CN109696511B - 基于gc-ms获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法 - Google Patents

基于gc-ms获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于GC‑MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法；所述方法基于气相色谱‑高分辨率质谱联用系统进行玉米叶片代谢轮廓分析，然后用多变量统计方法区分转基因和非转基因玉米数据，并对转基因和非转基因玉米叶片代谢差异进行研究的方法，获取对代谢表型差异有重要贡献的化合物。所述方法更适合快速色谱分析，可以快速可靠地识别、定量和确认更多化合物；更重要的是，其检测分辨率高，保证谱峰扫描点的完整性，不遗漏任何细节，实现高效可靠的代谢物信息识别，得到的结果更真实可靠。所述方法可以为深入研究转基因玉米的安全性提供根据。

Description

基于GC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体涉及基于GC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法。
背景技术
随着转基因技术的飞速发展以及转基因玉米的大面积推广应用，在关注转基因玉米所带来的巨大的社会、经济和生态效益的同时，转基因玉米及其产品的安全性问题也引起了世界范围内的广泛关注，在发展我国农业生物技术的同时，对转基因玉米及其产品的安全性加强监督非常重要。对转基因玉米的安全性评价主要从两个方面来考虑：一个是环境安全性，一个是食用安全性。随着转基因玉米大面积商业化种植，人们对其潜在的生态环境危害尤其是转基因食品对消费者的食用安全性表示担忧。1993年经济合作与发展组织提出了实质等同性原则，即如果转基因食品在组成、营养价值、拟议用途上没有变化，那么可以认为它与非转基因食品是等同的。此后实质等同性原则被广泛应用于转基因产品的安全性评价、审批、监管。
目前，代谢组学方法已成为转基因产品安全评估的重要工具。在代谢组学的研究中，已经建立的方法包括气-质联用(GC-MS)、液相层析串联质谱(LC-MS)、核磁共振和傅里叶变换质谱(FT-MS)等分析技术。其中，GC-MS分析方法长期以来被用于植物和微生物的代谢物谱图分析，可被视为对代谢物分析的黄金标准。这项技术的主要优点是具有高灵敏度和分析覆盖面宽广，是代谢组学研究的核心方法之一，适合分析挥发性有机物和亲水性代谢物。但目前由于GC-MS预处理过程分多步进行，样品准备过程中容易引入误差；气质分析平台精确度低，且操作复杂，费时费力，成本较高，使得一次性获得的化合物信息较少，不能有效地完成转基因非预期效应的高通量检测。
发明内容
本发明的目的在于，提供基于GC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法；即，建立一种基于气相色谱-高分辨率质谱联用系统进行玉米叶片代谢轮廓分析，并对转基因和非转基因玉米叶片代谢差异进行研究的方法。
所述方法采用Agilent 7890B气相色谱与LECO PEGASUS HT质谱联用分析平台对玉米叶片提取液进行分析，得到玉米叶片代谢轮廓，然后用多变量统计方法区分转基因和非转基因玉米数据，获得对代谢表型差异有重要贡献的化合物。与传统方法相比，该分析平台更适合快速色谱分析，可以快速可靠地识别、定量和确认更多化合物；更重要的是，其检测分辨率高，保证谱峰扫描点的完整性，不遗漏任何细节，实现高效可靠的代谢物信息识别，得到的结果更真实可靠。
所述方法包括如下步骤：
1)取转基因玉米和非转基因玉米叶片，粉碎至碎末状，然后进行提取，并加入内标物，获得含有内标物的待测样品；
2)将所述待测样品进行GC-MS检测，获得所述转基因玉米和非转基因玉米的代谢物原始谱图信息；
3)采用LC-MS数据处理软件对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行提取，然后再采用正交偏最小二乘法-判别分析的统计方法进行分析，获得代谢指纹数据；
4)根据步骤3)获得代理指纹数据进行建模，获得OPLS-DA模型；
5)根据所述OPLS-DA模型，获得转基因和非转基因玉米的差异代谢物。
其中，所述转基因玉米为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米；
所述非转基因玉米为TJ806非转基因玉米。
本发明所述方法具有检测分辨率高、操作简单的优点，在提高灵敏度的同时又节省了时间，降低了成本。所述方法可以为深入研究转基因玉米的安全性提供根据。
为进一步提高该方法灵敏度和效率等优势，本发明提供下述优选方案。
本发明进一步提出的，步骤1)具体为：取5～6叶期的玉米嫩叶，采用液氮，研磨至碎末状，获得碎末样品；将所述碎末样品加入提取液中，并加入内标物；在40～50Hz的条件下，研磨3～5min；然后在冰水浴中超声4～6min；重复研磨、冰水浴的步骤3次，再低温静置20～40min，高速离心后，弃掉上清液体，保留下层沉淀，将沉淀物干燥处理，然后再进行孵育处理，获得含有内标物的待测样品；
更优选的，所述提取液为体积比为3.5～4.5:1的甲醇和水。
优选的，所述碎末样品于所述提取液的固液比为100～150:1(g/L)。
优选的，所述内标物为质量比为1:1.5～2.5核糖醇和L-2-氯苯丙氨酸。所述核糖醇的浓度为0.4～0.6mg/mL，所述L-2-氯苯丙氨酸的浓度为0.9～1.1mg/mL。
所述内标物的加入按照常规方式加入，如0.4mL提取液中加入10mL内标物。
优选的，所述研磨采用常规的研磨仪；进一步优选的，研磨过程中，加入的大磁珠直径为5mm，小磁珠直径为3mm。
优选的，所述低温静置采用常规的低温方式，如-40℃。
优选的，所述高速离心采用本领域常规方式进行，如13000rpm，4℃离心15min。
优选的，所述孵育处理具体为：在干燥后的样品中加入甲氧胺盐试剂，孵育25～35min，然后再加入含有0.8～1.2％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，在60～80℃的温度下，孵育1～2小时，离心，取上清液。
更优选的，所述孵育处理具体为：在干燥后的样品中加入50μL甲氧胺盐试剂(甲氧胺盐酸盐，溶解于吡啶，浓度为20mg/mL)，孵育25～35min，然后再加入含有1.0％三甲基氯硅烷(TMCS)的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)，在60～80℃的温度下，孵育1～2小时，离心，取上清液。
本发明进一步提出的，步骤2)中，所述GC-MS检测的条件具体为：
(1)毛细管柱：Agilent DB-5MS(30m×250μm×0.25μm)。
(2)进样量0.8～1.2μL。
(3)GC-MS检测参数如下：
分流模式：Splitless Mode
隔垫吹扫流速：2.5～3.5mL/min
载气：Helium
柱流速：0.8～1.2mL/min
柱箱升温程序：50℃(1min)-310℃(8～12℃/min)，6～10min
前进样口温度：270～290℃
传输线温度：270～290℃
离子源温度：240～260℃
电离电压：-65～-75eV
质量范围：m/z:50-500
扫描速率：18～22spectra per second
溶剂延迟时间：6～6.5min；
优选的，所述GC-MS检测参数如下：
分流模式：Splitless Mode
隔垫吹扫流速：3mL/min
载气：Helium
柱流速：1mL/min
柱箱升温程序：50℃(1min)-310℃(10℃/min),8min
前进样口温度：280℃
传输线温度：280℃
离子源温度：250℃
电离电压：-70eV
质量范围：m/z:50-500
扫描速率：20spectra per second
溶剂延迟时间：6.27min
更优选的，质谱检测过程中还包括校验，所述校验具体为：将所述待测样品的混合物作为QC样，先将所述QC样进样一次，然后每分析3～6个待测样品后，再将所述QC样进样一次。通过保证QC样总离子流图的重复性确保实验过程中气相色谱质谱联用仪有较好的稳定性。
本发明进一步提出的，步骤3)中，采用XCMS处理软件对代谢物原始谱图信息进行提取。
所述校验具体为：采用LC-MS数据处理软件XCMS对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息，进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理。
本发明进一步提出的，步骤5)中，卡值标准为T检验(Student’s t-test)的P值(P-value)小于0.05，并且OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度(Variable Importancein the Projection,VIP)大于1的化合物为转基因玉米和非转基因玉米的差异代谢物。符合卡值标准的化合物即为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米(TJ806)与TJ806非转基因玉米的差异代谢物。
本发明提供一种优选方案，所述方法包括如下步骤：
1)取5～6叶期的玉米嫩叶，采用液氮，研磨至碎末状，获得碎末样品；将所述碎末样品加入提取液中，并加入内标物；在40～50Hz的条件下，研磨3～5min；然后在冰水浴中超声4～6min；重复研磨、冰水浴的步骤3次，再低温静置20～40min，高速离心后，弃掉上清液体，保留下层沉淀，将沉淀物干燥处理，在样品中加入甲氧胺盐试剂，孵育25～35min，然后再加入含有0.8～1.2％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，在60～80℃的温度下，孵育1～2小时，离心，取上清液，获得含有内标物的待测样品；
其中，所述提取液为体积比为3.5～4.5:1的甲醇和水；所述内标物为质量比为1:1.5～2.5核糖醇和L-2-氯苯丙氨酸；
2)将所述待测样品进行GC-MS检测，获得所述转基因玉米和非转基因玉米的代谢物原始谱图信息；
其中，所述GC-MS检测的条件具体为：
(1)毛细管柱：Agilent DB-5MS；
(2)进样量0.8～1.2μL；
(3)GC-MS检测参数如下：
分流模式：Splitless Mode
隔垫吹扫流速：3mL/min
载气：Helium
柱流速：1mL/min
柱箱升温程序：50℃(1min)-310℃(10℃/min),8min
前进样口温度：280℃
传输线温度：280℃
离子源温度：250℃
电离电压：-70eV
质量范围：m/z:50-500
扫描速率：20spectra per second
溶剂延迟时间：6.27min
优选的，质谱检测过程中还包括校验，所述校验具体为：将所述待测样品的混合物作为QC样，先将所述QC样进样一次，然后每分析3～6个待测样品后，再将所述QC样进样一次。
3)采用LC-MS数据处理软件XCMS对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理；然后再采用正交偏最小二乘法-判别分析的统计方法进行分析，获得代谢指纹数据；
4)根据步骤3)获得代理指纹数据进行建模，获得OPLS-DA模型；
5)根据所述OPLS-DA模型，卡值标准为T检验的P值小于0.05，并且OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度大于1的化合物为转基因玉米和非转基因玉米的差异代谢物。
本发明的又一目的在于，提供一种基于上述方法的在转基因玉米安全评价中的应用。
本发明建立的一种基于GC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法。样本前处理过程简单、快速，引入的误差小。与传统方法相比，该分析平台更适合快速色谱分析，可以快速可靠地识别、定量和确认更多化合物；更重要的是，其检测分辨率高，保证谱峰扫描点的完整性，不遗漏任何细节，实现高效可靠的代谢物信息识别，得到的结果更真实可靠。同时，样本预处理过程中加入内标，校正预处理过程和仪器运行过程中响应微小漂移带来的误差。样本序列分析过程中插入由所有样本混合的质量控制(QC)样本，通过对QC样本总离子流图的监控，可以检测分析序列中仪器响应有无漂移，确保了实验数据的可靠性。本发明基于GC-MS筛选出多个对分类有重要贡献的化合物，可以为转基因植物的非预期效应和安全性评价提供依据。
附图说明
图1为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米与TJ806非转基因玉米叶片样本GC-MS代谢轮廓对比图；
图2为OPLS-DA模型得分散点图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种基于GC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法，所述方法包括如下步骤：
一)待测样品的准备：
1)将长至5-6叶期的转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米(TJ806)及TJ806非转基因玉米嫩叶片收集，并迅速冷冻于液氮中，储存于-80℃冰箱中备用；
2)将从低温冰箱中取出的叶片快速地置于液氮预冷的研钵中；倒入少许液氮，用预冷的捣杵进行研磨，直至叶片呈碎末状态；
3)称量50±1mg的碎末样品，置于2mL离心管中，将装有样品的离心管置于冰上；在样品离心管中加入一大一小两粒研磨磁珠。大磁珠直径为5mm，小磁珠直径为3mm；
4)每个样品管中加入4.5mL提取液(甲醇：水的体积例＝4:1)；
5)每个样品管中加入10μL内标混合液(0.5mg/mL核糖醇和1mg/mL L-2-氯苯丙氨酸)；
6)将样品管置于研磨仪上进行研磨(45Hz，4min)；然后在冰水浴中超声5min；重复研磨、冰水浴的步骤3次，再将样品管置于-40℃冰箱中静置半小时；静置结束后，以13000rpm的转速，4℃的温度下，离心15min，弃掉上清液体，保留下层沉淀；
7)42℃进行干燥，在干燥后的样品中加入80μL甲氧胺盐试剂(20mg/mL)，80℃孵育30min；
8)加入含有1％三甲基氯硅烷(TMCS)的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)100μL，70℃孵育1.5小时；离心，取上清液，获得含有内标物的待测样品；
二)将所述待测样品进行GC-MS检测，获得所述转基因玉米和非转基因玉米的代谢物原始谱图信息；
其中，所述GC-MS检测的条件具体为：
(1)毛细管柱：Agilent DB-5MS(30m×250μm×0.25μm)；
(2)进样量1μL；
(3)GC-MS检测参数如下：
表1. GC-MS检测参数
项目 参数
分流模式 Splitless Mode
隔垫吹扫流速 3mL/min
载气 Helium
柱流速 1mL/min
柱箱升温程序 50℃(1min)-310℃(10℃/min),8min
前进样口温度 280℃
传输线温度 280℃
离子源温度 250℃
电离电压 -70eV
质量范围 m/z:50-500
扫描速率 20spectra per second
溶剂延迟时间 3mL/min
质谱检测过程中还包括校验，所述校验具体为：将所述待测样品的混合物作为QC样，先将所述QC样进样一次，然后每分析3～6个待测样品后，再将所述QC样进样一次，通过保证QC样总离子流图的重复性确保实验过程中气相色谱质谱联用仪有较好的稳定性；
3)采用LC-MS数据处理软件XCMS对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理；然后再采用正交偏最小二乘法-判别分析的统计方法进行分析，获得代谢指纹数据；
4)根据步骤3)获得代理指纹数据进行建模，获得OPLS-DA模型；
5)根据所述OPLS-DA模型，卡值标准为T检验的P值小于0.05，并且OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度大于1的化合物为转基因玉米和非转基因玉米的差异代谢物。符合卡值标准的化合物即为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米(TJ806)与TJ806非转基因玉米的差异代谢物；
获得7个转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米(TJ806)与TJ806非转基因玉米的差异代谢物，见表2。
表2差异代谢物筛选表
ID Peak Similarity rt VIP P_VALUE
131 乙醇胺 944 10.2151 2.1 0.0057
480 亚麻酸 939 20.8588 2.7 0.0007
251 α-酮戊二酸 932 14.2555 1.7 0.0430
571 纤维二糖1 901 24.6012 2.0 0.0150
478 亚油酸 882 20.786 2.3 0.0046
95 磷酸甲酯 858 8.99901 2.2 0.0016
536 尿苷2 848 22.7229 1.3 0.0260
表2为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米(TJ806)与TJ806非转基因玉米的差异代谢物。ID为物质在本次定性匹配中得到的唯一编号；Peak为物质在数据库中的名称；Similarity为该物质与质谱检测峰的匹配度打分值；rt为保留时间；VIP为来自OPLS-DA模型的VIP值；P_VALUE为来自t-test的P值。
图1为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米(TJ806)与TJ806非转基因玉米叶片样本GC-MS代谢轮廓对比。
其中，A为TJ806非转基因玉米样本的总离子流图(TIC图，上方图)；B为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米(TJ806)样本的总离子流图(TIC图，下方图)。两者的差异在于，在同一时间段出现的峰不同(箭头所示)
图2为OPLS-DA模型得分散点图。横坐标t[1]P表示第一主成分的预测主成分得分，纵坐标t[1]O表示正交主成分得分，t表示样本在主成分投影值；■为非转基因样本，●为转基因样本，每个点表示一个样品。从OPLS-DA得分图的结果可以看出，两组样本区分非常显著，样本全部处于95％置信区间内。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种基于GC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取转基因玉米和非转基因玉米叶片，粉碎至碎末状，然后进行提取，并加入内标物，获得含有内标物的待测样品；
2)将所述待测样品进行GC-MS检测，获得所述转基因玉米和非转基因玉米的代谢物原始谱图信息；
3)采用GC-MS数据处理软件对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行提取，然后再采用正交偏最小二乘法-判别分析的统计方法进行分析，获得代谢指纹数据；
4)根据步骤3)获得代理指纹数据进行建模，获得OPLS-DA模型；
5)根据所述OPLS-DA模型，获得转基因和非转基因玉米的差异代谢物；
所述步骤1)具体为：取5～6叶期的玉米嫩叶，采用液氮，研磨至碎末状，获得碎末样品；将所述碎末样品加入提取液中，并加入内标物；在40～50Hz的条件下，研磨3～5min；然后在冰水浴中超声4～6min；重复研磨、冰水浴的步骤3次，再低温静置20～40min，高速离心取下层沉淀，干燥处理，然后再进行孵育处理，获得含有内标物的待测样品；
所述提取液为体积比为4:1的甲醇和水的混合物；所述内标物为质量比为1:1.5～2.5核糖醇和L-2-氯苯丙氨酸；
所述孵育处理具体为：在干燥后的样品中加入甲氧胺盐试剂，孵育25～35min，然后再加入含有0.8～1.2％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，在60～80℃的温度下，孵育1～2小时，离心，取上清液；
(1)毛细管柱：Agilent DB-5MS；
(2)进样量0.8～1.2μL；
(3)GC-MS检测参数如下：
所述GC-MS检测参数如下：
分流模式：Splitless Mode
隔垫吹扫流速：3mL/min
载气：Helium
柱流速：1mL/min
柱箱升温程序：50℃，1min-310℃，10℃/min，8min
前进样口温度：280℃
传输线温度：280℃
离子源温度：250℃
电离电压：-70eV
质量范围：m/z:50-500
扫描速率：20spectra per second
溶剂延迟时间：6.27min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱检测过程中还包括校验，所述校验具体为：将所述待测样品的混合物作为QC样，先将所述QC样进样一次，然后每分析3～6个待测样品后，再将所述QC样进样一次。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述校验具体为：采用GC-MS数据处理软件XCMS对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息，进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述OPLS-DA中，卡值标准为T检验的P值小于0.05，并且OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度大于1的化合物为转基因玉米和非转基因玉米的差异代谢物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取5～6叶期的玉米嫩叶，采用液氮，研磨至碎末状，获得碎末样品；将所述碎末样品加入提取液中，并加入内标物；在40～50Hz的条件下，研磨3～5min；然后在冰水浴中超声4～6min；重复研磨、冰水浴的步骤3次，再低温静置20～40min，高速离心取下层沉淀，干燥处理，在样品中加入甲氧胺盐试剂，孵育25～35min，然后再加入含有0.8～1.2％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，在60～80℃的温度下，孵育1～2小时，离心，取上清液，获得含有内标物的待测样品；
其中，所述提取液为体积比为4:1的甲醇和水；所述内标物为质量比为1:1.5～2.5核糖醇和L-2-氯苯丙氨酸；
2)将所述待测样品进行GC-MS检测，获得所述转基因玉米和非转基因玉米的代谢物原始谱图信息；
其中，所述GC-MS检测的条件具体为：
(1)毛细管柱：Agilent DB-5MS；
(2)进样量0.8～1.2μL；
(3)GC-MS检测参数如下：
分流模式：Splitless Mode
隔垫吹扫流速：3mL/min
载气：Helium
柱流速：1mL/min
柱箱升温程序：50℃，1min-310℃，10℃/min，8min
前进样口温度：280℃
传输线温度：280℃
离子源温度：250℃
电离电压：-70eV
质量范围：m/z:50-500
扫描速率：20spectra per second
溶剂延迟时间：6.27min
3)采用GC-MS数据处理软件XCMS对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理；然后再采用正交偏最小二乘法-判别分析的统计方法进行分析，获得代谢指纹数据；
4)根据步骤3)获得代理指纹数据进行建模，获得OPLS-DA模型；
5)根据所述OPLS-DA模型，卡值标准为T检验的P值小于0.05，并且OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度大于1的化合物为转基因玉米和非转基因玉米的差异代谢物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，质谱检测过程中还包括校验，所述校验具体为：将所述待测样品的混合物作为QC样，先将所述QC样进样一次，然后每分析3～6个待测样品后，再将所述QC样进样一次。
7.根据权利要求1～6任一项所述方法在转基因玉米安全评价中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，转基因玉米为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米。
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