CN102495151A - 一种评价微藻产油能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种评价微藻产油能力的方法，该方法包括下述步骤；(1)微藻细胞收集及淬灭；(2)提取细胞内脂肪酸；(3)脂肪酸甲酯化；(4)GC-MS检测；(5)计算日产量；(6)十六烷值确定对微藻产油能力进行评价，本发明的方法能为比较不同培养体系下不同藻种产油能力提供标准，从而为最优的藻种选择和培养工艺优化提供依据。

Description

一种评价微藻产油能力的方法
发明领域
本发明属于生物燃料领域，涉及一种评价微藻产油能力的方法。
背景技术
随着科技的发展，人类对能源的依赖程度越来越高，这与日益枯竭的化石能源储备形成了尖锐的矛盾。此外，能源的快速消耗也造成了环境的破坏，大量温室气体，如二氧化碳的排放使得温室效应日趋严重。开发可持续发展的绿色新能源为这一系列的问题提供了解决之道，并引起了广泛关注。其中以富油生物质为原料，提取脂肪酸甲酯混合物，即生物柴油为能源的开发提供了广阔的前景。尤其是微藻，因为具有不占用耕地，生长快速，容易培养，含有量高，品种丰富等特点，在生物柴油领域受到了越来越多的关注。
国际发明专利公开号WO2008/151373公开了一种优质供应藻类养殖及生物柴油的方法和装置。中国专利公开号CN 101368193A公开了一种微藻培养联合生物柴油制备的生产方法，获得了热值高达42MJ·Kg-1生物柴油。中国专利公开号CN 101649332A公开了一种以藻类为原料，通过萃取，酯交换，静置分层及蒸馏手段获得生物柴油的方法。
但是，以上专利对藻类在不同装置不同培养条件下产油能力的评价不清晰，也不一致，难以进行横向比较。
十六烷值作为表征生物柴油自燃性的指标，是国际上公认的生物柴油质量的重要评估指标，但是十六烷值的检测实际操作复杂，且相关设备造价昂贵，普及性不强。Krisnangkura K在1986年提出柴油的十六烷值与皂化值及碘值有线性相关性，并给出相关公式(KrisnangkuraK.1986.A simple method for estimation of cetane index of vegetable oil methyl esters.Journal ofthe American Oil Chemists′Society 63(4)：552-553.)。而且大量研究表明生物柴油的十六烷值，皂化值及碘值与其中各个不同脂肪酸甲酯的含量及组成密切相关(Azam MM，Waris A，NaharNM.2005.Prospects and potential of fatty acid methyl esters of some non-traditional seed oils foruse as biodiesel in India.Biomass & Bioenergy 29(4)：293-302.)，并建立了相应的经验公式。本发明将其引入评定指标中，从而可以轻易实现不同培养条件下不同藻种的产油能力的比较，从而为最优藻种的选择和培养方法的优化提供依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种评价微藻产油能力的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种评价微藻产油能力的方法，包括如下步骤：
(1)细胞收集及淬灭：
取出已培养好的藻液样品3-5份，每份100-150mL，4℃下3000-5000rpm，离心3-4min，收集下层的细胞，用3-5mL代谢终止液在-40℃下淬灭5-10分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；
所述代谢终止液为含有1500mg·L-1NaNO3，36mg·L-1CaCl2·2H2O，75mg·L-1MgSO4·7H2O和40mg·L-1K2HPO4·3H2O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；
(2)提取细胞内脂肪酸：
取步骤(1)获得的冻干细胞15-25mg分别置于离心管中，每管加入0.75-1.5mL氯仿及0.3-0.6mL超纯水，100rpm震荡1h；再加入2-4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；向残渣中加入2-4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，再加入0.5-1mL 1M KCl水溶液，震荡，3000-4000rpm，离心3-5min，弃水相，再加入1-2mL超纯水，震荡，3000-4000rpm，离心3-5min，弃水相，30-35℃真空干燥得干物质；
所述脂肪提取液为体积百分含量为66.7％的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液含有质量百分比为0.1％的二丁基羟基甲苯；
(3)脂肪酸甲酯化：
将所述干物质溶于600-1000μL质量百分比为14％的三氟化硼-甲醇溶液中，加入10-20μg十七烷酸做为内标，置于15mL密封管内，在100℃水浴20-30min，温度降至室温，加入500-1000μl正己烷震荡萃取30s，4000-5000rpm离心2min，得到正己烷相；取100-200μL正己烷相放入已编号的GC进样瓶；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对正己烷相中的脂肪酸甲酯进行定性和定量处理，条件如下：
色谱柱：DB-5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；
进样量：1μL；
分流比：10∶1；
进样口温度：280℃；
GC interface温度：270℃；
氦气流速：恒压，91KPa；
升温程序：70℃保持2min，以8℃·min-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；
电离电压：70eV；
源温：250℃；
扫描范围：50-800m/z；
扫描速度：2scan·s-1；
从而获得了脂肪酸甲酯混合物中的单个脂肪酸甲酯的含量；
(5)计算日产量
根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的日产量：
P＝∑Wi/Day/CV
其中P是微藻脂肪酸甲酯日产量，Wi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的重量，Day是步骤(1)所述从微藻接种到微藻收获的时间长度，CV是步骤(1)所述收获时微藻培养液的体积；
(6)十六烷值确定
根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的十六烷值：
SN＝∑(560×Pi)/MWi             a
IN∑(254×D×Pi)/MWi            b
CN＝46.3+5458/SN-0.225×IN      c
其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的分子量，D是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的双键数量。
所述的微藻涉及但不限于小球藻(Chlorella sorokiniana)、栅藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)及鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)。
本发明提供了一种评价微藻产油能力的方法，这种方法能为比较不同培养体系下不同藻种产油能力提供标准，从而为最优的藻种选择和培养工艺优化提供依据。
附图说明
图1为小球藻不同接种密度培养下OD560达到1.5时的脂肪酸甲酯日产量变化；
图2为小球藻不同接种密度培养下OD560达到1.5时的脂肪酸甲酯十六烷值变化。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
一种评价微藻产油能力的方法，包括如下步骤：
(1)小球藻(Chlorella sorokiniana)细胞收集及淬灭：
对小球藻(Chlorella sorokiniana)进行不同接种密度的培养，初始接种密度分别设置为1×104，1×105，1×106及1×107cells·mL-1，在细胞培养至OD560为1.5，每个接种密度的微藻分别取出5份藻液样品，每份100mL，4℃下3000rpm，离心3min，收集下层的细胞，用4mL代谢终止液在-40℃下淬灭5分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥4h获得冻干细胞；
所述代谢终止液为含有1500mg·L-1NaNO3，36mg·L-1CaCl2·2H2O，75mg·L-1MgSO4·7H2O和40mg·L-1K2HPO4·3H2O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；
(2)提取细胞内脂肪酸：
取步骤(1)获得的不同接种密度的冻干细胞各5份，每份15mg分别置于离心管中，每管加入0.75mL氯仿及0.3mL超纯水，100rpm震荡1h；再加入2mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；向残渣中加入2mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，再加入0.5mL 1M KCl水溶液，震荡，3000rpm，离心3min，弃水相，再加入1mL超纯水，震荡，3000rpm，离心3min，弃水相，30℃真空干燥得干物质；
所述脂肪提取液为体积百分含量为66.7％的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液含有质量百分比为0.1％的二丁基羟基甲苯；
(3)脂肪酸甲酯化：
将所述干物质溶于600μL质量百分比为14％的三氟化硼-甲醇溶液中，加入10μg十七烷酸做为内标，置于15mL密封管内，在100℃水浴20min，温度降至室温，加入600μl正己烷震荡萃取30s，4000rpm离心2min，得到正己烷相；取100μL正己烷相放入已编号的GC进样瓶；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对正己烷相中的脂肪酸甲酯进行定性和定量处理，条件如下：
色谱柱：DB-5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；
进样量：1μL；
分流比：10∶1；
进样口温度：280℃；
GC interface温度：270℃；
氦气流速：恒压，91KPa；
升温程序：70℃保持2min，以8℃·min-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；
电离电压：70eV；
源温：250℃；
扫描范围：50-800m/z；
扫描速度：2scan·s-1；
从而获得了脂肪酸甲酯混合物中的单个脂肪酸甲酯的含量；
(5)日产量
根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的日产量：
P＝∑Wi/Day/CV
其中P是微藻脂肪酸甲酯日产量，Wi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的重量，Day是步骤(1)所述从微藻接种到微藻收获的时间长度，CV是步骤(1)所述收获时微藻培养液的体积；
(6)十六烷值确定
根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的十六烷值：
SN＝∑(560×Pi)/MWi             a
IN∑(254×D×Pi)/MWi            b
CN＝46.3+5458/SN-0.225×IN      c
其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的分子量，D是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的双键数量。
如图1所示，随着接种密度的增加，小球藻在OD560为1.5时的油产量不断增加，尤其是接种密度为107cells·mL-1时，小球藻中的脂肪酸甲酯日产量比104cells·mL-1时提高了64.5％。由图3可以看出当接种密度达到105cells·mL-1后，小球藻所得生物柴油的十六烷值随着接种密度的增加不断提高，当接种密度达到107cells·mL-1后，其十六烷值比其他接种密度培养条件下起码提高了8.6％。
综上所述，接种密度对小球藻产油能力有显著的影响，且在本培养体系下，接种密度为1×104，1×105，1×106及1×107cells·mL-1的范围内，接种密度越高，小球藻的产油能力越强。
实施例2
一种评价微藻产油能力的方法，包括如下步骤：
(1)小球藻(Chlorella sorokiniana)细胞收集及淬灭：
对小球藻(Chlorella sorokiniana)进行不同接种密度的培养，初始接种密度分别设置为1×104，1×105，1×106及1×107cells·mL-1，在细胞培养至OD560为1.0，每个接种密度培养下的藻液取出4份样品，每份120mL，4℃下5000rpm，离心3min，收集下层的细胞，用3mL代谢终止液在-40℃下淬灭7分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥6h获得冻干细胞；
代谢终止液同实施例1；
(2)提取细胞内脂肪酸：
取步骤(1)获得的冻干细胞各4份，每份25mg分别置于离心管中，每管加入1.5mL氯仿及0.6mL超纯水，100rpm震荡1h；再加入4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；向残渣中加入4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，再加入1mL 1M KCl水溶液，震荡，4000rpm，离心5min，弃水相，再加入2mL超纯水，震荡，4000rpm，离心5min，弃水相，35℃真空干燥得干物质；
脂肪提取液同实施例1；
(3)脂肪酸甲酯化：
将所述干物质溶于1000μL质量百分比为14％的三氟化硼-甲醇溶液中，加入20μg十七烷酸做为内标，置于15mL密封管内，在100℃水浴30min，温度降至室温，加入1000μl正己烷震荡萃取30s，5000rpm离心2min，得到正己烷相；取150μL正己烷相放入已编号的GC进样瓶；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对正己烷相中的脂肪酸甲酯进行定性和定量处理，条件同实施例1，从而获得了脂肪酸甲酯混合物中的单个脂肪酸甲酯的含量；
(5)日产量
根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的日产量：
P＝∑Wi/Day/CV
其中P是微藻脂肪酸甲酯日产量，Wi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的重量，Day是步骤(1)所述从微藻接种到微藻收获的时间长度，CV是步骤(1)所述收获时微藻培养液的体积；
(6)十六烷值确定
根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的十六烷值：
SN＝∑(560×Pi)/MWi           a
IN∑(254×D×Pi)/MWi          b
CN＝46.3+5458/SN-0.225×IN    c
其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的分子量，D是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的双键数量。
通过实验证明，结果与实施例1相似。
实施例3
一种评价微藻产油能力的方法，包括如下步骤：
(1)小球藻(Chlorella sorokiniana)细胞收集及淬灭：
对小球藻(Chlorella sorokiniana)进行不同接种密度的培养，初始接种密度分别设置为1×104，1×105，1×106及1×107cells·mL-1，在细胞培养至OD560为0.5，每个接种密度培养下的藻液各取出3份样品，每份150mL，4℃下3000rpm，离心4min，收集下层的细胞，用5mL代谢终止液在-40℃下淬灭10分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥6h获得冻干细胞；
代谢终止液同实施例1；
(2)提取细胞内脂肪酸：
取步骤(1)获得的冻干细胞各3份，每份20mg分别置于离心管中，每管加入1mL氯仿及0.4mL超纯水，100rpm震荡1h；再加入3mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；向残渣中加入3mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，再加入0.75mL 1M KCl水溶液，震荡，3000rpm，离心3min，弃水相，再加入1.5mL超纯水，震荡，3000rpm，离心3min，弃水相，35℃真空干燥得干物质；
脂肪提取液同实施例1；
(3)脂肪酸甲酯化：
将所述干物质溶于600μL质量百分比为14％的三氟化硼-甲醇溶液中，加入20μg十七烷酸做为内标，置于15mL密封管内，在100℃水浴20min，温度降至室温，加入600μl正己烷震荡萃取30s，4000rpm离心2min，得到正己烷相；取200μL正己烷相放入已编号的GC进样瓶；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对正己烷相中的脂肪酸甲酯进行定性和定量处理，条件同实施例1，从而获得了脂肪酸甲酯混合物中的单个脂肪酸甲酯的含量；
(5)日产量
根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的日产量：
P＝∑Wi/Day/CV
其中P是微藻脂肪酸甲酯日产量，Wi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的重量，Day是步骤(1)所述从微藻接种到微藻收获的时间长度，CV是步骤(1)所述收获时微藻培养液的体积；
(6)十六烷值确定
根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的十六烷值：
SN＝∑(560×Pi)/MWi             a
IN∑(254×D×Pi)/MWi            b
CN＝46.3+5458/SN-0.225×IN      c
其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的分子量，D是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的双键数量。
通过实验证明，结果与实施例1相似。
本发明所采用的小球藻(Chlorella sorokiniana)只用于说明本发明，但并不用于限定本发明，实验证明，栅藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)及鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)也可以用于本发明。

Claims (2)

1.一种评价微藻产油能力的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)微藻细胞收集及淬灭：
取出已培养好的藻液样品3-5份，每份100-150mL，4℃下3000-5000rpm，离心3-4min，收集下层的细胞，用3-5mL代谢终止液，在-40℃下淬灭5-10分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；
所述代谢终止液为含有1500mg·L-1NaNO3，36mg·L-1CaCl2·2H2O，75mg·L-1MgSO4·7H2O和40mg·L-1K2HPO4·3H2O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；
(2)提取细胞内脂肪酸：
从3-5份步骤(1)获得的冻干细胞中各取15-25mg分别置于离心管中，每管加入0.75-1.5mL氯仿及0.3-0.6mL超纯水，100rpm震荡1h；再加入2-4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；向残渣中加入2-4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，向其中加入0.5-1mL 1M KCl水溶液，震荡，3000-4000rpm，离心3-5min，弃水相，再加入1-2mL超纯水，震荡，3000-4000rpm，离心3-5min，弃水相，30-35℃真空干燥得干物质；
所述脂肪提取液为质量百分比为0.1％的二丁基羟基甲苯的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液中氯仿的体积百分含量为66.7％；
(3)脂肪酸甲酯化：
将步骤(2)获得的3-5份干物质分别溶于3-5份600-1000μL质量百分比为14％的三氟化硼-甲醇溶液中，加入10-20μg十七烷酸做为内标，分别置于15mL密封管内，在100℃水浴20-30min，温度降至室温，加入500-1000μl正己烷震荡萃取30s，4000-5000rpm离心2min，得到正己烷相；取100-200μL正己烷相放入已编号的GC进样瓶；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对正己烷相中的脂肪酸甲酯进行定性和定量处理，条件如下：
色谱柱：DB-5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；
进样量：1μL；
分流比：10∶1；
进样口温度：280℃；
GC interface温度：270℃；
氦气流速：恒压，91KPa；
升温程序：70℃保持2min，以8℃·min-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；
电离电压：70eV；
源温：250℃；
扫描范围：50-800m/z；
扫描速度：2scan·s-1；
从而获得了脂肪酸甲酯混合物中的单个脂肪酸甲酯的含量；
(5)计算日产量
根据如下公式，计算藻类脂肪酸甲酯混合物的日产量：
P＝∑Wi/Day/CV
其中P是微藻脂肪酸甲酯日产量，Wi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的重量，Day是步骤(1)所述从微藻接种到微藻收获的时间长度，CV是步骤(1)所述收获时微藻培养液的体积；
(6)十六烷值确定
根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的十六烷值：
SN＝∑(560×Pi)/MWi             a
IN∑(254×D×Pi)/MWi            b
CN＝46.3+5458/SN-0.225×IN      c
其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的分子量，D是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的双键数量。
2.根据权利要求1所述的一种评价微藻产油能力的方法，其特征是所述微藻为小球藻(Chlorella sorokiniana)、栅藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)及鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)。
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