝子発現に変化を与える、すなわちゲノムの改変、転写、RNAプロセシングまたは安定性または翻訳に変化を与える全ての技法が含まれる。従って、遺伝子の改変は好ましくは、次のものからなる群から選択された技法によって引き出される：対象の遺伝子の過剰発現、それは例えば、トランスジーンの導入、該遺伝子から転写したRNAの導入、相同組換え(ノックインアプローチ)、相同組換えによる遺伝転写の阻害(ノックアウトアプローチ)、オリゴヌクレオチド妨害をベースとしたアプローチ、RNAiアプローチ、ミクロRNAをベースとしたアプローチ、三重らせんをベースとしたアプローチ、コサプレッション、またはアンチセンスRNAをベースとしたアプローチによって行われる。上述の対象の遺伝子は、メタボライト(例えば酵素)に直接的に影響を及ぼす遺伝子、または上述の遺伝子の発現を変える遺伝子(例えば、ある酵素の遺伝子に対して特異的な転写因子の遺伝子、またはある酵素をコードしているRNAの安定性、プロセシング、または輸送に変化を与えるタンパク質をコードしている遺伝子)とすることができる。別の場合には、対象とする遺伝子を、未知の遺伝子、または代謝に間接的な影響しか及ぼさない遺伝子とすることもできるが、それは、そのような遺伝子の改変およびその後の代謝に与える影響の測定はその遺伝子の機能を特徴付け研究するための助けとなりうるからである。
上述のとおり、化合物の投与は通常は生物体のメタボロームをも変える。栄養素と栄養補助食品、毒性化合物または薬剤は、例えば、生物体のメタボロームに典型的な変化を与える。該典型的な変化は、生物体のサンプルに特異的な、該特質に基づいて測定される効果に対応している。そのような化合物の投与は生物体によって変わるが様々な技法によって行うことができる。細菌や真菌などの単細胞生物は、投与しようとする化合物を含んでいる培地中で培養することができる。植物は水の取り込みまたは、スプレー、bombardment、浸潤、接種、またはその他の当業者にはよく知られた技法によって、その化合物を得ることができる。動物に関しては、化合物の投与には、その化合物が全身的にその動物に提供される、すなわちその動物全体が処置されるような全ての技法が包含される。さらに、本明細書で用いている投与とは、化合物をある作用が行われていると考えられる部位、例えば標的となりうる組織または器官へ送達する、すなわち局所投与する、技法を包含する。本発明で投与されることとなる化合物は、適切な担体、例えば製薬に用いられる担体、添加剤、および/または希釈剤などをさらに含んでなる組成物中に含まれるものとすることができる。よく知られた希釈剤の例としては、リン酸塩緩衝食塩液、水、例えば水中油型乳剤などの乳剤、種々のタイプの湿潤剤、滅菌済溶液、その他が挙げられる。化合物または上述の組成物の投与は種々の方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内、または気管内投与などによって行うことができる。動物の場合には、より好ましくは、投与は経口投与によって、最も好ましくは、化合物を飲料や餌と混ぜて、または投与する化合物および植物油などの経口摂取用に製薬に用いられる担体を含んでいる経口投与用の組成物を用いることによって(すなわち胃管を用いて)、行われる。
ある化合物によって引き出されるメタボロームに及ぼす効果は、好ましくはスクリーニングアッセイ用の読み出しとして有用である。ある特定の所望の性質を有する化合物を、原理的には、その所望の性質を有することが既知の化合物によって引き出されるメタボロームと類似のまたは同一のメタボロームを引き出す能力によって同定することができる。そのようなスクリーニングアッセイで同定される好ましい性質は、化合物の治療的性質(すなわち、新しい医薬品を同定する目的でのスクリーニングアッセイ)、または植物保護性(すなわち、新しい植物保護化合物を同定する目的でのスクリーニングアッセイ)である。本発明の方法のそのような適用についての詳細は本明細書の他のところに記載している。
本発明の方法で適用される物理的処理には、外因性と内因性の物理的処理が包含される。外因性の物理的処理は環境によって生物体に与えられるものである。例えば、生物体を、その構造的な完全性に影響を及ぼす物理的な力にかけることができる。そのような処理には例えば手術が含まれる。内因性の処理は生物体にそれ自体の能力に基づいて適用される処理である。本発明の好ましい内因性処理はスポーツまたはライフスタイルのアクティビティーが含まれる。
本発明で意味するところの環境条件の変化は、本発明の方法にかけられる生物体の、物理的な生育環境条件を変えることによって達成することができる。温度、照明時間、湿度、酸素圧、などの環境条件は当業界でよく知られた技法によって容易に変えることができる。さらに、UV照射、γ線照射、β線照射、またはα線照射などの照射も、当業界ではよく知られた技法によって生物体に適用することができる。
上述の処理は自由に組み合わせることができることは理解されるべきである。従って、本明細書で意味するところの処理とは、生物体のゲノムの改変(すなわち、遺伝子の改変)、例えば毒性化合物などの化合物の投与、手術、その生物体が生育している温度を上昇させることによって環境条件を変化させること、および/または、最終的に例えばUV照射をその生物体に行うこと、またはそれらの処理の組み合わせをも包含するものである。
また、本発明によって特に包含されているものは、第1のサンプルに特異的なバイオマーカーを決定する方法であり、その方法は本発明の方法の各ステップ、およびさらに該第1のサンプルの該特質に基づいてバイオマーカーを決定するステップを含んでなる。
上述のとおり、本発明の上述の方法はまた、第1のサンプルに特異的なバイオマーカーを決定するために適用することもできる。本明細書で用いている「バイオマーカー」という用語は、本発明の方法によって分析されたサンプルについての該特異的な特質に基づいた生物学的マーカーを包含し、そのマーカーは、種々の生物関連の態様に関して生物学的物質を特異的に指し示すものである。本発明でのバイオマーカーとは、ある生物体またはその生物体由来のサンプル(例えば、癌細胞や癌性組織などの特別な組織または細胞タイプのサンプル)を特異的に同定し、ある生物体またはその生物体の細胞、組織、または器官の生物学的ソースを示すようなバイオマーカー、ある疾患または障害があることを示すバイオマーカー、ある生物体におけるある薬剤の特定の有効性を示すバイオマーカー、医学的治療(例えば薬物療法)を含む種々の処理の副作用を示すバイオマーカー、毒性評価のためのバイオマーカー、または生物体またはそれの細胞、組織または器官の生理学的状態に及ぼす環境の影響を示すバイオマーカーとすることができる。
上述のとおり、本明細書で用いているバイオマーカーは、好ましくは、該サンプルの特別な組成についてのインジケーターとすることができる。該第1および第2のタイプの細胞、組織、または器官が同一ではないとき、ある生物体の第1のタイプの細胞、組織、または器官由来のサンプルは、第2のタイプの細胞、組織、または器官から得られた第2のサンプルと比較すると、その組成が異なることは理解されるべきである。従って、心臓から採取した生物学的サンプルと脳から採取した生物学的サンプルとを比較すると、本発明の方法では心臓、および/または脳の特異的な特質を決定することができ、該特質はそれぞれの器官についてのバイオマーカーとして役に立つこととなる。さらに、本発明の方法は、細胞、組織、または器官に特異的なメタボリックプロフィールを確立させることができる。上述の該サンプルの特別な組成はまた、天然のまたは加工されたサンプルの起原または経過時間とすることもでき、例えば水に汚染された燃料サンプルの起原、または食物の起原または経過時間で、これらについては本明細書の別のところで詳細に述べる。
2つの異なる生物体から得られた生物学的サンプルを比較する場合には、バイオマーカーをそれらの生物体を同定するために用いることができる。そのような場合には、該サンプルのうちの一方に特異的な特質に基づいて、その生物体の同定することのできるバイオマーカーを決定することができる。例えば、2つの異なる種の生物体を本発明の方法によって比較するとき、該サンプルのうちの一方(すなわち、第1のサンプル)に特異的な特質に基づいて特異的なバイオマーカーを決定することができる。例えば、環境サンプル中の細菌や真菌などの微生物の測定は場合によっては厄介で時間のかかるプロセスである。本発明の方法は特異的なバイオマーカーの測定に基づいて微生物の迅速な同定が可能となっている。そのようなバイオマーカーは、本発明の方法によって、未知の微生物を含んでいるサンプルを、種々の異なる既知の微生物を含んでいる1つのサンプルまたは複数のサンプルと比較することによって測定することができる。新たな微生物は、そのメタボロームに基づいて、第1のサンプルに特異的な特質によって同定することができるが、一方既知の微生物は双方のサンプル中の共通の特質に基づいて同定されることとなる。しかし、本発明の方法は。種々の生物学的材料または種々の生物体のサンプルに特異的な特質の測定に限定されない。本発明の方法はさらに第1のサンプルに特異的な特質の測定を含み、その測定では該第1のサンプルおよびそれと比較されるサンプル(すなわち第2のサンプル)が、同一の生物体からある特定の処理の前および後に得られるか、または同一の種の生物体から、そのうちの一方の生物体または生物体の群はある特定の処理を受け、もう一方の生物体または生物体の群は処理を受けなかったまたは異なる処理を受けたものから得られる。
本発明の上述の方法のより好ましい1実施形態においては、該バイオマーカーは毒性評価に有用なバイオマーカーとすることができる。従って、本発明の方法は、毒性のあることが疑われる化合物による処理を受けた生物体のサンプルを、対照の生物体の対応するサンプルと比較することを包含する。そのような場合の対照の生物体は、毒性を有することが既知の化合物が投与された生物体とすることができる。そのような場合には、2つのサンプル間で、毒性のバイオマーカーを示す共通の特質を測定することができる。あるいはまた、ある生物体のサンプルを、化合物を何も投与していない対照の生物体と比較することができる。そのような場合には、バイオマーカーは、処理された生物体のサンプルに特異的な特質に基づいて測定される。さらに、後者の場合には、毒性の合併症についてさらにその生物体を観察することが必要とされる。そのような毒性の合併症が生じた場合には、そのバイオマーカーはその化合物の毒性を特異的に示すものである。従って、本発明はさらに、ある化合物の毒性を評価する方法を包含し、その方法は上述の方法の各ステップを含んでなる。
上述の方法の別の好ましい1実施形態においては、該バイオマーカーはある薬剤の作用についてのバイオマーカーである。本明細書で用いている薬剤とは薬剤の候補品、プロドラッグ、および薬剤そのものを包含する。原理的には、その方法は毒性評価について述べたように行うことができる。しかし、このバイオマーカーは薬剤の毒性ではなく作用を示すものである。本明細書で用いている薬剤の作用には薬剤の有効性と作用機作が含まれる。従って、上述の方法を適用することによってある化合物が薬剤として有効出ることをしめすバイオマーカーを同定することができる(すなわち、薬剤スクリーニングにおいて、ある薬剤を他の化合物の中から見つけ出すことができる)。さらにそのバイオマーカーをある薬剤の作用機作を見出すことまたは治療上有効な投与量を見出すことに用いうることも想定している。
上述の方法の特別な1実施形態においては、薬剤の有効性および/または薬剤の副作用を示すバイオマーカーを決定することができる。このような方法は臨床試験を加速するために特に有用である。この好ましい実施形態の方法は原理的には上述の方法と同じステップを含んでいるが、マーカーは薬剤の有効性および/または副作用を示すものである。さらに、本発明の方法では、バイオマーカーはある特定の薬剤の有効性または副作用を見出し、その程度と相関させることができる。それらのバイオマーカーは、それに基づいて治療における適切な治療法または適切な投与量を決めることができるスタンダードとして役立てることができる。従って、バイオマーカーはまた、好ましくは、ある薬剤に対する生物体の反応を予言するために用いられ、従って、適切な治療法を選択するため、または臨床試験と全臨床試験をサポートするために用いることができる。従って、このようなバイオマーカーは薬剤に対してある特定の方向で反応することが期待される個体の群を定義づけるために用いることができる。
上述の方法の別の好ましい1実施形態においては、バイオマーカーは診断用途に適している。本発明で述べているとおりバイオマーカーを測定することによって疾患、障害、または有病率を診断することができる。好ましくは、本明細書で用いている疾患または障害は代謝の変化を伴うものである。そのような疾患または障害は、心臓血管系疾患または障害、癌、代謝性障害および疾患、ならびに神経変性性疾患を含む変性性疾患または障害からなる群から選択することができる。従って、本発明はさらに、疾患、障害、または有病率を診断するための方法を包含し、その方法は上述の方法の各ステップを含んでなる。このような前後関係において、その方法がリスクの層化にも用いることができることは理解されるべきである。
さらに、本発明の方法のさらに好ましい1実施形態においては、バイオマーカーは移植の効果を評価するために用いられる。例えば、バイオマーカーは適切なドナーおよび/またはレシピエントを見出すことができる。あるいはまた、そのバイオマーカーに基づいて、移植での拒絶反応の危険性を層化しモニターすることができる。
本発明の方法のさらに好ましい1実施形態においては、上述のとおり定められたバイオマーカーは、栄養素、栄養補助食品、食餌および食料品の代謝への影響を測定するために用いられる。そのバイオマーカーは該栄養素、栄養補助食品、食餌、および食料品の有効性を評価するために、または有害または毒性の副作用(すなわち、生物適合性を試験することができる)があるか調べるために用いることができる。本発明の方法はまた、栄養素、栄養補助食品、食餌、および食料品の製造の間の品質管理に適用して、栄養素、栄養補助食品、食餌、および食料品の特定の性質例えば味などを確保するまたは最適化することもできる。さらに、代謝の変化およびそれに対応するバイオマーカーの変化に基づいて、1生物体の個体用の食品を開発することができる。そのような食品が成功しているか否かも本発明の方法でモニターすることができる。
同様にして、本発明の方法はまた、アルコールやタバコ製品およびそれらに類似のものなどの半贅沢品(semi-luxury)製品の品質管理または向上のために適用することができる。このような前後関係において、向上には、より良い味(テイスト)および、それらの製品の消費の有害作用との両立性およびその作用の低減が含まれる。
薬剤との関連で既に述べたとおり、本発明の方法で測定されるバイオマーカーは、好ましくは化粧品またはコンシューマーケア製品(例えば、紙おむつまたは衛生用紙製品)によって生ずる効果を測定するためにも適用可能である。化粧品およびコンシューマーケア製品の毒性または有害な副作用を見つけ出すことができる。さらに、化粧品の有効性を測定することができる。本発明の方法はまた、化粧品またはコンシューマーケア製品の製造の間の品質管理に適用することができ、または特別な性質、例えば香水の特別な匂いなどの性質を確保または最適化するために適用することができる。
本発明の上述の方法で測定されるバイオマーカーは、本発明の方法のさらに好ましい1実施形態において、除草剤、殺虫剤、または殺真菌剤のリード化合物の開発に用いられる。リード化合物の有効性は、標的とする生物体、例えば植物、昆虫、または真菌などをそのリード化合物で処理することによって生ずるメタボロームを分析し、上述のバイオマーカーを見つけ出すことによって、製品開発の初期の段階で効果的に試験することができる。この場合の適切なバイオマーカーは、リード化合物となる可能性のある化合物によって影響を受けるメタボロームが、除草剤、殺虫剤、または殺真菌剤として有効であることが既知の化合物のメタボロームと共通に有する特質に基づいたものとすることができる。
本発明の方法のまた別の好ましい1実施形態においては、バイオマーカーは植物の健康状態を見出すために適用される(植物診断)。従って、そのバイオマーカーは、水、窒素、または栄養素の必要性のインジケーターとして用いることができる。さらに、本発明の方法で測定されたバイオマーカーは、植物による水の消費、窒素の消費、または栄養素の消費をモニターするために用いることができる。
本発明の方法の別の好ましい1実施形態においては、バイオマーカーは生物体の生物学的サンプル中の外来性化合物の存在もしくは不在、または存在度を測定するために用いることができる。そのような外来性化合物としては、この方法の法医学的使用において、ドーピングのために用いられる化合物、例えばエリスロポエチンまたはそれの分解産物、ならびに禁止されている薬物、例えばヘロインもしくはコカインまたはそれらの分解産物が挙げられる。
さらに、本発明の方法によって測定されるバイオマーカーは健康に対するリスク評価のインジケーターとして用いることができる。例えば、喫煙の副作用をモニターおよび/または調べることができる。しかし、バイオマーカーはまた、ある種のスポーツまたは健康的なライフスタイルによって生ずるリスクまたは有益な効果を評価するためにも役立ちうる。そのバイオマーカーはまた、疾病の素因を見出すことにも役立ちうる。
本発明の方法で見出されるバイオマーカーは、好ましくは、品種改良にも有用なものである。例えば、より優れた性質、例えばより高い収量などを有する穀物は、通常は品種改良(交配)によって得られる。より優れた性質を示している表現型を有する親の生物体を、その優れた性質を示す表現型を親と同様に有する子孫を得るために、お互いに交配するか、またはその他の方法で増殖させる。同じことが動物に、特に家畜に適用される。従来の品種改良では通常は、優れた性質を集団の全ての動物が示しているような集団が得られるまでには数代を要する。これは時間がかかり厄介なプロセスである。親の代の生物体の優れた性質を指し示すバイオマーカーを測定することによって、子孫が得られる適切な生物体が高い信頼性で容易に見出すことができる。さらに、同じことを子孫の個体にも適用する。具体的には、さらに増殖させるための適切な候補動物を、その優れた性質が子孫の生物体にまだ現れていなくとも、見出すことができる。例えば、高収率のものは従来の品種改良法によって決定することができるが、それは成熟した植物についてのみである。しかし、バイオマーカーに基づいて、高収量などの優れた性質が現れる可能性を、成熟前に種子または若い植物で既に測定することができる。
本発明はまた、特に、生物体に投与される化合物の作用機作を決定する方法に関し、その方法は、本発明の各ステップおよびさらに該生物体の第1のサンプルに特異的な特質に基づいて該化合物の作用機作を決定するステップを含んでなる。
本明細書で用いている「作用機作」という用語は、ある化合物、例えば毒性化合物、植物防護化合物(例えば、殺真菌作用、除草作用、もしくは殺虫作用のある化合物)、または薬剤が特定の代謝性および細胞性の酵素が関与する経路に影響を及ぼす能力を意味する。従って、該影響によって生物体のメタボロームが特定の様式で変化を受け、その変化はある化合物によって影響を受けた1つまたは複数の経路を示すものである。本明細書で用いている、代謝性または細胞性の経路に影響を及ぼす、と言う表現は、化合物が該経路の特定のタンパク質または調節因子を変調、阻害、または活性化することを意味している。本明細書で用いている作用機作を決定する、という表現はある化合物が作用する特定の経路を決定し、該経路を同定することを包含しているが、それには経路の調節に関与している関連タンパク質またはその他の因子を同定することが含まれる。さらに、作用機作を決定することには、本発明の方法で分析されることとなる化合物が、既知の化合物と同じ代謝の変化、すなわち同じメタボロームまたはプロフィールを引き出して既知の化合物と同じ経路に作用するのか否かを決定することが含まれる。後者の場合には、特定の経路を同定すること、またはその経路の調節に関与している特定のタンパク質または調節因子を同定することは必要でないかもしれない。反対に、分析されることとなる化合物が原理的には、既知の化合物と同じ経路(1つまたは複数)に作用するかどうかを単に評価するだけで十分かもしれない。そのような好ましい方法は、ある特定の作用機作を有する化合物、例えば、薬剤、植物防護化合物、または毒性化合物などの迅速な同定に特に有用である。本発明の方法の好ましい1実施形態では、薬剤、植物防護化合物、または毒性化合物などの化合物の作用機作を調べたメタボローム分析結果は適切なデータベース中に保管される。
本発明の方法で作用機作を決定することによって、薬剤、毒性化合物、除草剤、殺真菌剤、および殺虫剤などの植物防護化合物を同定し、または改良することができる。具体的には、治療的作用、毒性、除草作用、殺心筋作用、または殺虫作用があると考えられる供試化合物の作用機作を、メタボロームのレベルで、所望の性質を示すことが既知の少なくとも1つの別の化合物の作用機作と比較することができる。このような前後関係では、作用機作のメタボロームのレベルでの分析は特に有益であるが、それは特定の経路またはその経路の調節に関与する特定の酵素、タンパク質、または調節因子に対して弱い活性しか持たない化合物は、供試生物体に対して目に見える徴候を示さないかもしれないが、一方そのような化合物の作用機作の一環としてメタボロームには既に著しい変化を起こしているかもしれないからである。従って、作用機作を決定することは、治療的作用または毒性作用が発揮される初期のプロセスを示すものとなりうる。従って、メタボローム分析は上述の化合物の同定に特に適している。さらに、このアプローチは、新規の植物防護化合物をスクリーニングするために、標準化し高スループットで行わせることができる。さらに、同定された化合物の活性を、化学修飾によって最適化し、供試生物体で再試験を行うことができる。さらにまた、所望の性質を示すことが既知の化合物(他のスクリーニング法で同定された化合物を含む)を上述の方法を用いて改良することができる。従って、メタボロミクスは、その作用機作に関連する活性をもたらすことをその化学修飾が行うことを示すことによって、化合物の最適化または改良をガイドすることに適しているであろう。
従って、上述の作用機作を決定するための方法の好ましい1実施形態においては、該生物体は植物で、該化合物は除草作用のある化合物である。具体的には、その方法は既知の除草作用のある化合物の作用機作を決定するため、または化合物の除草作用を見出すために(すなわち、ある化合物が除草作用のある化合物であるか否かを見出すために)用いることができる。
この作用機作を決定するための方法の別の好ましい1実施形態においては、該生物体は虫であり、該化合物は殺虫作用のある化合物である。好ましくは、本発明の方法で用いられる虫は植物にとって有害な虫、例えば、直翅類の昆虫またはアリマキなどである。この方法は既知の殺虫作用のある化合物の作用機作を決定するため、または化合物の殺虫作用を見出すために(すなわち、ある化合物が殺虫作用のある化合物であるか否かを見出すために)用いることができる。
作用機作を決定するための上述の方法のさらに好ましい1実施形態においては、該生物体は植物病原体となる真菌であり、該化合物は殺真菌作用のある化合物である。ここでも、この方法は既知の殺真菌作用のある化合物の作用機作を決定するため、または化合物の殺真菌作用を見出すために(すなわち、ある化合物が殺真菌作用のある化合物であるか否かを見出すために)用いることができる。
上述の方法が、様々な目的に適しているものであることは理解されるべきであり、そのような目的としては、限定はされないが、上記で具体的に説明したものが含まれる。
本発明の上述の方法の別の好ましい1実施形態においては、共通のまたは特異的な特質に基づいて植物の物質的な同等性(substantial equivalence)が決定される。植物は例えば、病原体への抵抗性や除草剤への抵抗性などの性質を改良するために遺伝子が改変される。しかし、遺伝子を改変した植物がその対応する野生型のものと物質的に同等であるか試験することが要求される。それによって、遺伝子の改変によって生ずる有害な副作用を同定することができる。この好ましい実施形態においては、上述の方法が少なくとも2つの植物、一方は遺伝子の改変されたものでありもう一方は改変されないままのもの(すなわち野生型の植物)であるが、それらの2つの植物由来の少なくとも2つのサンプル間の同一性の程度を求めるために用いられる。好ましくは、本発明の方法で測定するとき(すなわち、少なくとも1つの共通の特質が測定される)それらのメタボロームが本質的に同等であるならば、2つの植物は物質的に同等である。しかし、物質的に同等な植物が想定している遺伝子の改変の効果によって異なるものとなることは理解されるべきである。例えば、異種の遺伝子産物をコードする異種の遺伝子が遺伝子の改変によって導入される場合には、物質的に同等な植物が、改変された植物がさらに異種の遺伝子産物を含むものとなるという点で異なることは理解されよう(すなわち、少なくとも1つの特異的な特質を、他の点では同一のサンプルについて定めることができる)。さらに、それらの植物では、異種遺伝子の産物が代謝の変化、その変化はその産物の生物学的活性から予期されるまたは予期されていたものであるが、そのような変化を起こしうるという点でさらに異なっている可能性がある。
本発明の上述の方法のさらに好ましい1実施形態においては、ある共通の、または特異的な特質に基づいて製造工程がモニターされるかまたは調節される。種々の化合物または製品(例えばビールなどの食品)の製造には発酵工程が含まれる。製造の障害を見つけ出す、または製造の進行をモニターするために、製造工程(すなわち発酵工程)は品質管理の目的で注意深くモニターされる必要がある。本発明の方法を用いることによって、発酵の際の培養液の組成の変化を効果的に測定することができる。該測定に基づいてさらに別の方策、例えばその発酵工程の停止または発酵条件の変更などの方策を開始させることができる。前述のとおり、本発明の方法は自動化によってアシストすることができる。従って、本発明の方法は自動化された製造工程中で容易に実施することができる。
本発明の前述の方法の別の好ましい1実施形態においては、食餌または食料品の組成が、共通のまたは特異的な特質に基づいて測定される。食餌または食料品の組成は、一定の品質、味、または生物適合性(例えば、毒性がないこと、その他)を確保するために測定される。この方法は製造された、または天然の食餌または食料品に適用することができる。
本発明の前述の方法の別の1実施形態においては、環境サンプル、例えば地質学的サンプルなどが、共通のまたは特異的な特質に基づいて、天然資源のインジケーターについて分析される。指標とする好ましい天然資源は石油またはガスである。さらに、石油またはガスのその後の工程を本発明の方法でモニターすることができる。
本発明の前述の方法の別の1実施形態においては、環境サンプルが共通のまたは特異的な特質に基づいて、環境汚染についてモニターされる。モニタリングには、予防的または法化学的な(forensic)モニタリングが包含される。予防的モニタリングは環境汚染、例えば不適切に浄化された排水などを避けるために実施することができる。法化学的モニタリングは環境汚染、好ましくはその汚染源をも見つけ出すために適用することができる。
また、好ましくは、サンプルの共通のまたは特異的な特質の測定に基づいて、本発明の方法は環境サンプルなどのサンプルを、生物兵器または化学兵器に含まれていることが既知の化合物についてモニタリングすることができる。従って、飛行機、列車、地下鉄およびその他の公共交通システムの安全性は、本発明から大きな利益を得ることとなる。
最後に、本発明は本発明の方法を行うための、好ましくは採用された、システムに関し、そのシステムは次のものが機能しうる形でお互いに連結されたものを含んでなる：
a) 化合物を測定する手段；
b) プロセスのパラメーターをモニターする手段；
c) (a)の手段から得られた生の結果を分析する手段であって、生の結果を分析するための該手段は次のものを含んでなる：
(i) 化合物を測定する該手段から受け取った生の結果を含んでなる第1のデータベース；
(ii) モニターされたプロセスパラメーターを含んでなる第2のデータベース；
(iii) その生の結果をヴァリデートするためのルールを含んでなる第3のデータベース；
(iv) 同定された化合物のアロケートされた結果を含んでなる第4のデータベース；
(v) 該第3のデータベースに含まれているルールに基づいて生の結果を確認または無効と判定することのできるヴァリデーションツール；
このシステムでは少なくとも第2、第3、および第4のデータベースは機能しうる形で第1のデータベースと連結されている。
本明細書で用いている「システム」という用語は、機能的な様式で、機能しうる形でお互いが連結されている複数の手段を意味する。具体的には、それらの手段は、本発明の方法を上記に詳述したように実施することができるような様式で連結されていなければならない。従って、本明細書で用いている「機能しうる形で連結する」とは、好ましくは、機能的に連結されていることを意味する。本発明のシステムのために用いられる手段の如何によるが、各手段を他の手段と、その間でデータが輸送できるような方法、例えば、グラスファイバーケーブル、およびその他の高スループットのデータ輸送のためのケーブルなどで接続することによって、該手段を機能的に連結することができる。それでもやはり、それらの手段の間のワイヤレスデータ移送も本発明では想定しており、例えばLAN(ワイヤレスLAN、W-LAN)を介するものなどである。
本明細書で用いている「化合物を測定する方法」という用語は、化合物を分離する手段、例えばクロマトグラフィー装置など、および化合物を測定する手段、例えば質量分析計などが包含される。適切な装置については上記で詳述している。本発明のシステム中で用いられる化合物の分離のための好ましい手段としては、クロマトグラフィー装置が含まれ、より好ましくは、液体クロマトグラフィー、HPLC、および/またはガスクロマトグラフィーのための装置である。化合物を測定するための好ましい装置は、質量分析装置、より好ましくは、GC-MS、LC-MS、直接導入MS、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極型質量分析計、順次連結されたマススペクトロメトリー(MS-MSやMS-MS-MSを含む)、ICP-MS、Py-MS、またはTOFを含んでなる。
化合物を分離するためおよび化合物を測定するための手段は、好ましくはお互いに組み合わされたものである。最も好ましくは、LC-MSおよび/またはGV-MSが本発明のシステム中で用いられ、それについては本明細書の他のところで詳細に述べる。
「プロセスパラメーターをモニターする手段」という用語は、個々のプロセスパラメーターを測定することのできる装置に関する。該装置によって測定されるプロセスパラメーターは好ましくは、プロセスのランに用いられる装置が正常なパラメーターの範囲内にあることを示すプロセスパラメーター、すなわち技術的な障害が起こったかどうかを示すパラメーターである。さらに、プロセスパラメーターをモニターする手段には、クロマトグラフィーに用いられる特定のスタンダードについてその回収率を計算する手段をも含む。それによって、クロマトグラフィーの間に障害が起こったか否かをモニターすることができる。さらに、測定には、本発明の方法に用いられる前処理の効果をモニターするための手段がさらに包含される。例えば、誘導体化の効果を適切な手段によって測定することができる。
「生の結果を分析するための手段」という用語は分析ツール、好ましくは上記で特定したデータベースを意味する。分析ツールはデータプロセシング、データヴァリデーション、及びデータ評価のためのコンピューター上で動作するコンピュータープログラムとすることができる。上述の機能を行うための適切なアルゴリズムは、本発明の方法に関する実施形態に従って上記で述べている。本発明でのデータベースとは、適切なメディアに系統的に保管される情報(例えば、結果)の集積を意味する。該情報の集積は、物理的に同一の、または別の切り離された保管用メディアに保管することができる。その情報が物理的に別の切り離された保管メディアに保管される場合には、該メディアの各々に保管される情報をデータベースを形成している集積に配置させることができる。情報の適切な保管メディアとしてはコンピューターまたは分離した保管メディア、例えばハードディスク、CD、CD-ROM、および類似のものが挙げられる。本発明ではデータベースとは、本発明の方法で作成された結果の、プロセシング、ヴァリデーション、または評価の間に生ずる質問に応答するために、上述の分析ツールがデータベースに照会することができる構造物を有していることを想定している。さらに、そのデータベースは、データベース管理システムをさらに含んだものとすることができる。データ管理システムは、ネットワークモデル、階層モデル、リレーショナルモデル、またはオブジェクト指向のデータベースモデルに基づいたものとすることができる。全く別のデータベース管理システムはいわゆるファジーロジックに基づいたものとすることができる。
「同定された化合物のアロケートされた結果」という用語は、既知の化合物またはあらかじめ同定されている化合物によって得られた評価結果を意味する。本明細書で用いている既知の化合物とは、その化学的性質及び組成が明白に知られている化合物である。しかし、本明細書で用いている同定された化合物には、その化学的性質と組成が未知であるが、本発明のシステムを用いた以前の分析で既に観察されている化合物をも包含する(すなわち、いわゆる未知であることが既知の化合物であり、それについては本明細書の他のところで詳述している)。
好ましくは、本発明のシステムは、原理的には、次のとおり機能する：ある化合物を測定する手段が一次生データを作り出す。その一次生データは、生データを分析するための手段に移送され、該移送の前または後に生の結果へと変換される。その生の結果は、上記で説明した第1のデータベース中に維持または保管される。化合物測定と分析のプロセスはさらにモニターされ、測定されたプロセスパラメーターは第2のデータベース中に保管される。本発明のシステムの分析ツールは、上記で本発明の方法に従って説明したとおり、その生の結果をヴァリデートする。例えば、サンプルまたはサンプルの画分から得られた生の結果は、それに対してプロセスパラメーターがアロケートされるが、プロセスパラメーターが技術的に一貫性に欠けることを示している場合には、無効とされることとなる。その次のステップでは、分析ツールが生の結果をヴァリデートするためにルールを適用するが、そのルールは第3のデータベース由来のものである。該第3のデータベースに含まれる好ましいルールは本明細書の他のところで詳述している。さらに、評価の種類の如何によるが、分析ツールには、もう一つ別のデータベース(第4のデータベース)が必要となる可能性があり、そのデータベースは上述のルールデータベースに含まれるルールを適用することによって、分析ツールで比較することのできる、同定された化合物のアロケートされた結果を含んでなる。次いで、ヴァリデートされ、評価された結果は、任意で、アウトプット結果のセット中に転換することができ、そのセットは本明細書の他のところに特定したとおり、適切な別のデータベース中に保管することができ、または適切なフォーマットで別の目的のために提供することができる。
本発明のシステム中にさらに別のデータベースを含めることができることは理解されるべきである。それによって、得られた評価された結果に追加の情報をアロケートさせることができる。さらに、本発明のシステムでの少なくとも第4のデータベースは動的に機能するデータベースであること、すなわち、新規の結果が既に同定済の化合物または新たに同定された化合物にアロケートされうる場合、その情報は第4のデータベースに追加されることとなることを、想定している。
従って、該第1のデータベースおよび該第4のデータベースは、より好ましくは、機能しうる形でお互いに連結されて第1のデータベースの生の結果がその評価後に第4のデータベース中に同定済の化合物についてのアロケートされた結果として含まれることとなるようにする。
本発明のシステムの好ましい1実施形態においては、生の結果を分析するための該手段は次のものを含んでなる：
(v) 少なくとも1つの他のデータベースと機能しうる形で連結された少なくとも1つの特異的サンプル識別子(identifier) に関連する情報を含んでなる第5のデータベース。
より好ましくは、該特異的サンプル識別子は次のものからなる群から選択される：サンプル数、サンプルの起原、サンプルのソース、サンプルの処理、サンプルラン、およびサンプルのアリコート)。
好ましくは、その第5のデータベースは第1のデータベースと少なくとも機能しうる形で連結される。該連結によって特異的サンプル識別子と、そのサンプルから得られた生の結果、ヴァリデートされた結果、または評価された結果との間の相関性、または関連性を具体化することができる。このことは、好ましくは、例えば、データ挿入、削除、および/またはアップデート用のPL/SQL法などを用いて複製ツールによって行われる。
本発明のシステムの好ましい1実施形態においては、新規の結果を分析するための該手段は次の事項を含んでなる：
(vi) 少なくとも1つの他のデータベースと機能しうる形で連結された識別子に関連する生化学的情報を含んでなる第6のデータベース。
本明細書で用いている「生化学的情報」という用語は、そのサンプル識別子に伴うものであることが既知の生化学的知識を意味する。例えば、ある特定の細胞タイプ、組織のタイプ、または器官のサンプルを分析する場合には、識別子はサンプルのソースとすることができ、その識別子に関する生化学的情報はその細胞タイプ、組織のタイプ、または器官内で働いていることが既知の特定の生化学的経路についての情報とすることができる。生化学的情報としては、従来技術由来の情報、ならびに本発明に従ってサンプルの特徴を調べる追加の技法、例えば酵素的アッセイまたはその他の生物活性の試験などを行うことによって得られる情報が含まれる。
本発明のシステムの別の好ましい1実施形態においては、ある化合物を測定するための該手段は質量分析計を含んでなる。適切な質量分析計は上記に詳述している。最も好ましくは、本発明のシステムで用いる質量分析計は四重極型MSもしくはMS-MS装置、またはTOF装置である。
より好ましくは、測定のための該手段はさらに、液体クロマトグラフィーおよび/またはガスクロマトグラフィー装置を含んでなる。HPLCを含む液体クロマトグラフィーのためならびにガスクロマトグラフィーのための適切な装置は上記で詳述している。
本発明のシステムのさらに好ましい1実施形態においては、該システムはさらに、サンプルを分画するための手段を含んでなる。
上述のとおり、本発明のシステムは、好ましくは自動化でアシストされた本発明の方法を行うために適したものである。従って、サンプルを分画する手段は、好ましくは、ピペッティング及び混合ステップを行うことのできるロボットまたはロボットシステムを含んでなる。
本発明のシステムの別の好ましい1実施形態においては、システムはさらに抽出のための手段を含んでなる。
本発明のシステムで用いられる抽出のための手段は、好ましくは、抽出用のAccelerated solvent extractor (ASE)装置を含んでなる。さらに、抽出のための手段は上述のロボットまたはロボット装置をさらに含んだものとすることができる。
上記で参照した参照文献の全ては、それらの開示内容全体ならびに上述の明細書中に明確に参照したそれらの文献の特別な開示内容に関して、本明細書中に参照により組み入れる。
本発明を下記の実施例で説明するが、それらの実施例は本発明の範囲を制限または限定することを考慮したものではない。
実施例
実施例１ 形質転換した植物のメタボリック分析
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の形質転換した(すなわち、遺伝子を改変した)植物および野生型の植物を、下記の方法を用いてお互いに比較した。
a) サンプルのサンプリングと保管
サンプリングは環境をコントロールしたチャンバー内で直接行った。植物を実験室用の小ハサミを用いて切断し、実験室用秤で迅速に秤量し、あらかじめ冷却した抽出用シンブル中に移し、液体窒素で冷却したアルミニウムのラック中に置いた。所望により、抽出用シンブルはフリーザー中で-80℃で保管することができる。植物の切断から液体窒素中での凍結までの経過時間は合計で10から20秒以内とする。
b) 凍結乾燥
実験の間、その植物がディープフリーザー中にあるままとなっているか(温度<-40℃)、または初めて溶媒と接触するまで凍結乾燥によって水分のない状態となっているかのいずれかであるように注意する。
抽出シンブル中の植物サンプルをおいたアルミニウムのラックはあらかじめ冷却した(-40℃)凍結乾燥設備中に置かれる。主乾燥相の始めの温度は-35℃で圧は0.120 mbarであった。乾燥相の間、各パラメーターは圧と温度のプログラムに従って変動した。12時間後の最終温度は+30℃で最終圧は0.001から0.004 mbarであった。真空ポンプと冷却器を切った後、システムを空気(乾燥チューブを通過させて乾燥したもの)またはアルゴンで洗浄した。
c) 抽出
凍結乾燥装置を洗浄した直後に、凍結乾燥した植物材料の入った抽出シンブルを、ASE装置の5 mLの抽出カートリッジ(Accelerated Sovent Extractor ASE 200、Solvent ControllerおよびAutoASE ソフトウェア付属(DIONEX))；図2の210も参照せよ。
ASE装置(Accelerated Sovent Extractor ASE 200、Solvent ControllerおよびAutoASE ソフトウェア付属(DIONEX))の24カ所のサンプルポジションは植物サンプルで満たしたが、そのうちのいくつかのサンプルは品質管理試験のためのサンプルを含んでいる。
極性物質は、約10 mLのメタノール/水(80/20, v/v)を用いてT=70℃およびp=140 bar、5分間の加熱相、1分間の静置抽出で抽出した。より親油性の高い物質は約10 mLのメタノール/ジクロロメタン(40/60, v/v)を用いてT=70℃およびp=140 bar、5分間の加熱相、1分間の静置抽出で抽出した。これらの2種類の溶媒混合物は同じガラス試験管(遠心管、50 mL、スクリューキャップおよびASE(DIONEX)用の貫通可能な隔壁付き)中に抽出した。 この溶液を次の内部標準で処理した：リビトール、L-グリシン-2,2-d2、L-アラニン-2,3,3,3-d4、メチオニン-メチル-d3、およびα-メチルグルコピラノシドとメチルノナデカノエート、メチルウンデカノエート、メチルトリデカノエート、メチルペンタデカノエート、メチルノナコサノエート。
総抽出物を8 mLの水で処理した。植物サンプルの固形残査および抽出シンブルを棄てた。
その抽出物を振盪した後、相分離を加速させるために遠心を少なくとも1400 ｘｇで5から10分間行った。さらにGC分析用に上清のメタノール/水の相(「極性相」、無色)を1mLを取り、1 mLをLC分析用に取った；図2、212-220をも参照せよ。メタノール/水の相の残りは棄てた。さらにGC分析用に有機相(「油相」、暗緑色)の0.5 mLを取り、0.5 mLをLC分析用に取った。取り出した部分の全てを、IR Dancer赤外真空エバポレーター(Hettich)を用いて蒸発乾固させた。蒸発プロセスの間の最高温度は40℃以内であった。装置内の圧は10 mbar以上であった。
d) LC-MSまたはLC-MS/MS分析のための油相のプロセシング
油相の抽出物は蒸発乾固させてあるが、それを移動相中に取った。HPLCを行い、実施例3bおよび3cに記載のとおり、勾配をかけた溶出を行った。図2の214, 222を参照せよ。
極性抽出物は蒸発乾固させてあるが、それを移動相中に取った。HPLCを行い、実施例3bおよび3cに記載のとおり、勾配をかけた溶出を行った。図2の2146 224を参照せよ。
e) GC−MS分析のための油相の誘導体化
トランスメタノリシス用には、140 μLのクロロホルム、37μLの塩酸(重量比で37%の塩酸を水中に含む液)、320μLのメタノール、および20μLのトルエンの混合物を、蒸発させた抽出物に添加した。容器を密封し、100℃で2時間、振盪しつつ加熱した。次いでその溶液を蒸発乾固させた。残査を完全に乾燥させた。
カルボニル基のメトキシ化は、密封した容器中で塩酸メトキシアミン(ピリジン中に5 mg/mL、100μLを60℃で1.5時間)と反応させて行った。奇数番号の直鎖脂肪酸の溶液(7個から25個の炭素原子を有する脂肪酸を各々0.3 mg/mL、炭素原子を27個、29個、および31個有する脂肪酸を各々0.6 mg/mLを3/7 (v/v)のピリジン/トルエン中に含む溶液)の20μLをタイムスタンダードとして添加した。最後に、100μLのN-メチル-N-(トリメチルシリル)-2,2,2-トリフルオロアセタミド(MSTFA)を用いた誘導体化を60℃30分間で、これも密封した容器中で行った。GCへの注入前の最終液量は220μLであった。図2の220、226を参照せよ。GC-MS分析は実施例2dに記載のとおり行った。
f) GC−MS分析のための極性相の誘導体化
カルボニル基のメトキシ化は、密封した容器中で塩酸メトキシアミン(ピリジン中に5 mg/mL、50μLを60℃で1.5時間)と反応させて行った。奇数番号の直鎖脂肪酸の溶液(7個から25個の炭素原子を有する脂肪酸を各々0.3 mg/mL、炭素原子を27個、29個、および31個有する脂肪酸を各々0.6 mg/mLを3/7 (v/v)のピリジン/トルエン中に含む溶液)の10μLをタイムスタンダードとして添加した。最後に、50μLのN-メチル-N-(トリメチルシリル)-2,2,2-トリフルオロアセタミド(MSTFA)を用いた誘導体化を60℃30分間で、これも密封した容器中で行った。GCへの注入前の最終液量は110μLであった。図2の218、228を参照せよ。GC-MS分析は実施例2dに記載のとおり行った。
g) 種々の植物サンプルの分析
それらのサンプルを1シリーズに20件の植物サンプルからなる個々のシリーズ(これをシークエンスと呼ぶ)で測定したが、各シークエンスには少なくとも3件、好ましくは5件の野生型植物を対照として含んでいる。あるいはまた、対照集団由来の材料のアリコートをプールし、十分に混合するかホモゲナイズし、参照品として用いることができる。質量分析は四重極型質量分析システムを用いて行った；図2の230-238を参照せよ。各アナライトのピーク面積をそれぞれの内部標準のピーク面積で割った。得られたデータはその植物について確立された新鮮重量について標準化した；図2の238を参照せよ。
このようにして計算された値を、同じシークエンスの野生型対照群の対応するデータの平均で割ることによって、野生型の対照群での値と関連づけた。この結果得られた値はratio＿by＿WTと呼び、それらはシークエンス間で同程度であり、変異型でのアナライトの濃度が対照の野生型とどの程度異なるのかを示している；図2の238を参照せよ。
ノックアウト変異型の植物の6つの個体を、対照の野生型植物の10の個体と並べて、標準的な植物の生育条件下で育てた。サンプルの分析は上述のとおり行い、それらのサンプルを2つの独立したシークエンスで(各シークエンスは変異型が3つ、野生型が5つのサンプルからなる)測定した。2つのアナライトについて対応する生データ(シグナル)を図3aおよび3cに示している。対照群の野生型に対してノーマライゼーションを行わない場合には、相異が単に技術的問題に基づくものであることは、この実施例では明らかである(群内でのシークエンス-1(白抜き記号)およびシークエンス-2(黒の記号)の間の差に注目せよ)。対照の野生型群の平均値に対して(ここで示したように、あるいは中央値に対して)ノーマライゼーションを行った後は、データはシークエンス間ではるかに比較しうるようになっている(図3bおよび3dを参照し、対数変換したデータが示されていることに注目せよ)。このことは、相対標準偏差(rsd)の低減にも反映している(表1)。このことはまた、多変量解析においても見ることができる(図4)。多変量解析では、3種のアナライトについてならびに変異型では6サンプルおよび対照の野生型では9サンプルについて、生の結果(図4a)、またはノーマライズされ対数変換されたデータ(図4b)をPCAで解析した。主要コンポーネント分析では生の結果が用いられた場合には、サンプルはそれらの群への割り当てではなくそれらのシークエンスによって分けられるが(図4a)、ノーマライズされ対数変換されたデータを用いることは技術的な影響を調節していることである。この結果、群間の差は分離について主な判断基準となっている(図4b)。
Figure 0005091861
h) 特異的プロフィールの作成
標準的な生育条件下で育った20体の植物、および標準的な条件下で2週間育った後干ばつストレスを8日間(水を与えず)かけた10体の植物を収穫し、上記のa)からe)のとおり抽出および分析した。得られた生の結果を、植物について確立した新鮮重量で標準化し、上述のとおり同じシークエンスの野生型の対照群の平均データでノーマライズした。得られた160種のアナライトについてのratio＿by＿WTデータを対数変換し、PLS-DAで解析した。最も高い絶対ローディングであった11種のアナライトを生物学的マーカープロフィールとして評価のために選択した(図5)。図5aは、干ばつストレスをかけた植物についての中央プロフィールを示し、図5bはストレスをかけていない植物についての中央プロフィール、図5cは分類しようとする単一のサンプル(このサンプルは4日間の干ばつストレスをかけた植物から得たものである)のプロフィールである。種々のプロフィールの比較で、干ばつのストレスのかかった植物のメタボリックマーカープロフィールが、ストレスのかからなかった植物と著しく異なることが示されている。分類しようとする単一のサンプルは、ストレスのかかった植物のプロフィールと明確な類似性を示し、そのことはこのサンプルにとって4日間の干ばつ処理が、厳しい干ばつストレスを受けた植物で見られたものと非常に類似した代謝の変化を誘発するのに十分なものであったことを示している。
サンプルの分類のためのバイオマーカープロフィールのまた別の使用法は図6に示している。バイオマーカープロフィールからの11種のアナライト(詳細は上記参照)は、20体のストレスをかけていない植物および10体の干ばつストレスをかけた植物(8日間の干ばつ)に基づいてPLS-DA干ばつストレスモデルを構築するために用いた(図6a)。このモデルを、4日間の干ばつストレスをかけた植物から得られたサンプルの視覚的分類に用いた(図6b)。このモデルで、4日間の干ばつサンプル集団は8日間干ばつストレスをかけたサンプルとともに、4日間の干ばつストレスが厳しい干ばつストレスを受けたサンプルと非常に類似した代謝の変化を誘発するのに十分なものであることを支持しているのは明らかである。
実施例２ 生物学的サンプルについての特異的プロフィールの作成
下記で特異的プロフィールを確立するためのステップを、血液サンプルについてGC-MSの結果に基づいて説明する。
a) サンプルの調製
サンプルは次のように調製する：タンパク質は血漿から沈殿させることによって分離する。水およびエタノールとジクロロメタンの混合物を添加した後、残りのサンプルを水性の極性相と有機物の親油相に分画した。
b) GC-MS分析のための油相の誘導体化
油性抽出物のトランスメタノリシス用には、140 μLのクロロホルム、37μLの塩酸(重量比で37%の塩酸を水中に含む液)、320μLのメタノール、および20μLのトルエンの混合物を、蒸発させた抽出物に添加した。容器を密封し、100℃で2時間、振盪しつつ加熱した。次いでその溶液を蒸発乾固させた。残査を完全に乾燥させた。
カルボニル基のメトキシ化は、密封した容器中で塩酸メトキシアミン(ピリジン中に20 mg/mL、100μLを60℃で1.5時間)と反応させて行った。奇数番号の直鎖脂肪酸の溶液(7個から25個の炭素原子を有する脂肪酸を各々0.3 mg/mL、炭素原子を27個、29個、および31個有する脂肪酸を各々0.6 mg/mLを3/7 (v/v)のピリジン/トルエン中に含む溶液)の20μLをタイムスタンダードとして添加した。最後に、100μLのN-メチル-N-(トリメチルシリル)-2,2,2-トリフルオロアセタミド(MSTFA)を用いた誘導体化を60℃30分間で、これも密封した容器中で行った。GCへの注入前の最終液量は220μLであった。
c) GC−MS分析のための極性相の誘導体化
極性相については、誘導体化は次のように行った：カルボニル基のメトキシ化は、密封した容器中で塩酸メトキシアミン(ピリジン中に20 mg/mL、50μLを60℃で1.5時間)と反応させて行った。奇数番号の直鎖脂肪酸の溶液(7個から25個の炭素原子を有する脂肪酸を各々0.3 mg/mL、炭素原子を27個、29個、および31個有する脂肪酸を各々0.6 mg/mLを3/7 (v/v)のピリジン/トルエン中に含む溶液)の10μLをタイムスタンダードとして添加した。最後に、50μLのN-メチル-N-(トリメチルシリル)-2,2,2-トリフルオロアセタミド(MSTFA)を用いた誘導体化を60℃30分間で、これも密封した容器中で行った。GCへの注入前の最終液量は110μLであった。
d) GC-MS分析および一次生データの作成
用いたGC-MSシステムは、Agilent 5973 MSDを組み合わせたAgilent GCからなる。オートサンプラーはCTCのCompiPalまたはGCPalである。
分析には、分析するサンプル材料および相分離ステップからの画分によって異なるが、0%から35%までの芳香族部分を含んでいる種々のポリメチルシロキサン固定相を入れた通常用いられる市販のキャピラリー分離カラム(30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)を用いた(例えば、DB-1ms、HP-5ms、DB-XLB、DB-35ms、Agilent Technologies)。最終液量で1μLまでの量をスプリットレスで注入し、オーブン温度のプログラムは、各アナライトのピーク内での十分なクロマトグラフィーでの分離とスキャン回数を得るために、種々の昇温速度で、70℃で開始し340℃で終わらせた。さらに、RTL(Retention Time Locking, Agilent Technologies)を分析のために用い、通常のGC-Ms条件、例えば1から1.7 mL/minの一定流量で、移動相ガスとしてはヘリウムを用い、イオン化は70 eVで電子衝撃法で行い、スキャンはm/zが15から600の範囲でスキャン速度は2.5から3 スキャン/秒とし、標準的な同調条件とする。
薬剤-1を用いた処置を行った個々のラットから得た血漿サンプルを、対照の非処理ラットの血漿サンプルとともの採取した。ラットは全て標準的な動物飼育条件下においた。参照サンプルとして用いるために、対照の非処理ラットから得た血漿サンプルはプールし、このプールと同じもの4つを各シークエンスの測定に用いた。サンプルの分析は上記のa)からd)に記載のとおりに行った。2種類のアナライトについての対応する生データ(シグナル)は図7aおよび7cに示している。プールした参照群に対してノーマライゼーションを行わない場合には、相異が単に技術的問題に基づくものであることは、この実施例では明らかである(群内でのシークエンス-1(白抜き記号)およびシークエンス-2(黒の記号)の間の差に注目せよ)。プールした参照群の平均値に対して(ここで示したように、あるいは中央値に対して)ノーマライゼーションを行った後は、データはシークエンス間ではるかに比較しうるようになっている(図7bおよび7dを参照し、対数変換したデータが示されていることに注目せよ)。このことは、相対標準偏差(rsd)の低減にも反映している(表2)。このことはまた、多変量解析においても見ることができる(図8)。多変量解析では、215種のアナライトについてならびに薬剤-1型では8サンプルおよび対照の非処理型では8サンプルについて、生の結果(図8a)、またはノーマライズされ対数変換されたデータ(図8b)をPCAで解析した。主要コンポーネント分析では生の結果が用いられた場合には、サンプルはそれらの群への割り当てではなくそれらのシークエンスによって分けられるが(図8a)、ノーマライズされ対数変換されたデータを用いることは技術的な影響を調節していることである。この結果、群間の差は分離について主な判断基準となっている(図8b)。
Figure 0005091861
h) 特異的プロフィールの作成
薬剤-1、薬剤-2、および薬剤-3を用いた処置を受けた個々のラット、および対象の非処置ラットから血漿サンプルを採取した。ラットは全て標準的な動物飼育条件下に置いた。分析の終了時に血漿を全てのラットから採取し、プール参照品として用いるためにプールした。全てのサンプルの採取、抽出、および分析は上述のとおり行った。得られた生の結果は用いた抽出液量について標準化し、同じシークエンスのプール参照品の平均データに対してノーマライズした(上述のプロセスで)。215種類のアナライトについて得られたratio＿by＿poolデータを対数変換し、ANOVAで解析した。ANOVAで最も高いp値を示した15種のアナライトを評価のための生物学的マーカープロフィールとして選択した(図9)。図9aは薬剤-1についての中央プロフィールを示し、図9bは非処理の対照サンプルの中央プロフィールを示し、図9cは薬剤-2の単一サンプルのプロフィールを示し、図9dは薬剤-3の単一サンプルのプロフィールを示している。種々のプロフィールを比較すると、薬剤-1についてのメタボリックマーカープロフィールは非処理の対照のプロフィールとは著しく異なることが示されている。薬剤-2からの単一のサンプルのプロフィールは薬剤1のプロフィールと類似性を示しており、このことはこれら2種類の薬剤での処置が類似の代謝の応答の引き金を引くことを示しており、それはそれらの作用機作が類似していることを示唆している。これに対して、薬剤-3はこれらの15種類のアナライトの分析に基づけば対照とより類似している。薬剤-3が非処理の対照とは少なくとも1種のアナライトについては異なっていることは留意すべきである。
サンプル分類にバイオマーカープロフィールのデータを用いるもう一つの方法を図10に示している。バイオマーカープロフィールの15種のアナライト(詳細は上述)を、54件の非処理対照サンプルと14件の薬剤-1サンプルに基づいて、薬剤-1対非処理対照についてのPLS-DAモデルの構築に用いた(図10a)。このモデルを薬剤-2または薬剤-3から得られたサンプルの視覚的分類のために用いた(図10b)。このモデルでは、薬剤-2サンプルが薬剤-1サンプルと同じ集団に属することは明らかであり、そのことはこの2種類の薬剤が共通の作用機作を有していることを示唆している。しかし、薬剤-3サンプルは非処理の対照サンプルと同じ集団である(境界に位置することが、いくらか差があることを示唆している)。
実施例３ 生物学的サンプルについての特異的プロフィールの作成
下記では、血液サンプルについてLC-MSの結果に基づいて特異的プロフィールを確立するための各ステップを説明する。
a) サンプル調製
サンプルは次の方法で調製する：タンパク質は血漿から沈殿させることによって分離する。水およびエタノールとジクロロメタンの混合物を添加した後、残りのサンプルを水性の極性相と有機物の親油相に分画した。
b) 液体クロマトグラフィー
分画後、四重極型質量分析システムと組み合わされた液体クロマトグラフィーシステム中にサンプルを挿入する。サンプルはまず液体クロマトグラフィー(LC)の時間分解分離技法を用いて分離された後、質量分析の質量分解分離技法にかけられる。2つのシステムは双方ともコンピューターシステムで制御され、そのコンピューターシステムは質量分析システムと液体クロマトグラフィーシステムを制御して実験データとシステムのパラメーターを読み出す。
LC部分はAgilent Technologies, USAの市販のLCMSシステムで行う。極性の抽出物については、10μLを流速200 μL/minでシステム中に注入する。分離カラムはクロマトグラフィーの間、15℃に維持する。油性抽出物については、5μLを流速200 μL/minでシステム中に注入する。分離カラムは30℃に維持する。
c) 質量分析
質量分析は、ターボイオンスプレー源を備えたApplied Biosystems API 4000 トリプル四重極型装置で行った。極性抽出物については、この装置では負イオンモードでイオンスプレーを-4000Vで、ガス1は35psi、ガス2は30psi、カーテンガス20psi、温度600℃で測定する。この装置でのスキャンは、質量依存性デクラスタリング電位を-30Vから-100Vとして、ファーストプロフィールモードで1秒間に100-1000 amuをフルスキャンモードで行った。油性抽出物については、この装置では正イオンモードでイオンスプレーを5500Vで、ガス1は25psi、ガス2は50psi、カーテンガス25psi、温度400℃で測定する。この装置でのスキャンは、質量依存性デクラスタリング電位を20Vから110Vとして、ファーストプロフィールモードで1秒間に100-1000 amuをフルスキャンモードで行った。
d) 特異的プロフィールの作成
このシステムを用いることによって、各サンプルについて3次元の第1のデータセットが作成され、それには質量対電荷比m/zの関数として、および液体クロマトグラフィーシステムの保持時間の関数としてシグナル(強度、カウント)が含まれる。
生物学的サンプルの3次元の第1のデータセットの例を図12に示している。生データは多数の強度ピークを含んでいて、水平面から多数のピーク410が上に出ている。図12のデータの軸は図11に象徴的に示している。このように、軸412のセットは保持時間軸414("rt"で示されている)を含んでなり、そこでは単位は分である。さらに、軸のセット412は質量対電荷軸416、これはm/zで示されており、単位は原子質量単位(amuであり、それは実際には「1 電気素量あたりの1原子質量単位」を意味する。直交する軸のセット412の第3の軸は、シグナル軸418で、これは図12で"I"で示されており、このシグナル軸418の単位は、この実施例ではカウントである。
従ってシグナルIは保持時間rtおよび質量対電荷比m/zの関数である。この場合、シグナルIは非連続の関数で、測定サイクルあたり(MS 質量分析)1つのシグナルデータポイントを含んでいる。それにもかかわらず、図12に見られるとおり、これらの実験サイクルは測定のフルレンジから見れば十分に小さいので、シグナルIは非連続的なステップは示さずなめらかである。それにもかかわらず、実際には、シグナルIは非連続の関数であることは留意されねばならず、そのことは「統合(integration)」を用いる場合には、実際には非連続データポイントを合計することを意味する。
さらに、図11では第1の測定420の範囲が示されており、それは質量分析の測定範囲を示している。さらに、第2の測定422の範囲が示されており、それはクロマトグラフィーの測定の範囲を示している。質量分析は、例えば電気素量あたり100 amuから電気素量あたり1000 amuまで、例えば、電気素量あたり0.2 amuの非連続のステップで行うことができる。同様に、第2の測定422の範囲は0.1分から6分の範囲、1、2、または3秒の非連続ステップの測定(サイクル時間)で行うことができ、1秒が最も好ましい。
図11にさらに示しているように、第1の測定420の範囲および第2の測定422の範囲を等しいインターバル424、426に分ける(この実施例では)。典型的には、質量変数インターバル424の長さΔm/zが1 amuであることが好ましく、第2の測定の6分間の範囲については、時間変数インターバル426はおおよそΔrt=15から80秒が好ましく、そうすることにより好ましい数の時間変数インターバル426である約5から24となる。より好ましくは、Δrt=15から20秒である。好ましくは1から20の時間変数インターバル426が用いられる。上述のとおり、質量対電荷軸416および保持時間軸414の分割のやり方で他の実施形態も可能である。
第2のプロセスステップにおいては、抽出されたシグナル(抽出イオンクロマトグラムXICと呼ばれることが多い)が、図12に従って生データの質量変数インターバル424の各々について選択される。言い替えれば、このステップは、1つの特定の強度を、特的質量変数インターバル424および特異的保持時間rtに指定するために、全ての生データを1つの特異的質量変数インターバルΔm/z 424内に圧縮することを含んでなる。このことは、例えば、質量変数インターバル424の各々について、各保持時間についてのシグナルIの強度シグナル全てを合計することによって行うことができる。従って、例えば、図11中の質量変数インターバル424がi番目の質量変数インターバルである場合には、このi番目の質量変数インターバル424についての抽出されたシグナルXICiは：
Figure 0005091861
この式で"Δm/z, i"とは、i番目までの質量変数インターバルを合計したものを示している。従って、オリジナルの3次元第1のデータセット(rt, m/z)は複数の2次元抽出シグナルXICDiへと次元が減り、それは保持時間のみの関数となっている。抽出シグナルXICiの数は質量変数インターバル424の数に対応している。例えば、電気素量あたり1 amuの質量変数インターバルΔm/zが100 - 1000 amu/zの測定範囲について用いられている場合には、amu/z=1について1個の抽出シグナルXICがあり、amu/z=101-102について1個の抽出シグナルがあり、…および、最後にはm/z=999 - 1000 amu/zについて1個の抽出シグナルがある。上述のとおり、統合または合計する替わりに、質量変数インターバル424の各々について抽出シグナルXICiを得るために、他の方法、例えば平均化、最大化、または最小化などを用いることができる。
次のプロセスステップでは保持時間軸が時間変数インターバル426に分けられ、それらは図13中では象徴的に"TS 1"、"TS 2"、…、"TS 5"と示されている。この実施例では、保持時間軸414の第2の測定422の全範囲は6分間であり、それが5つの時間変数インターバルに分けられ、その各々の長さは72秒間となっている。これらの時間変数インターバル426は「タイムスライス」と呼ばれることが多い。
第2の測定422の範囲を時間変数インターバル426に分けた後、さらにサブステップで、抽出されたシグナルXICiの時間変数インターバル426の各々について固有値が選択される。このプロセスは図13に象徴的に示している。この場合には、その固有値は、抽出されたシグナルXICiをj番目の時間変数インターバルまで単純に統合することによって選ばれる。XICi関数は上述のとおり実際は非連続関数であるので、この「統合」は実際は合計することであり：
Figure 0005091861
この式でci,jはi番目の質量変数インターバル424について、およびj番目の時間変数インターバル426についての固有値を示している。従って、プロセスステップ414の結果として、固有値ci,jのマトリクスが作成され、それは、少なくとも1種の化合物を含んでいるサンプルを特徴付ける固有のサンプルプロフィールであり、それはオリジナルのデータセット(すなわちシグナルI)についての「減少させたデータセット」である。
次の任意のプロセスステップでは、図13の抽出されたシグナルXICiからさらに別のパラメーターを得ることができる。あるいはまた、またはさらにまた、上記の方法で生成させた固有のパラメーターci,jを、例えばノーマライジングまたはその他の何らかの変換方法で変換することができる。1例として、図13に示した抽出されたシグナルXICiについての固有のパラメーターci,jは図13中の黒の領域で示されており、それは図13中の第1の時間変数インターバルTS 1の中の抽出されたシグナルXICi 510の下の領域である。この領域は実験システムの設定に強く依存しているので、その領域を、例えば、全体のシグナル高さに対してノーマライズすることができる。従って、式(2)を用いて得られたこの領域、それは固有のパラメーターci,jを生成させているが、その領域を時間変数インターバル426中で最も高いピーク512の高さで割ることができる。このように、固有のパラメーターci,jは新しい固有のパラメーターci,j'で置き換えることができ、このci,j'は固有のパラメーターci,jをピーク512の高さで割ったものである。これによって、固有のパラメーターは「ノーマライズされた」状態となり、実験システムの実験の設定とはほぼ無関係となる。
任意の1プロセスステップにおいて、例えば、サンプルについての中央値、平均値、標準偏差(SD)、相対標準偏差(RSD)、またはその他の統計学的数値を生成させることができ、そのデータを例えば、対数変換によって変換することができる。従って、いくつかのサンプルを、それらのサンプルの統計学的情報を得るために、比較する、および/または組み合わせることができる。
さらに別の1プロセスステップにおいて、多数のサンプル全体のある種の固有値の分布を可視化するために、統計学的データを可視化することができる。従って、例えば、平均値からあらかじめ定めておいた「許容しうる」偏差を超えて逸脱したサンプルおよび/または固有値はデータセットから排除することができる。さらに別の任意の1プロセスステップにおいては、単一のサンプルまたは複数のサンプルの固有値についてのそのステップより前のプロセスステップの統計学的結果が、参照値、例えば、参照サンプル(実際のまたは仮想の)の参照値と比較される。従って、例えば、何らかの特定の固有値(それは、上述のように、例えば複数のサンプルの平均値とすることができる)の間の比率を生成させることによって、単一のサンプルまたは複数のサンプル内でのある特定の化合物の存在、不在、またはその量についての可能性(尤度)を得ることができる。このようにして、単一のサンプルまたは複数のサンプルの定量的および/または定性的分析を行うことができる。
図14と15は前のステップから得られた結果の例を示している。非処置および薬剤を投与されたラットの(2種の異なる薬剤、分析に用いられた処置のサブセット、結果は33サンプルについて可視化している)、血漿サンプルから得られたデータを、ANOVA分析由来の変数プリセレクション(52変数)に基づいた主要コンポーネント分析(PCA)にかけた。図14に示すように、3種類の異なる処置の全てを分離することができ、このような分離のもととなった重要な変数を同定することができる(図15)。
上述のプロセスステップの結果、例えば各サンプルの固有値などは、コンピューターシステム内に保管することができる。このコンピューターシステムはいくつかの別々のコンピューターを含んでなるものとすることができ、また、1つ以上のデータベースを含んでなるものとすることができる。従って実験システムを制御するため、および実験データの評価のために別々のコンピューターを用いることができる。このように、上記のプロセスステップによって得られた実験データは別のコンピューターシステム上で評価することができる。
実施例４ 動物の飼育
a) 動物の集積
CrlGlxBrlHan:Wi系のラットはCharles River, Sulzfeld, Germanyから購入し、その年齢は63日から65日齢であった。各ラットは耳に連番の刺青をして標識した。ラットは下記の居住条件下で飼育した。
b) 居住条件
エアコンディショニング： 温度20-24℃、湿度30-70%、それからの逸脱は全て記録した。
照明時間： 6:00から18:00まで12時間照明、18:00から6:00まで12時間消灯
ケージのタイプ： ワイアーケージ、DK III型、Becker & Co., Castrop-Rauxel, Germany
1ケージあたりの動物数：1匹
食餌のタイプ： Ground Kliba マウス/ラット維持飼料"GLP"食、Provimi Kliba SA, Switzerlandから供給されたもの、自由に摂取させた。
水分補給： 飲料水を自由に摂取させた。
馴化： 7日間の馴化期間にラットは研究の環境条件と食餌に慣れた。
実施例５
供試化合物の投与およびサンプリング
a) 供試化合物の投与
wistar系ラットの雌雄を、投与期間開始前に体重に基づいてランダム化して複数の投与群に割り付けた。ラットは5種類の異なる供試化合物の高投与量と低投与量での処置を下記の表3に示したスケジュールで受けた。
Figure 0005091861
b) 血液サンプリング
血液サンプリングは下記の表4に示すタイムスケジュールに示したとおり行った。
Figure 0005091861
実験の間、瀕死および死亡したラットのチェックを、月曜から金曜までは1日に2回、土曜、日曜、祝日は1日に1回行った。ラットに臨床的に異常な徴候がないか、毎日チェックする。異常および変化は各ラットについて記録する。食餌の摂取量は研究の6日目、13日目、20日目、および27日目に調べた。飲料水の摂取量は毎日の一般観察の際にチェックした。体重は投与期間開始前にラットをランダム化するために測定した。投与期間中は、体重を研究の0日目、6日目、13日目、20日目、および27日目に測定した。供試物質の毎日の摂取量の平均値は、体重と食餌摂取量の個々の値に基づいて計算した。平均値と標準偏差はDunnetの検定を用いて計算した。
血液のサンプリングは次のとおり行った：剖検または血液サンプリングの前は、食餌は約16から20時間与えなかった(絶食期間)。血液のサンプリングは午前7時30分から10時30分の間に行った。血液はイソフルランで麻酔したラットの後眼窩静脈叢から採取した。1 mLの血液をEDTAを抗凝固剤として(10%溶液を10μL)採血した。サンプルを遠心して血漿を分離した。沈殿した細胞を0.9% NaClで3回洗い、滅菌蒸留水(Ampuwa, Fresenius, Bad Homburg, Germanyより購入)で1 mLとした。溶血させた血液サンプル中のヘモグロビンは、40μLの溶血血液と160μLの1.5% NaClを用いて測定した。サンプルの調製は冷却して行った。サンプルは液体窒素雰囲気下で-80℃で保存した。
実験の完了後に、各ラットについて臨床病理所見を調べた。その目的のために、研究で生存したラットは全数、イソフルラン麻酔下で断頭するか(最終の血液サンプリングを想定した場合)、またはCO2麻酔により屠殺した。
実施例６ 生物分析のための植物培養
トランスジェニック植物の生物分析のために、特別な培養施設内で均一に生育させた。その目的のために、配合土の混合物としてGS-90基質を注入機(Laible System GmbH, Singen, Germany)中に導入し、植木鉢中に満たした。その後、35個の植木鉢を1つのディッシュに併せ、Previcurで処理した。その処理には、25 mLのPrevicurを10 Lの水道水中に入れた。この量は約200個の植木鉢を処理するのに十分な量であった。それらの植木鉢をPrevicur溶液中に置き、さらにPrevicurを含まない水道水を上から注いだ。それらは4日以内に用いた。
種蒔きには、冷凍庫内に保管していた(-20℃で)種子をエッペンドルフ試験管から爪楊枝を用いて取り出し、配合土を入れた植木鉢中に移した。合計で約5から12個の種子を植木鉢の中央に蒔いた。
種子を蒔いた後、植木鉢を載せたディッシュを形状を合わせたプラスチックのフードで覆い、ストラティフィケーション室(発芽を行わせる室)中に4日間、4℃で暗くして置いた。湿度は約90%とした。発芽させた後、供試植物を22から23日間、16時間は明条件、8時間は暗条件のリズムで20℃で、大気の湿度を60%とし、CO2濃度を約400 ppmとして生育させた。光源にはOsramのPowerstar HQI-T 250 W/D Daylightランプを用いたが、このランプは太陽光のスペクトルに近い光を生じ、光の強度は約220μE/m2/s-1であった。
実施例７ 生物分析のためのLemnaとArabidopsisの処理
Lemna(アオウキクサ)のバイオアッセイには、Lemna pausicostata L.のストック培養品を、ショ糖(10 g/L)を含有している無機培地中で混合栄養で、Grossmann 1992, Heterotrophic plant cell suspension cultures for monitoring biological activity in agrochemical research. Comparison with screens using algae, germinating seeds and whole plants. Pestic Sci 35: 283-289 and Retzlaff 1993, Growth rate determination of Lemna by video scan of the leaf surface area. In Target Assays for Modern Herbicides and Related Phytotoxic Compounds, P. Boger, G. Sandmann, eds., pp 251-256, Lewis Publishersに従って増殖させた。バイオアッセイは無菌条件下でプラスチックのペトリ皿中で(直径5 cm)、3回反復して行った。各ペトリ皿には15 mLの、ショ糖を含まない培地とLemnaの葉を入れ、その葉はペトリ皿の表面積の2/3を覆っていた。
その培地に供試化合物をアセトン溶液として添加した(アセトン中に終濃度として1%含有)。対照は対応する量のアセトンのみを添加し、それでは植物の生育に副作用は見られなかった。各化合物は3種類の濃度で試験し、例えば、除草剤のクロルスルフロンでは終濃度が10-5、10-6、10-7Mとした。次いで培養ディッシュをプラスチックの蓋で閉じ、生育室中で25℃で連続的に光を当ててインキュベートした(Philips TL white neon tube, 40 μmol m-2s-1放射照度, 400から750 nm)。処理の48から72時間後に、並行して置いたディッシュのLemnaを採取し(3回反復測定由来の、新鮮重量で約250 mg)、水で注意深く洗い、ただちに液体窒素で凍結して、植物材料の抽出と分析を行うまで、-80℃で保管した。分析は実施例１に記載のとおり行った。
Arabidopsis(シロイヌナズナ)のecotype C24を実施例6に記載のとおり生育させた。その植物を発芽から約21日間、適切な活性物質で処理した。適用速度は活性物質によって異なるが、例えば、除草剤のクロルスルフロンでは1000 g/ha、250 g/ha、および62.5 g/haに対応する量で試験した。処理は、0.1% Wettol LF-700(BASF AG, Germany)および1% DMSOを含有している蒸留水中に、供試物質を1.25 mg/mL、0.3125 mf/mL、および0.078 mg/mL含む溶液を用いて行った。その溶液を、3体の植物の入った、直径6 cmの3つの植木鉢に各々2回スプレーした。1-3体の植物はサンプル重量の合計で約300 mgとなるが、それらの植物を処理の24および48時間後に収穫した。対照の植物は同じやり方で活性物質を含まない溶液で処理した。処理したサンプルと対照のサンプルの代謝の分析は、実施例１に記載のとおり行った。
(a)本発明のプロセスを図にしたものを示している。第1のステップ110では、サンプルが提供される。このステップには、好ましくは、前処理が含まれる。それらの前処理は参照サンプルについても行われ、その際は参照サンプル及び供試サンプルは定められたシークエンス内で処理される。第2のステップ112では、サンプルに含まれる化合物が決定される。好ましくは、それらの化合物はまず時間分解技法で分離され、次いで化合物分析技法で決定される。このことには一次生データをさらにその後の分析のために適切な未加工な結果へとプロセスすることも含まれる。第3のステップ114では、第2のステップで得られた生の結果が分析される。その分析は、好ましくは、結果のヴァリデーションと評価を含んでなる。(b) プロセスパラメーターのモニタリングプロセスを図にしたものを示している。図1aのプロセスを示している。ステップ110の、例えば抽出および/または分画に用いた装置のプロセスパラメーターは、ステップ116でサンプルのランの間にモニターされ、適切なデータベース118中に保管される。モニターされたプロセスパラメーターはステップ116中の分析120に用いられる。 本発明の好ましい方法を図示している。参照サンプルと供試サンプルはステップ210で抽出される。ステップ212の分画によって2つの極性画分214、220、および非極性画分216、218が得られ、それらの各々は別々にLC 222および224、ならびにGC 226および228にアプライする。明細書および下記の実施例中に記載しているように、好ましくは、GC画分218、220はGCにかける前に誘導体化する。クロマトグラフィー後、LCとGCの通過物はMSの230、232、234、および236にかける。それらの生の結果はさらにステップ238で分析される。好ましくは、該分析は、生の結果のヴァリデーション、そのヴァリデートされた結果のノーマライゼーション、および結果の評価を含んでなる。 2つのアナライトについての変異型と野生型の対照の分析データを示す。(a)アナライト-1についての生の結果、(b)アナライト-1についての対数変換後のノーマライズされたデータ(ratio＿by＿WT)。 2つのアナライトについての変異型と野生型の対照の分析データを示す。、(c)アナライト-2についての生の結果、(d)アナライト-2についての対数変換後のノーマライズされたデータ(ratio＿by＿WT)。 6つの変異型および10の野生型サンプルで測定した3種のアナライトについてのデータの基づいた主成分分析の結果。(a)生の結果についてのpca、(b)対数変換後のノーマライズされたデータ(ratio＿by＿WT)についてのpca。白抜きの記号はシークエンス-1に対応し、黒の記号はシークエンス-2に対応する。円は変異型、四角は野生型である。 生物学的マーカーのプロフィールおよび分類用のサンプル。11種の干ばつストレスバイオマーカーとなりうるアナライトについての特徴的プロフィールを示している。(a)8日間の干ばつストレスを与えられた植物の中央プロフィール。 生物学的マーカーのプロフィールおよび分類用のサンプル。11種の干ばつストレスバイオマーカーとなりうるアナライトについての特徴的プロフィールを示している。(b)ストレスを欠けられていない植物の中央プロフィール。 生物学的マーカーのプロフィールおよび分類用のサンプル。11種の干ばつストレスバイオマーカーとなりうるアナライトについての特徴的プロフィールを示している。(c)分類される単一のサンプルのプロフィール(4日間の干ばつストレスをかけられた植物から得られたサンプル)。 サンプル分類のためのPLS-DAモデル。(a)ストレスをかけられていない植物20体と干ばつストレスをかけた植物10体(8日間の干ばつ)についての11種の干ばつストレスバイオマーカーとなりうるアナライトについてのノーマライズし対数変換したデータを、PLS-DAモデルの構築に用いた。(b) (a)で得られたモデルを、4日間の干ばつストレスにかけた植物から得られた単一のサンプルを分類するために用いた。球：8日間の干ばつストレスをかけたサンプル、立方体：ストレスをかけていない植物、四面体：4日間の干ばつストレスをかけたサンプル。 2種のアナライトについて、8件の薬剤投与を受けたラット(med)、8件の非処理のラット(con)の血漿サンプル、および対応する8件のプール参照品(ref)の分析で得られたデータを示している。(a)アナライト-1についての生の結果、(b)アナライト-1についての対数変換後のノーマライズされたデータ(ratio＿by＿pool)。 2種のアナライトについて、8件の薬剤投与を受けたラット(med)、8件の非処理のラット(con)の血漿サンプル、および対応する8件のプール参照品(ref)の分析で得られたデータを示している。(c)アナライト-2についての生の結果、(d)アナライト-2についての対数変換後のノーマライズされたデータ(ratio＿by＿pool)。白抜きの記号はシークエンス-1に対応し、黒の記号はシークエンス-2に対応する。オーバーラップしたポイントを見やすくするためにデータはわずかに動かしている。 8件の薬剤投与後サンプル、8件の非処理対照サンプル、および8件のプール参照品サンプルで測定した215のアナライトについてのデータの基づいた主成分分析の結果。(a)生の結果についてのpca、(b)対数変換後のノーマライズされたデータ(ratio＿by＿pool)についてのpca。白抜きの記号はシークエンス-1に対応し、黒の記号はシークエンス-2に対応する。球は変異型、立方体は野生型、四面体：プール参照品である。 生物学的マーカーのプロフィールおよび分類用のサンプル。15種の薬剤-1バイオマーカーとなりうるアナライトについての特徴的プロシールを示している。(a)薬剤-1サンプルの中央プロフィール、(b)非処理の対照サンプルの中央プロフィール、(c)薬剤-2からの単一のサンプルのプロフィール、(d)薬剤-3からの単一のサンプルのプロフィール。 サンプル分類のためのPLS-DAモデル。(a)54件の非処理対照サンプルと14件の薬剤-1サンプルについて、15種の薬剤-1バイオマーカーとなりうるアナライトについてのノーマライズし対数変換したデータを、PLS-DAモデルの構築に用いた。(b) (a)で得られたモデルを、薬剤-2から得られた単一のサンプル、および薬剤-3から得られた単一のサンプルを分類するために用いた。黒の球：薬剤-1サンプル、黒の立方体：非処理の対照サンプル、白抜きの球：薬剤-2サンプル、白抜きの四面体：薬剤-3サンプル。 少なくとも1種の化合物を含んでいるサンプルを特徴付けている、3次元で表した第1のデータセットの座標システムを示している。参照番号は実施例中で説明している。 3次元で表した第1のデータセットの例を示している。 特異的プロフィールを作るための原理を図示している。1つの特異的な質量変数インターバルについての抽出されたシグナルと、それに続くTS1における曲線下の領域の統合による特性値の生成の1例を示している。 プロセスステップ238の一部としての多変量解析の第1の例を示している。とりわけ、この図では主要コンポーネント分析(PCA)の結果の、変数のANOVA プリセレクション(スライス)に基づいた3次元的可視化を示している。種々の薬剤投与を行ったラットから得られた血漿に基づいた解析：非処理の対照ラット(四面体)、処理-1(球)、処理-2(立方体)、軸は最初の3つのスコア/主要コンポーネント(t-1、t-2、およびt-3)を示している プロセスステップ238の一部としての多変量解析の第2の例を示している。とりわけ、この図では図14で示した解析に対応するローディングの3次元的可視化を示しており、軸は最初の3つのローディング(p-1、p-2、およびp-3)を示している。

Claims (45)

  1. 少なくとも1つの供試サンプルを分析する方法であって、該供試サンプルが少なくとも1種の化合物を含んでなり、該方法が：
    a) 少なくとも1種の化合物を含んでなる少なくとも1つの供試サンプルを提供し；
    b) 該供試サンプル中の該少なくとも1種の化合物をクロマトグラフィーを連結した質量分析を用いて測定し、それによって一次生データが生成され；
    c) ステップb)で得られた一次生データから次の手順で生の結果を生成する：(i)保持関連の次元、質量関連の次元、および強度関連の次元を含む一次生データのデコンボリューションおよびそのデコンボリューションされた一次生データの、参照スペクトルおよび参照リテンションインデックスを用いた化合物へのアロケーション、ならびに(ii)あらかじめ定めたイオン質量と時間窓を用いてシグナルの強度と保持時間を上記少なくとも1種の化合物にアロケートする、
    d) ステップc)で得られた生の結果を分析し、該分析は、ヴァリデートされた結果がそれによって生成されたルールに基づいて生の結果を確認または無効とすることのできるヴァリデーションツールを用いた該生の結果のヴァリデーションを含んでいる、
    ステップを含んでなり、
    該少なくとも1つの供試サンプルの分析は少なくとも1つの参照サンプルの分析を伴って行われるものであり；
    供試サンプルおよび参照サンプルは、この方法の各ステップにおいて一緒に分析されることになるサンプルの集まりであるシークエンスの全く同一の順序で分析され；
    この方法は自動化によってアシストされる、
    方法。
  2. ルールが次のルール：
    (a) ステップc)中の手順(i)および(ii)によって得られる生の結果の各々について、ある化合物の生の結果について得られた保持時間(RT)があらかじめ定めておいた限度値以内であるか否かを定めること、もしもその保持時間が限度外である場合にはその生の結果は無効となる；
    (b) ステップc)中の手順(i)および(ii)によって得られる生の結果の各々について、ある化合物の該生の結果のマススペクトルのマッチの質があらかじめ定めておいた参照の結果と比較して、あらかじめ定めた限度値を超えるか否かを定めること、もしもそのマッチの質が限度値以下である場合にはその生の結果は無効となる；
    (c) ステップc)中の手順(i)および(ii)によって得られる生の結果の各々について、ある化合物の生の結果について得られたリテンションインデックス(RI)があらかじめ定めておいた限度値以内であるか否かを定めること、もしもそのリテンションインデックスが限度外である場合にはその生の結果は無効となる；
    (d) ステップc)中の手順(i)および(ii)によって得られる生の結果の各々について、ある化合物の生の結果が、ノーマライゼーションに用いられることとなる化合物のヴァリデートされた生の結果にアロケートされるか否かを定めること、もしもそのノーマライゼーションに用いられる化合物の生の結果が無効であるならば、そこにアロケートされた生の結果も無効となる、
    を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. 方法がさらに：
    (a) 手順(i)で得られた、ある化合物の生の結果について与えられた保持時間(RT1)と、手順(ii)で得られた、同一の生の結果について与えられた保持時間(RT2)が、同じではないことを定め、その生の結果を無効とする；
    (b) 手順(i)で得られた、ある化合物の生の結果について与えられたリテンションインデックス(RI1)と、手順(ii)で得られた、同一の生の結果について与えられたリテンションインデックス(RI2)が、同じではないことを定め、その生の結果を無効とする；
    (c) ステップd)において、ある化合物へのアロケートにより2つ以上の生の結果が得られた場合には、ルールデータベースに含まれているその他のルールを適用した後に、各生の結果のデータポイントを結んで作成した曲線下面積で最も大きな値を有する生の結果を用いる；
    (d) ステップc)の手順(i)および(ii)で得られた生の結果の各々について、リニアモデリング用のリテンションインデックススタンダードに基づいて、生の結果のリテンションインデックスがあらかじめ定めた限界値以内であるか否かを定め、もし外挿したリテンションインデックスの値が限界値を外れていた場合には、その生の結果を無効とする；
    (e) ステップc)の手順(i)および(ii)で得られた生の結果の各々について、ある化合物の生の結果が、あらかじめ定めた保持時間またはリテンションインデックスの範囲内にありあらかじめ定めた溶出の順であるあらかじめ定めた有効な隣接する生の結果を有するか否かを定め、もしそのような有効な隣接する生の結果が存在していないならば、その生の結果を無効とする；
    (f) ステップc)の手順(ii)で得られた生の結果の各々について、生の結果のデータポイントによって作成した曲線下面積が負の値でないかを定め、それによって負の値を有する生の結果を無効とする、
    からなる群から選択された、少なくとも1つのルールを含んでなる、請求項２に記載の方法。
  4. 分析がさらに、ヴァリデートされた結果のセットに基づいて供試サンプルについての特異的プロフィールを生成させることを含んでなる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 少なくとも1つの供試サンプルを分析する方法であって、該供試サンプルが少なくとも1種の化合物を含んでなり、該方法が、
    a) 少なくとも1種の化合物を含んでなる少なくとも1つの供試サンプルを提供し；
    b) 該供試サンプル中の該少なくとも1種の化合物をクロマトグラフィーを連結した質量分析を用いて測定し、それによって一次生データが生成され；
    c) ステップb)で得られた一次生データから次の手順で生の結果を生成する：(i)保持関連の次元、質量関連の次元、および強度関連の次元を含む一次生データのデコンボリューションおよびそのデコンボリューションされた一次生データの、参照スペクトルおよび参照リテンションインデックスを用いた化合物へのアロケーション、ならびに(ii)あらかじめ定めたイオン質量と時間窓を用いてシグナルの強度と保持時間を上記少なくとも1種の化合物にアロケートする、
    d) ステップc)で得られた生の結果を分析し、該分析が、該生の結果に基づいて供試サンプルについての特異的なプロフィールを生成することを含んでいる、
    ステップを含んでなり、
    該少なくとも1つの供試サンプルの分析は少なくとも1つの参照サンプルの分析を伴って行われるものであり；
    供試サンプルおよび参照サンプルは、この方法の各ステップにおいて一緒に分析されることになるサンプルの集まりであるシークエンスの全く同一の順序で分析され；
    自動化によってこの方法がアシストされる、
    方法。
  6. 少なくとも1つの参照サンプルが、
    a. 少なくとも1つの供試サンプルの一部分を含んでいる参照サンプル
    b. 定義された参照スタンダードを複数含んでいる参照サンプル
    c. 参照サンプル(a)の一部分および参照サンプル(b)の一部分を含んでいる参照サンプル
    からなる群から選択されたものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 上記シークエンスの順序が、サンプルの分析前に、該シークエンスの順序内での少なくとも1つの供試サンプルと少なくとも1つの参照サンプルのランダムポジショニングによって確立されている、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. ステップd)の該分析が、参照サンプルについて得られたヴァリデートされた生の結果に対して少なくとも1つの供試サンプルのヴァリデートされた生の結果のノーマライゼーションを含んでなる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 方法がさらに、該方法についてのプロセスパラメーターのモニターを含んでなる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 方法がさらに、モニターされたプロセスパラメーターに基づいて生の結果を確認するか、または無効とすることを含んでなる、請求項９に記載の方法。
  11. クロマトグラフィーが液体クロマトグラフィーである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. クロマトグラフィーがガスクロマトグラフィーである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
  13. 方法が、ステップb)の前に、少なくとも1つの供試サンプルを、極性化合物を含んでなる少なくとも1つの第1の画分と、非極性化合物を含んでなる少なくとも1つの第2画分へとさらに分画するステップをさらに含んでなる、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 分画が、供試サンプルの各々を、タンパク質またはアミノ酸を含んでなる少なくとも1つの第3の画分にさらに分画することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
  15. ステップa)の提供が、少なくとも1つの供試サンプルに含まれている少なくとも1種の化合物を抽出することを含んでなる、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 少なくとも1つの供試サンプルが、本質的に同一のメタボロームを有している1生物体または複数の生物体由来のものである、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 生物体が植物、動物、真菌、または細菌である、請求項１６に記載の方法。
  18. 供試サンプルが、細胞、組織、または器官由来のものである、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 供試サンプルが、体液由来のものである、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
  20. 体液が、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、汗、精液、膣液、涙液、糞便、または尿である、請求項１９に記載の方法。
  21. 方法が、ステップd)の分析結果を含んでいるアウトプット結果セットを提供するステップをさらに含んでなる、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 分析が、少なくとも2つのベクトルを相関させる、および/または比較するステップを含んでなり、その少なくとも2つのベクトルのうちの少なくとも1つが、そのベクトルの成分についての縮退プロセスに、その成分の信頼性を考慮に入れつつかけられる、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 分析が、少なくとも2つのベクトルを相関させる、および/または比較するステップを含んでなり、1つの成分についてのマッチ-ミスマッチスコアリングが行われ、マッチスコアおよびミスマッチスコアが生成され、好ましくはそれらのスコアのランク付けを用いることによってマッチスコアとミスマッチスコアが別々に考慮される、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 分析が、有意なヴァリデートされた結果を選択し、少なくとも1つの供試サンプルを分類するステップを含んでなる、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 少なくとも1つの第1のサンプルに特異的な特質を決定するための方法であって、
    a) 少なくとも1つの第1のサンプルについて請求項２１に記載の方法で得られたアウトプット結果のセットを、少なくとも1つの第2のサンプルについて請求項２１に記載の方法で得られたアウトプット結果のセットと比較し；
    b) ステップa)の比較に基づいて、該第1のサンプルに特異的な特質を決定するが、アウトプット結果のセットの差異が該第1のサンプルに特異的な特質を示すものである、
    方法。
  26. 少なくとも1つの第1のサンプルおよび少なくとも1つの第2のサンプルについて共通の特質を決定するための方法であって、
    a) 少なくとも1つの第1のサンプルについて請求項２１に記載の方法で得られたアウトプット結果のセットを、少なくとも1つの第2のサンプルについて請求項２１に記載の方法で得られたアウトプット結果のセットと比較し；
    b) ステップa)の比較に基づいて、少なくとも1つの第1のサンプルと少なくとも1つの第2のサンプルについての共通の特質を決定するが、アウトプット結果のセットの類似性が該共通の特質を示すものである、
    方法。
  27. 比較が、少なくとも2つのベクトルを相関させる、および/または比較するステップを含んでなり、その少なくとも2つのベクトルのうちの少なくとも1つが、そのベクトルの成分についての縮退プロセスに、その成分の信頼性を考慮に入れつつかけられる、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 比較が、少なくとも2つのベクトルを相関させる、および/または比較するステップを含んでなり、1つの成分についてのマッチ-ミスマッチスコアリングが行われ、マッチスコアおよびミスマッチスコアが生成され、好ましくはそれらのスコアのランク付けを用いることによってマッチスコアとミスマッチスコアが別々に考慮される、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 比較が、有意なヴァリデートされた結果を選択し、少なくとも1つの供試サンプルを分類するステップを含んでなる、請求項２５から２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 生物体に対して適用される処理によって生じる影響を決定するための方法であって、請求項２５から２９のいずれか１項に記載の方法のステップ、およびさらに該生物体の第1のサンプルについて決定された特質に基づいて影響を決定するステップを含んでなる、方法。
  31. 処理が、生物体の遺伝子の改変、化合物の投与、物理的処理、環境条件の変化、生物体に適用される照射、または該処理の組み合わせである、請求項３０に記載の方法。
  32. 第1のサンプルに特異的なバイオマーカーを決定するための方法であって、請求項２５から２９のいずれか１項に記載の方法のステップ、およびさらに該第1のサンプルについて決定された特質に基づいてバイオマーカーを決定するステップを含んでなる、方法。
  33. 生物体に投与された化合物の作用機作を決定するための方法であって、請求項２５から２９のいずれか１項に記載の方法のステップ、およびさらに該生物体の第1のサンプルについて決定された特質に基づいて該化合物の作用機作を決定するステップを含んでなる、方法。
  34. 生物体が植物であり、該化合物が除草作用のある化合物である、請求項３３に記載の方法。
  35. 生物体が虫であり、該化合物が殺虫作用のある化合物である、請求項３３に記載の方法。
  36. 生物体が植物病原性の真菌であり、該化合物が殺真菌作用のある化合物である、請求項３３に記載の方法。
  37. 請求項１から３６のいずれか１項に記載の方法を行うためのシステムであって、
    a) 化合物を測定する手段；
    b) プロセスのパラメーターをモニターする手段；
    c) (a)の手段から得られた生の結果を分析する手段であって、生の結果を分析するための該手段は：
    (i) a)の手段から受け取った生の結果を含んでなる第1のデータベース；
    (ii) モニターされたプロセスパラメーターを含んでなる第2のデータベース；
    (iii) その生の結果をヴァリデートするためのルールを含んでなる第3のデータベース；
    (iv) 同定された化合物のアロケートされた結果を含んでなる第4のデータベース；および
    (v) 該第3のデータベースに含まれているルールに基づいて生の結果を確認または無効と判定することのできるヴァリデーションツール；
    を含んでなり、
    少なくとも第2、第3、および第4のデータベースは機能しうる形で第1のデータベースと連結されており、
    上記手段は機能しうる形で互いに連結されている、
    システム。
  38. 第1および第4のデータベースが、第1のデータベースの生の結果が、評価後に、同定された化合物についてのアロケートされた結果として、第4のデータベース中に含まれることとなるように、お互いに機能しうる形で連結されている、請求項３７に記載のシステム。
  39. 生の結果を分析するための手段が、
    (v) 少なくとも1つの他のデータベースと機能しうる形で連結された少なくとも1つの特異的サンプル識別子に関連する情報を含んでなる第5のデータベース、
    を含んでなる、請求項３７または３８に記載のシステム。
  40. 特異的サンプル識別子が、サンプル数、サンプルの起原、サンプルのソース、サンプルの処理、サンプルのラン、およびサンプルのアリコートからなる群から選択されたものである、請求項３９に記載のシステム。
  41. 生の結果を分析するための手段が、
    (vi) 少なくとも1つの他のデータベースと機能しうる形で連結された識別子に関連する生化学的情報を含んでなる第6のデータベース、
    を含んでなる、請求項３７から４０のいずれか１項に記載のシステム。
  42. 化合物を測定するための手段が、質量分析装置を含んでなる、請求項３７から４１のいずれか１項に記載のシステム。
  43. 測定のための手段が、さらに、液体クロマトグラフィー、および/またはガスクロマトグラフィーの装置を含んでなる、請求項４２に記載のシステム。
  44. サンプルを分画するための手段をさらに含んでなる、請求項３７から４３のいずれか１項に記載のシステム。
  45. 抽出するための手段をさらに含んでなる、請求項３７から４４のいずれか１項に記載のシステム。
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