CN112540134A - 一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微藻细胞提取检测技术领域，更具体地，涉及海洋微藻脂肪酸的提取检测方法。一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，包括以下步骤：(1)(1)微藻的收集和破碎；(2)分离中性和极性脂质；(3)脂质脂肪酸分析；(4)GC‑MS分析。本发明的方法能够高效、便捷、准确的提取检测微藻脂肪酸，是研究脂肪酸组成及其代谢途径的关键一步。
Description
技术领域
本发明涉及微藻细胞提取检测技术领域，更具体地，涉及一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法
背景技术
有害赤潮藻的防治及资源化是海洋生态治理和可持续发展的一个重要领域。微藻中含有丰富的脂质，它产生许多不同种类的脂质，如甘油三酸酯和甘油二酸酯，磷脂和糖脂，烃等。其中，藻类中膜结构中的磷脂占据了脂质含量的主要部分，有害藻的治理领域已经有将微藻的膜结构组成变化来衡量微藻在应对外来应激下的生理响应的一个重要指标；有报道称藻类产生的藻毒素主要为膜脂类，因此，研究藻的脂类脂肪酸构成可以作为研究藻的生物化学治理方案的一个重要指标。此外，研究藻类脂肪酸代谢对于分析和开发藻类为主的生物质能源尤为重要，区分主要脂质脂肪酸含量(极性和中性)可以了解不同的脂质对催化途径转化燃料的效率的影响。
微藻的种类繁多，目前运用在微藻的脂肪酸提取检测方法比较少，大多集中在铜绿微囊藻、小球藻和莱茵衣藻等模式藻种上，一些检测方法又存在着低效、不便捷的问题。中国专利申请，公开号为：CN101532991B公开了一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量，该公开专利的技术方案存在着检测结果不准确的问题。
发明内容
本发明为克服上述现有技术中微藻脂肪酸的提取检测方法存在低效、不便捷，检测结果不准确的问题，提供一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，包括以下步骤：
(1)微藻的收集和破碎；
取已培养好的微藻，将样品放入液氮中冷冻，解冻后对样品进行离心，离心后收集细胞，然后利用细胞破碎仪对细胞进行超声处理，取体积比为3：2至2：1的氯仿、甲醇萃取脂质，然后在室温下离心，提取疏水相为脂质提取物，在脂质提取物中加入质量比大于等于0.01％的丁基化羟基甲苯；
(2)分离中性和极性脂质
将脂质提取物蒸发至干燥并用体积比为95:5至98:2的氯仿、甲醇洗涤后回收，将脂质提取物沉积在填充硅胶的固相萃取柱上，用体积比为95:5至98:2的氯仿、甲醇洗脱中性脂质，然后用甲醇洗脱极性脂质；
(3)脂质脂肪酸分析
收集后的极性脂质和中性脂质在干燥机中干燥，在每一组分中加入甲醇和三氟化硼混合溶液作为催化剂、十九烷酸甲酯，在90-100℃下酯交换8-10min，冷却后加入正己烷，将有机相的脂肪酸甲酯用蒸馏水定容到1.5-2.0mL，回收脂肪酸甲酯后收集到气相瓶中待测；
(4)利用GC-MS对脂肪酸甲酯进行检测。
优选地，在所述步骤(1)中，取出已培养好的微藻为对数增长末期的微藻。
优选地，在气相色谱中分析FAME，GC-MS检测条件为：
GC模块：
1)柱箱温度：70℃；
2)进样口温度：260℃；
3)进样方式：不分流；
4)进样时间：1min；
5)载气：He；
6)压力：61.5Pa；
7)总流量14.0mL/min；
8)柱流量：1mL/min；
9)进样体积：1微升；
10)柱箱升温程序：70℃保持1min，以8℃/min上升到170℃保持6分钟，以4℃/min上升到280℃保持5min；
MS模块：
1)溶剂延迟时间3min；
2)扫描范围45-500m/z；
3)扫描速度：0.2scan/s。
优选地，在所述步骤(1)中，氯仿与甲醇萃取脂质的体积比为2：1。
优选地，在所述步骤(3)中，甲醇的质量为催化剂质量的14％。
优选地，在所述步骤(2)中，氯仿与甲醇的体积比为98:2。
优选地，在所述步骤(1)中，利用细胞破碎仪对细胞进行超声处理的时间为25-30min；离心的转速为在10000-12000rpm，离心的时间为8-10min。
优选地，在所述步骤(1)中，在-20℃的条件下，在脂质提取物中加入丁基化羟基甲苯。
优选地，在所述步骤(2)中，所述填充硅胶的目数为63-230。
优选地，在所述步骤(2)中，填充硅胶需预先在450℃条件下加热以使6％的水蒸发。
优选地，在所述步骤(3)中，干燥时间为2-4h。
与现有技术相比，有益效果是：本发明的方法能够高效、便捷、准确的提取检测微藻脂肪酸，是研究脂肪酸组成及其代谢途径的关键一步。
附图说明
图1是本发明脂肪酸气相色谱分离图。
具体实施方式
附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。附图中描述位置关系仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制。
本发明实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”“长”“短”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体描述：
实施例1
一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，包括以下步骤：
(1)赤潮异弯藻的收集和破碎
取240毫升基于对数增长末期的赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)，将样品迅速用液氮冷冻(抑制脂肪酶活性)，解冻后离心收集细胞(6000rpm，4℃)，细胞鲜重为15-75mg，并在细胞破碎仪超声处理30分钟，取2mL氯仿：甲醇(2:1，v/v)萃取脂质，在12000rpm，室温下离心10分钟。提取疏水相为脂质提取物，将脂质提取物在-20℃下加入0.01％(w/w)的丁基化羟基甲苯(BHT)作为抗氧化剂。
(2)分离中性和极性脂质
将提取物蒸发至干燥并用1mL氯仿:甲醇(98:2，v/v)三次洗涤回收后，将脂质提取物沉积在填充硅胶(63-230目)的固相萃取柱上，硅胶需预先在450℃加热以使6％的水蒸发，用10mL氯仿:甲醇(98:2，v/v)中洗脱中性脂质；用20mL甲醇洗脱极性脂质。
(3)脂质脂肪酸分析
收集后的极性和中性脂质在冷冻真空干燥机中干燥2-4小时。为了防止不稳定的脂肪酸在缩醛磷脂的sn-2位置酸性降解，馏分不允许完全干燥。在每一组分中加入800ul的甲醇和三氟化硼混合溶液作为催化剂，其中甲醇质量为催化剂质量的14％，1uL的十九烷酸甲酯(1g/L)，在100℃下酯交换10分钟。冷却后加入800μL正己烷，将有机相的脂肪酸甲酯(FAME)用蒸馏水定容到1.5mL。回收脂肪酸甲酯后收集到气相瓶中待测。
(4)GC-MS分析
在气相色谱中分析FAME。GC-MS检测条件为：
GC模块：
1)柱箱温度：70℃；2)进样口温度：260℃；3)进样方式：不分流；4)进样时间：1min；5)载气：He；6)压力：61.5Pa；7)总流量14.0mL/min；8)柱流量：1mL/min；9)进样体积：1微升；10)柱箱升温程序：70℃保持1min，以8℃/min上升到170℃保持6分钟，以4℃/min上升到280℃保持5min。
MS模块：
1)溶剂延迟时间3min；2)扫描范围45-500m/z；3)扫描速度：0.2scan/s。
(5)实验结果
图1脂肪酸气相色谱分离图，下表鉴定出的37种脂肪酸组分
实施例2
与实施例1不同之处在于，步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)的具体参数设置，具体地在步骤(1)中，微藻的收集和破碎；取出已培养好的微藻，将样品放入液氮中冷冻，解冻后对样品进行离心，离心后收集细胞，然后利用细胞破碎仪对细胞进行超声处理，取体积比为3:2的氯仿以及甲醇萃取脂质，然后在室温下离心，提取疏水相为脂质提取物，将脂质提取物在-20℃下加入0.01％(w/w)的丁基化羟基甲苯(BHT)作为抗氧化剂。
在步骤(2)分离中性和极性脂质将脂质提取物蒸发至干燥并用体积比为95:5的氯仿、甲醇洗涤后回收，将脂质提取物沉积在填充硅胶的固相萃取柱上，用体积比为95:5的氯仿、甲醇洗脱中性脂质，然后用甲醇洗脱极性脂质。
在步骤(3)中，在90℃下酯交换8分钟，冷却后加入800μL正己烷，将有机相的脂肪酸甲酯(FAME)用蒸馏水定容到2mL，回收脂肪酸甲酯后收集到气相瓶中待测。
实施例3
与实施例1不同之处在于，步骤(1)、步骤(2)以及步骤(3)的具体参数设置，具体地在步骤(1)中，微藻的收集和破碎；取出已培养好的微藻，将样品放入液氮中冷冻，解冻后对样品进行离心，离心后收集细胞，然后利用细胞破碎仪对细胞进行超声处理，取体积比为5:3的氯仿以及甲醇萃取脂质，然后在室温下离心，提取疏水相为脂质提取物，将脂质提取物在-20℃下加入0.01％(w/w)的丁基化羟基甲苯(BHT)作为抗氧化剂。
在步骤(2)中，分离中性和极性脂质将脂质提取物蒸发至干燥并用体积比为96:4的氯仿、甲醇洗涤后回收，将脂质提取物沉积在填充硅胶的固相萃取柱上，用体积比为96:4的氯仿、甲醇洗脱中性脂质，然后用甲醇洗脱极性脂质。
在步骤(3)中，在95℃下酯交换9分钟，冷却后加入800μL正己烷，将有机相的脂肪酸甲酯(FAME)用蒸馏水定容到1.5mL，回收脂肪酸甲酯后收集到气相瓶中待测。
实施例4
与实施例3不同之处，在于在步骤(3)中，在95℃下酯交换9分钟，冷却后加入800μL正己烷，将有机相的脂肪酸甲酯(FAME)用蒸馏水定容到1.8mL，回收脂肪酸甲酯后收集到气相瓶中待测。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)微藻的收集和破碎；
取已培养好的微藻，将样品放入液氮中冷冻，解冻后对样品进行离心，离心后收集细胞，然后利用破碎仪对细胞进行超声处理，取体积比为3：2至2：1的氯仿、甲醇萃取脂质，然后在室温下离心，提取疏水相为脂质提取物，在脂质提取物中加入质量比大于等于0.01％的丁基化羟基甲苯；
(2)分离中性和极性脂质；
将脂质提取物蒸发至干燥并用体积比为95:5至98:2的氯仿、甲醇洗涤后回收，将脂质提取物沉积在填充硅胶的固相萃取柱上，用体积比为95:5至98:2的氯仿、甲醇洗脱中性脂质，然后用甲醇洗脱极性脂质；
(3)脂质脂肪酸分析；
收集后的极性脂质和中性脂质在干燥机中干燥，在每一组分中加入甲醇和三氟化硼混合溶液作为催化剂、十九烷酸甲酯，在90-100℃下酯交换8-10min，冷却后加入正己烷，将有机相的脂肪酸甲酯用蒸馏水定容到1.5-2.0mL，回收脂肪酸甲酯后收集到气相瓶中待测；
(4)利用GC-MS对脂肪酸甲酯进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，取出已培养好的微藻为对数增长末期的微藻。
3.根据权利要求1所述的一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，在气相色谱中分析FAME，GC-MS检测条件为：
GC模块：
1)柱箱温度：70℃；
2)进样口温度：260℃；
3)进样方式：不分流；
4)进样时间：1min；
5)载气：He；
6)压力：61.5Pa；
7)总流量14.0mL/min；
8)柱流量：1mL/min；
9)进样体积：1微升；
10)柱箱升温程序：70℃保持1min，以8℃/min上升到170℃保持6分钟，以4℃/min上升到280℃保持5min；
MS模块：
1)溶剂延迟时间3min；
2)扫描范围45-500m/z；
3)扫描速度：0.2scan/s。
4.根据权利要求1所述的一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，氯仿与甲醇萃取脂质的体积比为2：1。
5.根据权利要求1所述的一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，甲醇的质量为催化剂质量的14％。
6.根据权利要求1所述的一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，氯仿与甲醇的体积比为98:2。
7.根据权利要求1所述的一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，利用细胞破碎仪对细胞进行超声处理的时间为25-30min；离心的转速为在10000-12000rpm，离心的时间为8-10min。
8.根据权利要求1所述的一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，在-20℃的条件下，在脂质提取物中加入丁基化羟基甲苯。
9.根据权利要求1所述的一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述填充硅胶的目数为63-230。
10.根据权利要求1所述的一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，干燥时间为2-4h。
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|---|---|---|---|
| CN202011205759.5A CN112540134A (zh) | 2020-11-02 | 2020-11-02 | 一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024043739A1 (ko) * | 2022-08-26 | 2024-02-29 | 한국생명공학연구원 | 신규한 유트렙티엘라 속 균주 및 이를 이용한 지방산의 생산방법 |
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2020
- 2020-11-02 CN CN202011205759.5A patent/CN112540134A/zh active Pending
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