CN109187806A - 一种液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法 - Google Patents
一种液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种液相色谱‑质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其包括,将所述2‑氯苯丙氨酸代替溶剂对样本进行提取,保证每个样本中内标的浓度一致,采集数据,在数据采集过程中,通过2‑氯苯丙氨酸峰面积和保留时间反映实际样本的采集情况。本发明通过用2‑氯苯丙氨酸作为通用内标代替溶剂来提取样本,能够准确监控样本采集情况,排除采集有问题的样本,避免发生错检,并将17个混标作为通用质控品监控仪器波动状态,大大简化了高通量代谢组学检测中繁琐的操作和复杂的信号分析、数据处理的问题,并使得检测结果更加准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于代谢组学检测技术领域,具体涉及一种液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法。
背景技术
液相色谱-质谱联用(LC-MS)具有高分辨能力,高灵敏度,适合高沸点、热不稳定及高分子量化合物的检测等优点,被广泛应用于代谢组学的检测。广泛靶向代谢组学检测技术利用ABSciex公司三重四极杆质谱,可在一针的采集时间里同时检测上千种物质,但由于人员、样本、环境、仪器等多方面的原因,在数据采集过程中会出现少数样本采集不好的情况,仪器响应降低,保留时间偏移等,导致采集数据不可用,需要剔除采集不好的样本甚至整批样本重采。在跑样过程中,一般需要打开每个样本的采集数据查看对应每个样本的采集情况,费时费力且容易遗漏有问题的样本。因此,如何提供一种能够快速判断样本的采集情况的通用质控方法,快速、准确判断样本采集情况,迅速发现采集有问题的样本、避免遗漏,是现有技术有待解决的技术问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷,提出了本发明。
因此,作为本发明其中一个方面,本发明克服现有技术中存在的不足,提供一种液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法。
为解决上述技术问题,本发明提供了如下技术方案:一种液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其包括,将2-氯苯丙氨酸代替溶剂对样本进行提取,保证每个样本中内标的浓度一致,采集数据,在数据采集过程中,通过2-氯苯丙氨酸峰面积和保留时间反映实际样本的采集情况。
作为本发明所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法的一种优选方案:所述2-氯苯丙氨酸浓度为1μg/mL。
作为本发明所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法的一种优选方案:所述液相色谱-质谱联用代谢组学检测包括超高效液相色谱-三重四级杆/线性离子阱串联质谱检测,使用分析软件包括MultiQuant。
作为本发明所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法的一种优选方案:还包括,使用4,4’-亚甲基双(2-氯苯胺)、对茴香胺、L-酪氨酸甲酯、3-氯苯胺、2,4-二甲基喹啉、磺胺吡啶、阿特拉津、磺胺多辛、DL-亮氨酸、N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯、6-苯基-2-硫脲嘧啶、N-(邻甲苯酰)甘氨酸、2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇、甘草次酸、黄烷酮、ε-己内酯、2-氨基吡啶的混合标样,每次检测至少进两针所述代谢组学检测通用质控品,根据谱图重叠情况分析检测仪器的状态。
作为本发明所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法的一种优选方案:以质量比计,所述4,4’-亚甲基双(2-氯苯胺):对茴香胺:L-酪氨酸甲酯:3-氯苯胺:2,4-二甲基喹啉:磺胺吡啶:阿特拉津:磺胺多辛:DL-亮氨酸:N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯:6-苯基-2-硫脲嘧啶:N-(邻甲苯酰)甘氨酸:2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇:甘草次酸:黄烷酮:ε-己内酯:2-氨基‘’吡啶=1:0.5:0.5:2:1:0.4:0.1:0.1:0.2:0.5:0.5:1:1:0.1:0.5:2:0.2。
作为本发明所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法的一种优选方案:所述4,4’-亚甲基双(2-氯苯胺)的浓度为1μg/mL、对茴香胺的浓度为0.5μg/mL、L-酪氨酸甲酯的浓度为0.5μg/mL、3-氯苯胺的浓度为2μg/mL、2,4-二甲基喹啉的浓度为1μg/mL、磺胺吡啶的浓度为0.4μg/mL、阿特拉津的浓度为0.1μg/mL、磺胺多辛的浓度为0.1μg/mL、DL-亮氨酸的浓度为0.2μg/mL、N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯的浓度为0.5μg/mL、6-苯基-2-硫脲嘧啶的浓度为0.5μg/mL、N-(邻甲苯酰)甘氨酸的浓度为1μg/mL、2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇的浓度为1μg/mL、甘草次酸的浓度为0.1μg/mL、黄烷酮的浓度为0.5μg/mL、ε-己内酯的浓度为2μg/mL、2-氨基吡啶的浓度为0.2μg/mL。
作为本发明所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法的一种优选方案:每次检测在数据采集过程中通过采集的数据总离子流色谱图重叠情况判断仪器波动情况,色谱图重叠较好说明仪器稳定,重叠不好则通过重叠情况判断仪器状态,保留时间重叠不上柱压或柱温不稳定,响应重叠不上说明色谱柱堵塞或质谱污染。
作为本发明所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法的一种优选方案:所述代谢组学检测包括氨基酸及其代谢物酸检测、核酸检测、苯及其衍生物检测、杂环化合物检测、胺类检测、黄酮类物质检测、萜类化合物检测、醇类检测、内酯检测、吡啶及其衍生物检测。
本发明的有益效果:本发明通过用2-氯苯丙氨酸作为通用内标代替溶剂来提取样本,能够准确监控样本采集情况,排除采集有问题的样本,避免发生错检,并将17个混标作为通用质控品监控仪器波动状态,从而使得在检测过程中不必再每次实验单独配制混标,并且排除每次实验的混标容易存在本身响应不佳、信号相互干扰、重复性差等技术问题,大大简化了高通量代谢组学检测中繁琐的操作和复杂的信号分析、数据处理的问题,并使得检测结果更加准确可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
图1为本发明方法MultiQuant软件参数设置示范。
图2为本发明检测的样本内标异常的数据图。
图3为本发明检测的异常样本的出峰图。
图4为本发明重新采集后正常样本的出峰图。
图5为本发明质控品在液相色谱-质谱联用仪器上出峰情况图。
图6为本发明质控品在液相色谱-质谱联用仪器上的峰重叠情况图。
图7为在一次验证实验中,本发明混标质控品的出峰及峰重叠情况图。
图8为在一次验证实验中,已知样品的出峰及峰重叠情况图。
图9为在一次验证实验中,本发明混标质控品的出峰情况图。
图10为在一次验证实验中,已知样品的出峰及峰重叠情况图。
图11为在一次验证实验中,本发明混标质控品的出峰及峰重叠情况图。
图12为在一次验证实验中,已知样品的出峰及峰重叠情况图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明采用超高效液相色谱-三重四级杆/线性离子阱串联质谱(UPLC-QTRAP)技术,质谱仪为AB Sciex Q-TRAP 6500,分析软件为Multi Quant,选用2-氯苯丙氨酸作为内标,配制成1μg/mL的内标提取液,用内标2-氯苯丙氨酸提取液代替纯溶剂对实验样本进行提取,保证每个样本中内标的浓度一致,上机采集数据,在数据采集过程中,通过MultiQuant软件参数设置,查看内标峰面积和保留时间,通过内标的采集情况,反映实际样本的采集情况,内标异常的个别样本,再打开对应的采集数据查看,数据异常的进行重采。
MultiQuant软件参数设置:删除除内标以外的其它物质;生成所有样本内标的结果表格;选中面积一列,点击creates a metric plot,生成面积折线图,将折线图纵坐标改成百分比的形式,添加一条代表内标面积平均值横线,样本内标面积在平均值上下10%范围内,认为样本数据采集正常,超出10%再返回数据采集软件查看样本采集数据,异常样本重新提交采集;选中保留时间一列,点击creates ametric plot,生成保留时间折线图,偏差超过0.1的返回数据采集软件查看样本采集数据,异常样本重新提交采集。
本发明从众多物质中经过反复筛选,选择2-氯苯丙氨酸作为内标,发现它在正负离子模式下都能够出峰且峰型好,并且不容易对样品中的待测物质产生干扰,采用本发明方法能够准确监测样本的采集情况,且不会发生遗漏,例如,当检测样品在加样过程中掺入气泡时,会造成该样品体积减少,造成出峰响应降低,使得最终该样品的定量不准确,现有技术方法无法监控到这一技术问题,采用本发明内标质控品后,当某一样品掺入气泡时,该样品中加入的内标的出峰响应也会降低,因此能够准确发现该采集情况不佳的样品。本方法只需要一个2-氯苯丙氨酸内标液,代替样品原本的溶剂,再利用软件的参数设置功能,通过内标的峰面积和保留时间即可快速判断样本的采集情况,简单、易操作、成本低。
而当选择其他物质作为内标,例如3-碘化酪氨酸、十五氟辛酸、三氯蔗糖、3-氯苯胺、十三烷酸、甘氨酸、苯甲酸、琥珀酸等时,由于其不稳定、或正负离子模式下影响差别太大、或样品物质易产生干扰、检测重复性不佳,因此不适于作为通用内标。
图1为本发明方法MultiQuant软件参数设置。图2为本发明内标异常的样本,图3为该样本的出峰图,从图2和图3可知,当内标发生异常时,说明样品采集异常,图4为将该样品重新采集进样后的出峰图,对比图3可知,图3样品采集时出峰响应明显下降,说明本发明选择2-氯苯丙氨酸作为内标能够准确反映样本采集情况。
为了能够同时监控检测时仪器的波动状态,本发明筛选17个混标组成通用质控品,本发明的通用质控品17个标样及其使用终浓度见表1:
表1
本发明通过反复测试,挑选分离度好、响应合适、稳定的化合物作为混标,17个标样出峰时间基本均匀分布在0~11分钟,相互对彼此出峰时间影响较小,响应在1*10^6~3*10^7之间,属于所用测试仪器最佳响应范围,17个标样化合物结构稳定,不易挥发、变质,两次采集之间各物质响应波动在20%以内,将数百个潜在的可能作为标准品的物质分别配制成1mg/mL的母液和1μg/mL的工作液,用工作液进行标准品的液质方法开发,确定检测条件,再用母液配制成一个混合标准品溶液,上机采集,并调整标准品的浓度,配成混标,上机采集数据,由于不同组合的标样之间可能会相互反应造成质控品不稳定、或各标样的检测峰之间容易相互干扰、或者响应不佳等,因此本发明经过反复组合、筛选,最终确定17个能够适用于各种不同类别物质检测的混标质控品,17个混标质控品色谱出峰图如图5所示,从图5可知17个标样检测峰相互分开,基本不互相影响,且响应良好,在所用仪器最适范围内,17个混标总离子流色谱图重叠图如图6所示。从图6可以看出两针混标质控品重叠很好,峰高一致,表明仪器响应稳定,保留时间一致,表明色谱分离情况稳定,仪器状态良好。本发明质控品能够作为代谢组学检测的通用质控品,适用于作为所有物质的检测质控品。
在数据采集过程中通过前后采集的数据总离子流色谱图重叠情况判断仪器波动情况,色谱图重叠较好说明仪器稳定,重叠不好则通过重叠情况判断仪器状态,例如保留时间重叠不上说明可能是柱压或柱温不稳定,峰高重叠不上说明可能是色谱柱堵塞或质谱污染等。
本方法的17个质控标样来源于不同的物质类别,能够反映仪器对不同类别物质的响应是否稳定,在代谢组学数据采集过程中穿插采集,若两针混标总离子流色谱图重叠图若重叠很好则表明仪器稳定,重叠不好则根据重叠图情况初步判断仪器不稳定的原因。本发明混标质控品十分稳定,且配制简单,用量少,成本低。本发明质控品及其质控方法适用于各类质谱、色谱的代谢组学检测质控。经过针对不同种类物质的多次重复检测证明,采用本发明质控品能够精准的反应色谱仪或质谱仪的仪器状态(仪器是否稳定、柱压、柱温是否稳定、柱子是否有堵塞、是否有污染等)以及待测样品的状态,并能够根据谱图重叠情况成功分析出仪器不稳定的原因,判断准确度达到100%。
以不同状态的已知样品作为标准,来验证本发明的质控品对于不同样品状态和仪器状态的监控准确度,每个已知样品做一次重复进样,每一个混标质控品做一次重复进样,已知样品的出峰及重叠情况若与本发明混标质控品的出峰及重叠情况一致,则说明本发明混标质控品对于样品及仪器状态的情况反映准确。经过多次实验验证,发现本发明混标质控品能够100%反映样本采集情况及采样时仪器的运行状态,通过混标质控品的出峰及重叠情况,即可反映待测样本的采集情况。
如图7和图8所示,图7为在一次验证实验中,本发明混标质控品的出峰及峰重叠情况,如图7所示,两针混标质控品重叠很好,峰高一致,表明仪器响应稳定,保留时间一致,表明色谱分离情况稳定,仪器状态良好,如图8所示,在本次验证实验中,已知样品的出峰及重叠同样很好,说明本发明混标质控品能够精确反应仪器的正常状态。
如图9和图10所示,图9为在一次验证实验中,本发明混标质控品的出峰情况,从图9看出,质控品峰型不好、分离不好,且10min左右混标质控品未出峰,说明检测时色谱仪器存在问题。图10为本次验证实验中,已知样品的出峰及重叠情况,从图10看出,已知样品同样分离不好,并且8~10min响应变低,本发明质控品与已知样品响应一致,并且经过验证,色谱仪在检测时存在问题。说明本发明混标质控品能够精确反应仪器的异常状态。
如图11和图12所示,图11为在一次验证实验中,本发明混标质控品的出峰及峰重叠情况,如图11所示,两针混标质控品峰重叠不好,1~3min保留时间偏移,说明监测时仪器不稳定,图12为本次验证实验中,已知样品的出峰及重叠情况,从图12看出,已知样品同样峰重叠不好,1~3min样本保留时间同样存在偏移,并且经过验证,色谱仪在检测时柱压不稳,说明本发明混标质控品能够精确反应仪器的异常状态。
本方法的17个标样来源于不同的物质类别,能够反映仪器对不同类别物质的响应是否稳定,在代谢组学数据采集过程中穿插采集,若两针混标总离子流色谱图重叠图若重叠很好则表明仪器稳定,重叠不好则根据重叠图情况初步判断仪器不稳定的原因。本发明混标质控品十分稳定,且配制简单,用量少,成本低。本发明质控品及其质控方法适用于各类质谱、色谱的代谢组学检测质控。经过针对不同种类物质的多次重复检测证明,采用本发明质控品能够精准的反应色谱仪或质谱仪的仪器状态,并能够根据谱图重叠情况成功分析出仪器不稳定的原因,判断准确度达到100%。
综上,本发明通过用2-氯苯丙氨酸作为通用内标代替溶剂来提取样本,能够准确监控样本采集情况,排除采集有问题的样本,避免发生错检,并将17个混标作为通用质控品监控仪器波动状态,从而使得在检测过程中不必再每次实验单独配制混标,并且排除每次实验的混标容易存在本身响应不佳、信号相互干扰、重复性差等技术问题,大大简化了高通量代谢组学检测中繁琐的操作和复杂的信号分析、数据处理的问题,并使得检测结果更加准确可靠。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其特征在于:包括,将2-氯苯丙氨酸代替溶剂对样本进行提取,保证每个样本中2-氯苯丙氨酸内标的浓度一致,采集数据,在数据采集过程中,通过2-氯苯丙氨酸峰面积和保留时间反映实际样本的采集情况。
2.如权利要求1所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其特征在于:所述2-氯苯丙氨酸浓度为1μg/mL。
3.如权利要求1或2所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其特征在于:所述液相色谱-质谱联用代谢组学检测包括超高效液相色谱-三重四级杆/线性离子阱串联质谱检测,使用分析软件包括Multi Quant。
4.如权利要求1或2所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其特征在于:还包括,使用4,4’-亚甲基双(2-氯苯胺)、对茴香胺、L-酪氨酸甲酯、3-氯苯胺、2,4-二甲基喹啉、磺胺吡啶、阿特拉津、磺胺多辛、DL-亮氨酸、N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯、6-苯基-2-硫脲嘧啶、N-(邻甲苯酰)甘氨酸、2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇、甘草次酸、黄烷酮、ε-己内酯、2-氨基吡啶的混合标样,每次检测至少进两针所述代谢组学检测通用质控品,根据谱图重叠情况分析检测仪器的状态。
5.如权利要求4所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其特征在于:以质量比计,所述4,4’-亚甲基双(2-氯苯胺):对茴香胺:L-酪氨酸甲酯:3-氯苯胺:2,4-二甲基喹啉:磺胺吡啶:阿特拉津:磺胺多辛:DL-亮氨酸:N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯:6-苯基-2-硫脲嘧啶:N-(邻甲苯酰)甘氨酸:2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇:甘草次酸:黄烷酮:ε-己内酯:2-氨基吡啶=1:0.5:0.5:2:1:0.4:0.1:0.1:0.2:0.5:0.5:1:1:0.1:0.5:2:0.2。
6.如权利要求5所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其特征在于:所述4,4’-亚甲基双(2-氯苯胺)的浓度为1μg/mL、对茴香胺的浓度为0.5μg/mL、L-酪氨酸甲酯的浓度为0.5μg/mL、3-氯苯胺的浓度为2μg/mL、2,4-二甲基喹啉的浓度为1μg/mL、磺胺吡啶的浓度为0.4μg/mL、阿特拉津的浓度为0.1μg/mL、磺胺多辛的浓度为0.1μg/mL、DL-亮氨酸的浓度为0.2μg/mL、N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯的浓度为0.5μg/mL、6-苯基-2-硫脲嘧啶的浓度为0.5μg/mL、N-(邻甲苯酰)甘氨酸的浓度为1μg/mL、2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇的浓度为1μg/mL、甘草次酸的浓度为0.1μg/mL、黄烷酮的浓度为0.5μg/mL、ε-己内酯的浓度为2μg/mL、2-氨基吡啶的浓度为0.2μg/mL。
7.如权利要求5或6所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其特征在于:每次检测在数据采集过程中通过采集的数据总离子流色谱图重叠情况判断仪器波动情况,色谱图重叠较好说明仪器稳定,重叠不好则通过重叠情况判断仪器状态,保留时间重叠不上柱压或柱温不稳定,响应重叠不上说明色谱柱堵塞或质谱污染。
8.如权利要求1、2、5、6中任一所述的液相色谱-质谱联用代谢组学检测通用质控方法,其特征在于:所述代谢组学检测包括氨基酸及其代谢物酸检测、核酸检测、苯及其衍生物检测、杂环化合物检测、胺类检测、黄酮类物质检测、萜类化合物检测、醇类检测、内酯检测、吡啶及其衍生物检测。
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