CN105738513A - 一种检测原料乳中脂肪酸相对含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测原料乳中脂肪酸相对含量的方法，包括以下步骤：（1）待测样品的预处理；（2）分析试样用气相色谱?质谱联用法（GC?MS）进行检测，得不同保留时间对应的脂肪酸组分；（3）分析试样用气相色谱法（GC）进行检测，得不同保留时间对应的脂肪酸组分；（4）脂肪酸组分定性，定量，计算确定待测样品中各脂肪酸组分的百分含量。该发明提供的脂肪酸检测方法，预处理简单方便，污染小，检测速度快，适用于快速分析原料乳及乳制品中的脂肪酸组成及相对含量，具有广阔的应用前景。

Description

一种检测原料乳中脂肪酸相对含量的方法

技术领域

本发明涉及一种色谱检测方法，特别涉及一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法。

背景技术

牛乳中的脂肪主要以三酰甘油（约占98%）的形式存在，此外还有少量的磷脂、游离脂肪酸和甾醇。牛乳中脂肪酸含量丰富，包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。牛乳脂肪酸具有易消化的优点，是人体所需能量的良好来源。其中，不饱和脂肪酸具备一定的功能性，对人体心血管健康起着十分积极的作用。然而，牛乳中的脂肪酸组成因奶牛的年龄、饮食、气候条件、季节等因素的不同而有所差异。

现有国标检测脂肪酸的方法为《GB5413.27—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》。第一法为乙酰氯-甲醇甲酯化法，乙酰氯与甲醇反应得到的盐酸-甲醇使试样中的脂肪和游离脂肪酸甲酯化，用甲苯提取后，经气相色谱仪分离检测，外标法定量。第二法为氨水-乙醇提取法，乳与乳制品中的脂肪经提取后，皂化处理后生成游离脂肪酸，在三氟化硼催化下进行甲酯化反应，经甲酯化后的脂肪酸通过气相色谱柱分离，以氢火焰离子化检测器检测，外标法定量。虽然第一法和第二法都能较准确的测定出乳制品中的脂肪酸含量，但由于第一法和第二法均需要使用多种不同的有机试剂，并且要与脂肪酸进行酯化或皂化反应，反应时间长，反应效率低，因而不仅对环境有一定的污染且对人体健康有害，而且造成整个脂肪酸的测定过程复杂，耗时长。

发明内容

本发明的目的在于克服现有脂肪酸测定方法中耗时长和污染大的缺陷，提供一种能快速检测原料乳中脂肪酸相对含量的方法。该方法采用两次离心技术对原料乳进行预处理，缩短了脂肪酸测定过程中脂肪的提取时间和减少了有机试剂的使用，并且直接采用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行分子量确认，然后通过气相色谱法（GC）与气相色谱-质谱联用法（GC-MS）得到的保留时间进行定性，以面积百分比法定量，计算得到脂肪酸相对含量，该检测方法具有耗时短、污染小、结果平行性好的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供出了一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，包括以下步骤：

（1）将待测样品进行预处理，得到分析试样；

（2）将步骤（1）得到的分析试样用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行检测，得保留时间A和GC-MS图谱，并通过与质谱数据库对比得不同保留时间对应的脂肪酸组分；

（3）将步骤（1）得到的分析试样用气相色谱法（GC）进行检测，得保留时间B和GC图谱，并将保留时间B与步骤（2）中所得保留时间A对比得不同保留时间对应的脂肪酸组分；

（4）将步骤（3）中所得脂肪酸组分以保留时间B定性，通过步骤（3）所得GC图谱中对应脂肪酸的峰面积以面积百分比法定量，计算确定待测样品中各脂肪酸组分的百分含量。

上述一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其中步骤（1）所述的待测样品包括巴氏奶和纯牛奶。

上述一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其中步骤（1）所述的预处理为：先将待测样品经两次离心处理后得脂肪样品；然后将脂肪样品进行冷冻处理，再在温水中融化并静置分层后，取上层脂肪；称取上层脂肪于试管中，依次加入正己烷和氢氧化钾-甲醇溶液，充分混匀，静置直至溶液分层，吸取上清液于GC或GC-MS上样小瓶中，得分析试样。

其中，所述的两次离心处理为将待测样品经4000～6000×g离心15-20min处理后，取上部脂肪于离心管中，再次经过6000～10000×g离心10～15min处理；原料乳中的脂肪主要以脂肪球的形式存在，在一定的离心条件下能够相互集聚形成脂肪层，从而达到分离脂肪的目的，不仅分离简单方便、速度快，而且没有使用有机试剂，减少了对环境的污染。

其中，所述的低温冷冻处理为在-30～-15℃下冷冻8-12h处理；所述的温水温度为在50～55℃；冷冻和解冻过程有利于乳脂肪的释放和富集，达到完整提取乳中脂肪的目的。

其中，所述的氢氧化钾为分析纯，正己烷、甲醇为色谱纯；所述的氢氧化钾-甲醇溶液浓度为2.8mol/L；高浓度的氢氧化钾-甲醇溶液能使脂肪在常温下与甲醇进行甲酯化反应，生成脂肪酸甲酯，有利于脂肪酸的分析检测，能缩短反应时间，减少能源消耗；将脂肪甲酯化，能防止脂肪发生聚合、脱酸、裂解等副反应，在分析中造成损失，降低色谱峰拖尾和假峰的出现几率，从而提高分离效果，有利于气相色谱法分离并逐一测定脂肪酸的组成和含量。

进一步优选的，上述一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其中步骤（1）所述的预处理为：原料乳样品经4000×g，离心20min后，取上部脂肪样品于离心管中，再次经过6000×g，离心15min；然后将脂肪样品在-20℃下冷冻8h；取冷冻后的样品于55℃的温水中融化并静置分层后，取上层脂肪；称取上层脂肪0.2g于试管中，依次加入10mL正己烷和0.5mL氢氧化钾-甲醇溶液，充分混匀，静置直至溶液分层，吸取1mL上清液于GC或GC-MS上样小瓶中，得分析试样。

上述一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，步骤（2）没有使用标准样品，而是采用GC-MS进行分子量确认，然后通过步骤（3）的GC和GC-MS的保留时间对比定性脂肪酸，以GC图谱中脂肪酸的峰面积比例来确定脂肪酸的相对含量；由于GC的检测所用时间少于GC-MS的检测所用时间，因而利用GC替代GC-MS来处理大量的待测样品，极大的缩短了检测的时间。

上述一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其中步骤（2）所述GC-MS中MS的工作条件为：电子轰击离子源，离子源温度230℃，四级杆温度150℃；质量扫描电压范围50～550m/z。

上述一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其中步骤（2）（3）所述GC的工作条件为：色谱柱选用AgilentDB-23（60m×250μm×0.25μm）；色谱柱初始温度为50℃，保持1min，以25℃/min的速度升至175℃保持1min，再以4℃/min升至230℃保持25min；进样口温度250℃；进样量1μL；载气流量1.5mL/min；进样方式为分流进样，分流比为20∶1；溶剂延迟3min。

其中，步骤（2）所述GC-MS的载气为氮气；步骤（3）所述GC的载气为氢气。

上述一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其中步骤（4）中所述的计算确定待测样品中各脂肪酸组分的百分含量，其计算式为：

Ai%=Ai/ΣAi×100%

式中：Ai表示第i个脂肪酸组分的峰面积；ΣAi表示所有脂肪酸组分的峰面积之和。

本发明一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，该方法先利用离心处理能够将原料乳中的脂肪球集聚起来形成脂肪层的原理，采用两次离心、冷冻、解冻、酯化的方法对待测样品进行预处理，得到分析试样，该预处理方法减少了有机试剂的使用，具有简单方便、速度快、污染小的优点；再使用GC-MS和GC分别对分析试样进行检测，最后通过对GC-MS和GC得到的不同保留时间和图谱的对比、分析，得到原料乳中不同脂肪酸相对含量；该方法中没有使用标准样品，而是直接通过GC-MS和GC保留时间的对比来确定脂肪酸的组分，以GC图谱中脂肪酸的峰面积比例来确定脂肪酸的相对含量，利用GC替代GC-MS来处理大量的待测样品，极大的缩短了检测的时间，降低了仪器的消耗。该发明提供的脂肪酸检测方法，预处理简单方便，污染小，检测速度快，适用于快速分析原料乳及乳制品中的脂肪酸组成及相对含量，具有广阔的应用前景。

与现有技术相比，本发明的显著区别和有益效果：

1、本发明方法直接通过GC-MS和GC保留时间的对比来确定脂肪酸的组分，减少了标准样品的使用，缩短了检测的时间，简化了检测步骤。

2、本发明利用GC替代GC-MS来处理大量的待测样品，极大地缩短了检测时间，降低了仪器消耗。

3、本发明采用两次离心的方法来对脂肪进行提取和分离，具有简单方便、速度快、污染小的优点。

附图说明：

图1为本发明实施例1样品1原料乳的GC-MS图谱。

图2为本发明实施例1样品1原料乳的GC图谱。

图3为本发明实施例1样品4原料乳的GC图谱。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

检测仪器：气相色谱仪（GC）、气相色谱-质谱连用仪（GC-MS）

仪器检测条件：

色谱条件

色谱柱：AgilentDB-23（60m×250μm×0.25μm）；

进样口温度：250℃；

升温程序：初始柱温50℃，保持1min，以25℃/min升温至175℃，保持1min，再以4℃/min，升温至230℃，保持25min；

载气：氮气（GC-MS）和氢气（GC），流速1.5ml/min；

进样方式：分流进样，分流比为20∶1。

质谱条件

电离方式：电子轰击源（EI）；

离子源温度：280℃；

四级杆温度：150℃；

质量扫描电压范围：50～550m/z；

溶剂延迟：3min。

实施例1：

分别取来源不同地区牧场1和牧场2的原料乳，每个牧场原料乳取三个样品，分别编号为：牧场1是样品1-3，牧场2是样品4-6，将上述样品1-6分别采用本发明方法进行检测，具体检测步骤如下：

（1）将原料乳样品1经4000×g，离心20min后，取上部脂肪样品于离心管中，再次经过6000×g，离心15min；然后将脂肪样品在-20℃下冷冻8h；取冷冻后的样品于55℃的温水中融化并静置分层后，取上层脂肪；称取上层脂肪0.1～0.2g于试管中，依次加入10mL正己烷和0.5mL浓度为2.8ml/L的氢氧化钾-甲醇溶液，充分混匀，静置直至溶液分层，吸取1mL上清液于GC或GC-MS上样小瓶中，得分析试样；

（2）将步骤（1）得到的分析试样用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行检测，得保留时间A和GC-MS图谱（图1），并通过与质谱数据库对比得不同保留时间对应的脂肪酸组分；

（3）将步骤（1）得到的分析试样用气相色谱法（GC）进行检测，得保留时间B和GC图谱（图2），并将保留时间B与步骤（2）中所得保留时间A对比得不同保留时间对应的脂肪酸组分（表1）；

（4）将步骤（3）中所得脂肪酸组分以保留时间B定性，通过步骤（3）所得GC图谱中对应脂肪酸的峰面积以面积百分比法定量，通过计算式Ai%=Ai/ΣAi×100%（式中：Ai表示第i个脂肪酸组分的峰面积；ΣAi表示所有脂肪酸组分的峰面积之和）计算确定原料乳样品1中各脂肪酸组分的百分含量。

将样品2-6同样按照上述检测步骤进行检测，检测结果记入表格中，得表2。

表1样品1中GC和GC-MS保留时间对应原料乳中脂肪酸的比对结果

表2样品1-6原料乳脂肪酸的相对含量

实施例1中采用本方法测定的不同来源的原料乳中脂肪酸相对含量，结果平行性良好，且不同来源的样品具有相似的脂肪酸组成。实验结果表明本发明方法检测过程简单易行，具有良好的可重复性，可用于快速检测原料乳中脂肪酸的相对含量。

Claims (10)

1.一种原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将待测样品进行预处理，得到分析试样；

（2）将步骤（1）得到的分析试样用气相色谱-质谱联用法进行检测，得保留时间A和GC-MS图谱，并通过与质谱数据库对比得不同保留时间对应的脂肪酸组分；

（3）将步骤（1）得到的分析试样用气相色谱法进行检测，得保留时间B和GC图谱，并将保留时间B与步骤（2）中所得保留时间A对比得不同保留时间对应的脂肪酸组分；

（4）将步骤（3）中所得脂肪酸组分以保留时间B定性，通过步骤（3）所得GC图谱中对应脂肪酸的峰面积以面积百分比法定量，计算确定待测样品中各脂肪酸组分的百分含量。

2.根据权利要求1所述原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，所述的待测样品包括巴氏奶和纯牛奶。

3.根据权利要求1所述原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，所述的预处理为：先将待测样品经两次离心处理后得脂肪样品；然后将脂肪样品进行冷冻处理，再在温水中融化并静置分层后，取上层脂肪；称取上层脂肪于容器中，依次加入正己烷和氢氧化钾-甲醇溶液，充分混匀，静置直至溶液分层，吸取上清液于GC或GC-MS，得分析试样。

4.根据权利要求3所述原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，所述的两次离心处理为将待测样品经4000～6000×g离心15-20min处理后，取上部脂肪于离心管中，再次经过6000～10000×g离心10～15min处理。

5.根据权利要求3所述原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，所述的冷冻处理为在-30～-15℃下冷冻8-12h。

6.根据权利要求3所述原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，所述的温水温度为在50～55℃。

7.根据权利要求3所述原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，所述的氢氧化钾-甲醇溶液浓度为2.8mol/L。

8.根据权利要求1所述原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，所述的GC-MS、GC的工作条件为：质谱条件：电子轰击离子源，离子源温度230℃，四级杆温度150℃；质量扫描电压范围50～550m/z；气相色谱条件：色谱柱选用60m×250μm×0.25μm；色谱柱初始温度为50℃，保持1min，以25℃/min的速度升至175℃保持1min，再以4℃/min升至230℃保持25min；进样口温度250℃；进样量1μL；载气流量1.5mL/min；进样方式为分流进样，分流比为20∶1；溶剂延迟3min。

9.根据权利要求8所述原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，所述GC-MS的载气为氮气；所述GC的载气为氢气。

10.根据权利要求1所述原料乳中脂肪酸相对含量的检测方法，其特征在于，所述的计算确定待测样品中各脂肪酸组分的百分含量，其计算式为：

Ai%=Ai/ΣAi×100%

式中：Ai表示第i个脂肪酸组分的峰面积；ΣAi表示所有脂肪酸组分的峰面积之和。