CN107782825A - 一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及代谢组学技术领域，尤其涉及一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，主要包括人体样品制备，根据小分子代谢产物在人体血浆、组织和尿液中的含量差异，通过把血浆样品与组织样品或者血浆样品与组织样品或者组织样品与尿液样品或者血浆样品、组织样品与尿液样品混合，再进行荷质比步进扫描，结合MRM技术构建基础代谢数据库，然后通过基础代谢数据库中的离子对信息和保留时间检测不同类型的待测样品中的小分子代谢物，本发明的优点在于，能够对不同动物体中的小分子代谢物进行全面的、无差别的定性和定量分析，准确度和灵敏度高，通过不同样品的混合，使基础代谢数据库数据更全面，解决了不同样品中低丰度代谢物不易检测的问题。
Description
技术领域
本发明涉及代谢组学技术领域，尤其涉及一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法。
背景技术
在生命体中，代谢物是生物体整个生命活动的最终产物，处于生化活动调节的末端，因此代谢物既可以反映机体的生理和病态状态，又能反映外界环境刺激对机体的影响。
代谢组学是通过利用化学分析技术和计量方法研究生物体受刺激或扰动前后生物内源小分子代谢产物的动态变化规律，并确定这些变化与生物过程相关性的一门学科，它是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领域，已逐渐成为整体性研究生命系功能变化的重要手段之一。
生物体中代谢物的组成十分复杂，并且各成分含量差异大，许多痕量代谢物有重要的生理功能和意义，因此如何对生物样品进行全面的、无差别的、高通量和高灵敏度的定性定量分析，仍是目前代谢组学发展的瓶颈所在，虽然申请号为201010562426.8的中国发明专利公开了一种利用LC-MS/MS高效鉴别植物次生代谢产物的方法，但该发明仅提出了对植物不同组织的次生代谢产物进行高通量、高灵敏度鉴别的技术方案，而如何对动物体中小分子代谢物进行高通量、高灵敏度的检测，现有技术仍存在空缺。
发明内容
本发明的目的在于针对已有的技术现状，提供一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：人体样品制备
步骤1.1：血浆样品制备：取出冻存的血浆样本，解冻后取一定量的血浆于EP管中，按体积比例加入冰甲醇，经过涡旋和离心后取上清液于新的EP管中，冷冻保存；
步骤1.2：组织样品制备：取出冻存的组织样本，将组织切碎，混匀后称量一定量的组织装入EP管中，按照重量比例加入提取液，依次经过匀浆、冰水浴和离心后，取上清液于新的EP管中，冷冻保存；
步骤1.3：分别取等量的血浆样品和组织样品，混合均匀后装入进样瓶中，上机待测；
步骤2：建立基础数据库
步骤2.1：质谱仪参数设置；
步骤2.2：以质荷比50-1000每间隔 0.1-1组成一级质谱母离子Q1等于二级质谱子离子Q3的离子对，即 Q1=Q3，对上述离子对以采集方式为MRM-IDA-EPI进行分段跑样；
步骤2.3：对每个文件找出一级质谱母离子Q1在相应时间被裂解所对应的二级质谱子离子Q3及二级质谱子离子Q4、Q5，峰保留时间(RT)；
步骤2.4：以采集方式为MRM对步骤2.3所筛选出的离子对进行分段跑样，然后利用Analyst数据处理软件的定量积分方法选出峰强度在1000cps以上的离子对；
步骤2.5：对步骤2.4筛选出来的离子对再次以采集方式为 MRM-IDA-EPI进行分段跑样，进一步对一级质谱母离子Q1，二级质谱子离子 Q3、Q4，峰保留时间进行核对校准，去卷积，建立二级质谱子离子及保留时间为标签的基础代谢数据库；
步骤3：检测不同类型的待测样品
步骤3.1：制备不同类型的待测样品，装入进样瓶中，上机待测；
步骤3.2：以采集方式为 MRM-IDA-EPI进行分段跑样，利用步骤2.5所建立的基础代谢数据库中的离子对信息及保留时间，检测不同类型的待测样品中的小分子代谢物。
进一步的，步骤1.1中所述的体积比例为血浆：冰甲醇=1:3-1:5。
进一步的，所述的冰甲醇为液态甲醇在-20℃冰箱中冷藏5-6小时制成。
进一步的，步骤1.2所述的重量比例为组织：提取液=1:10。
进一步的，所述的提取液为甲醇与水按照体积比例2:1混合制成。
进一步的，步骤1所述的基础样品制备还包括尿液样品制备：取出冻存的尿液样本，解冻后取一定量的尿液于EP管中，按照体积比例加入超纯水，经过涡旋和离心后取一定量的上清液于新的EP管中，冷冻保存。
进一步的，所述的体积比例为尿液：超纯水=1:2。
进一步的，取等量的尿液样品与血浆样品或者组织样品或者血浆样品和组织样品，混合均匀后装入进样瓶中，上机待测。
优选的，步骤2.1、2.4、2.5中所述的分段跑样的每个文件的离子对数量分别为30-80、500-800、30-80。
本发明的有益效果为：
1、本发明的优点在于，对人体样品进行荷质比步进扫描，结合MRM技术构建基础代谢数据库，然后通过基础代谢数据库中的离子对信息和保留时间检测不同类型的待测样品中的小分子代谢物，能够对不同动物体中的小分子代谢物进行全面的、无差别的定性和定量分析，准确度和灵敏度高；
2、人体样品通过不同样品的混合，使基础代谢数据库数据更全面，解决了不同样品中低丰度代谢物不易检测的问题；
3、冰甲醇为液态甲醇在-20℃冰箱中冷藏5-6小时制成，可以促进血浆中蛋白的沉淀，利于上清液的形成，提高血浆样品的质量；
4、提取液为甲醇与水按照体积比例2:1混合制成，组织中代谢物的种类数量较多，按照上述体积比例混合制成的提取液可以增加代谢物的提取率。
附图说明
附图1为小鼠肌肉在正模式下检测到580多个代谢物的结果图。
附图2为小鼠肌肉在负模式下检测到510多个代谢物的结果图。
附图3为小鼠血浆在正模式下检测到530多个代谢物的结果图。
附图4为小鼠血浆在负模式下检测到540多个代谢物的结果图。
具体实施方式
为了使审查委员能对本发明之目的、特征及功能有更进一步了解，兹举较佳实施例详细说明如下：
实施例1：
一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，包括以下步骤：
步骤1：人体样品制备
步骤1.1：血浆样品制备：从-80℃冰箱中取出冻存的血浆样本，在4℃下解冻后取一定量的血浆于EP管中，按体积比例为血浆：冰甲醇=1:3-1:5加入冰甲醇，如100μL 血浆加入300-500μL 冰甲醇，涡旋30s，重复3次，在4℃条件下离心10min，取上清液于新的EP管中，放入-20℃冰箱中冷冻保存；
步骤1.2：组织样品制备：取出冻存的组织样本，将组织切碎，混匀后称量一定量的组织装入EP管中，按照重量比例为组织：提取液=1:10加入提取液，如50 mg加入500 μL，用匀浆仪匀浆两三次，每次1min，冰水浴中超声提取5~10 min后，在4℃条件下离心10min，取上清液于新的EP管中，放入-20℃冰箱中冷冻保存；
步骤1.3：分别取等量的血浆样品和组织样品，混合均匀后装入进样瓶中，上机待测。
步骤2：建立基础数据库
步骤2.1：质谱仪参数设置；
仪器参数设定：进样量：5μL，色谱柱：C18，2.1*100mm，1.8μm，流动相A：0.04%的乙酸水溶液；流动相B：0.04%的乙酸乙腈溶液；柱温：40℃；流速：0.35mL/min；洗脱梯度：0min＝5%B，10min＝95%B，10-11min＝95%B，11.1min＝5%B，11.1-14min=5%B；
MRM参数：DP=40-80，EP=10-15，当Q1=Q3时，CE=5-10，Q1≠Q3时，CE=30，CXP=10，CAD=High，每对离子对扫描时间为5-10ms；
IDA参数：离子流预值：2000-5000cps，排除3-10s内的目标离子；
EPI参数：DP=40-80；CE=30；CAD=High，CES=10。
步骤2.2：以质荷比50-1000每间隔 0.1-1组成一级质谱母离子Q1等于二级质谱子离子 Q3的离子对，即 Q1=Q3，对上述离子对以采集方式为MRM-IDA-EPI进行分段跑样，优选的，分段跑样的每个文件的离子对数量为30-80，见表一。
表一：以质荷比50-1000每间隔 0.1组成一级质谱母离子Q1等于二级质谱子离子Q3的离子对对基础样品进行分段跑样的部分结果图
步骤2.3：对每个文件找出一级质谱母离子Q1在相应时间被裂解所对应的二级质谱子离子Q3及二级质谱子离子Q4、Q5，峰保留时间(RT)，见表二。
表二：一级质谱母离子Q1在相应时间被裂解所对应的二级质谱子离子Q3及二级质谱子离子Q4、Q5，峰保留时间的部分结果图。
步骤2.4：以采集方式为MRM对步骤2.3所筛选出的离子对进行分段跑样，然后利用Analyst数据处理软件的定量积分方法选出峰强度在1000cps以上的离子对，优选的，分段跑样的每个文件的离子对数量为300-800。
步骤2.5：对步骤2.4筛选出来的离子对再次以采集方式为 MRM-IDA-EPI进行分段跑样，进一步对一级质谱母离子Q1，二级质谱子离子 Q3、Q4，峰保留时间进行核对校准，去卷积，建立二级质谱子离子及保留时间为标签的基础代谢数据库，优选的，分段跑样的每个文件的离子对数量为30-80。
步骤3：检测不同类型待测样品
步骤3.1：制备不同类型的待测样品，装入进样瓶中，上机待测；
步骤3.2：以采集方式为 MRM-IDA-EPI进行分段跑样，利用步骤2.5所建立的基础代谢数据库中的离子对信息及保留时间，检测不同类型的待测样品中的小分子代谢物，待测样品可以为人体脑脊液，也可以为小鼠血浆、小鼠肌肉等不同类型的动物体的待测样品；
本实施例中，所述的冰甲醇为液态甲醇在-20℃冰箱中冷藏5-6小时制成，可以促进血浆中蛋白的沉淀，利于上清液的形成。
本实施例中，所述的提取液为甲醇与水按照体积比例2:1混合制成，组织中代谢物的种类数量较多，按照上述体积比例混合制成的提取液可以增加代谢物的提取率。
实施例2：
步骤1所述的人体样品制备还包括尿液样品制备：从-80℃冰箱中取出冻存的尿液样本，在4℃下解冻后取一定量的尿液于EP管中，按体积比例为尿液：超纯水=1-2加入超纯水，如100μL 血浆加入200μL 超纯水，涡旋1 min，在4℃条件下离心10min，取上清液于新的EP管中，放入-20℃冰箱中冷冻保存。
取等量的尿液样品与血浆样品或者组织样品或者血浆样品和组织样品，混合均匀后装入进样瓶中，上机待测。
不同样品中各种代谢物的含量均不同，单一样品检测时，部分微量代谢物不易检测，本实施例中，人体样品采用尿液样品与血浆样品或者组织样品或者血浆样品和组织样品混合的组合，将不同的样品中各种含量不同的代谢物进行中和，利于代谢物的检测。
当然，以上仅为本发明较佳实施方式，并非以此限定本发明的使用范围，故，凡是在本发明原理上做等效改变均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：人体样品制备
步骤1.1：血浆样品制备：取出冻存的血浆样本，解冻后取一定量的血浆于EP管中，按体积比例加入冰甲醇，经过涡旋和离心后取上清液于新的EP管中，冷冻保存；
步骤1.2：组织样品制备：取出冻存的组织样本，将组织切碎，混匀后称量一定量的组织装入EP管中，按照重量比例加入提取液，依次经过匀浆、冰水浴和离心后，取上清液于新的EP管中，冷冻保存；
步骤1.3：分别取等量的血浆样品和组织样品，混合均匀后装入进样瓶中，上机待测；
步骤2：建立基础数据库
步骤2.1：质谱仪参数设置；
步骤2.2：以质荷比50-1000每间隔 0.1-1组成一级质谱母离子Q1等于二级质谱子离子Q3的离子对，即 Q1=Q3，对上述离子对以采集方式为MRM-IDA-EPI进行分段跑样；
步骤2.3：对每个文件找出一级质谱母离子Q1在相应时间被裂解所对应的二级质谱子离子Q3及二级质谱子离子Q4、Q5，峰保留时间(RT)；
步骤2.4：以采集方式为MRM对步骤2.3所筛选出的离子对进行分段跑样，然后利用Analyst数据处理软件的定量积分方法选出峰强度在1000cps以上的离子对；
步骤2.5：对步骤2.4筛选出来的离子对再次以采集方式为 MRM-IDA-EPI进行分段跑样，进一步对一级质谱母离子Q1，二级质谱子离子 Q3、Q4，峰保留时间进行核对校准，去卷积，建立二级质谱子离子及保留时间为标签的基础代谢数据库；
步骤3：检测不同类型的待测样品
步骤3.1：制备不同类型的待测样品，装入进样瓶中，上机待测；
步骤3.2：以采集方式为 MRM-IDA-EPI进行分段跑样，利用步骤2.5所建立的基础代谢数据库中的离子对信息及保留时间，检测不同类型的待测样品中的小分子代谢物。
2.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于：步骤1.1中所述的体积比例为血浆：冰甲醇=1:3-1:5。
3.根据权利要求2所述的一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于：所述的冰甲醇为液态甲醇在-20℃冰箱中冷藏5-6小时制成。
4.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于：步骤1.2所述的重量比例为组织：提取液=1:10。
5.根据权利要求4所述的一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于：所述的提取液为甲醇与水按照体积比例2:1混合制成。
6.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于：步骤1所述的基础样品制备还包括尿液样品制备：取出冻存的尿液样本，解冻后取一定量的尿液于EP管中，按照体积比例加入超纯水，经过涡旋和离心后取一定量的上清液于新的EP管中，冷冻保存。
7.根据权利要求6所述的一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于：所述的体积比例为尿液：超纯水=1:2。
8.根据权利要求6所述的一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于：取等量的尿液样品与血浆样品或者组织样品或者血浆样品和组织样品，混合均匀后装入进样瓶中，上机待测。
9.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱检测动物体中小分子代谢物的方法，其特征在于：步骤2.1、2.4、2.5中所述的分段跑样的每个文件的离子对数量分别为30-80、500-800、30-80。
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